沟叶结缕草中一个新的耐盐基因ZmPDI及其植物表达载体和应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及盐生植物沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI及其植物表达载体和应用。

背景技术：

盐胁迫是影响植物生长发育、产量及品质的重要环境因子。因此，植物抗逆新品种选育及抗逆机理研究成为近些年的热点；杂交、辐射诱变等育种常规技术由于周期长、效率低，不足以满足目前抗逆育种的要求；为了加快抗逆育种进程，快速高效的基因工程技术逐渐受到社会的关注，优异抗逆基因的开发显得至关重要；已有研究表明，转高效抗逆调控基因的分子育种对提高植物抗逆性有积极作用。

蛋白二硫键异构酶PDI（protein disulfide isomerase）属硫氧还蛋白亚家族成员，是内质网中一种重要的折叠催化剂，它能催化蛋白形成二硫键（氧化活性）和催化错误配对二硫键的重排（异构酶活性），促进蛋白的正确折叠，同时具有分子伴侣作用，在缓解内质网应激过程中发挥重要作用；研究发现，水稻蛋白二硫键异构酶PDI的功能缺失加剧了内质网应激，表现出粉状胚乳的特征 (Han et al., 2012)；PDI基因沉默引起高温胁迫下水稻结实率的大幅度降低，耐热性显著下降 (刘光快 等，2013)；最近研究发现，拟南芥中一个PDI家族成员AtPDI6突变诱导了叶绿体中D1蛋白的合成，缓解了强光胁迫下的光抑制现象 (Wittenberg et al., 2014)；大麦中PDI同源基因HvPDIL5-1的功能缺失，提高了大麦抗黄花叶病的能力 (Yang et al., 2014)。然而，PDI 调控植物耐盐性的研究尚无报道。

本课题组前期通过酵母文库筛选从盐生植物沟叶结缕草中获得一个新的耐盐候选基因ZmPDI，异源转化酵母显著提高耐盐性，然而在植物中是否同样具有耐盐功能尚不清楚；因此，本发明的动因就是：将沟叶结缕草ZmPDI构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，获得具有耐盐特性的新种质；本专利对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

技术实现要素：

针对背景技术提出的培育耐盐新种质的问题，本发明的目的在于提供一个新的盐生植物沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI。

本发明的另一目的在于该耐盐基因ZmPDI的植物表达载体。

本发明所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，创制耐盐新种质，可用于植物品种改良。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI，该基因的序列为SEQ ID NO. 1；

含有本发明所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI的植物表达载体，由所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI与植物表达载体构成；

所述的含有沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI的植物表达载体，优选为BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切ZmPDI后插入到gateway入门载体pENTR1A后与pEarleyGate103表达载体质粒进行重组反应得到。

本发明所述的含有沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI的植物表达载体的构建方法，包括如下步骤。

（1）ZmPDI基因全长的克隆：设计引物ZmPDI-F: SEQ ID NO.2和ZmPDI-R: SEQ ID NO.3，以沟叶结缕草cDNA为模板，进行PCR反应，PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒测序获得全长序列SEQ ID NO. 1。

（2）pENTR1A-ZmPDI质粒构建：设计引物ZmPDI-BamHⅠ-F: SEQ ID NO.4和ZmPDI-EcoRⅤ-R: SEQ ID NO.5，以步骤（1）的阳性质粒为模板，用高保真酶进行PCR反应，获得在上游和下游分别引入BamHⅠ和EcoRⅤ酶切位点的ZmPDI基因，PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T Simple-ZmPDI；BamHⅠ和EcoRⅤ分别对阳性质粒pMD19-T Simple-ZmPDI和pENTR1A进行双酶切，取酶切后的ZmPDI片段与BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切的pENTR1A连接，连接产物转化TOP10感受态细胞；37 ℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pENTR1A-ZmPDI。

（3）提取的阳性质粒pENTR1A-ZmPDI经NsiⅠ单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID NO. 1，植物表达载体pEarleyGate103-ZmPDI构建成功。

本发明所述的沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI在创建耐盐新种质中的应用。

本发明所述的植物表达载体在创建耐盐新种质中的应用。

本发明的有益效果：

1．本发明提供的沟叶结缕草ZmPDI是一个新的耐盐基因，该基因可提高植物耐盐性；

2．本发明构建的沟叶结缕草ZmPDI植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐盐新种质，提高植物的耐盐性，可进行植物品种改良。

附图说明

图1 ZmPDI琼脂糖凝胶电泳分析

M：DNA Marker

1：ZmPDI；

2：pMD19-T Simple-ZmPDI 质粒BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切

3：pEarleyGate103-ZmPDI 表达载体电泳检测图

图2 pEarleyGate103- ZmPDI表达载体构建图

图3野生型（WT）与转基因拟南芥（ZmPDI）PCR鉴定

图4野生型与转基因拟南芥耐盐性评价

具体实施方式

实施例1 沟叶结缕草ZmPDI的克隆（图1）。

选用沟叶结缕草（Zoysia matrella）作为材料，选取健康的草皮块，置于装满石英砂的杯中，于1/2 Hongland营养液水培20天后，转入到含300mM NaCl的1/2 Hongland营养液中处理7d，取0.1g幼嫩叶片，参照Trizol RNA提取试剂盒（TaKaRa）说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒（TaKaRa）取1 µg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，设计引物扩增ZmPDI；

上游引物ZmPDI-F: 5′-ATGGCGATCCACTCCAGGGT-3′（SEQ ID NO.2）；

下游引物ZmPDI-R: 5′-GAGCTCATCCTTGACGGCCT-3′（SEQ ID NO.3）。

以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应，20 µL反应体系：2×RCR Mix 10 µL，ZmPDI-F、ZmPDI-R引物各1.0 µL（10 µmol·L^-1），cDNA模板 1µL，ddH₂O 7 µL；反应程序：95 ℃预变性4 min，然后94 ℃解链30 sec，60 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min 30 sec，反应30个循环，72 ℃延伸10 min；PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收纯化，用T₄DNA连接酶（TaKaRa）连接到pMD19-T Simple载体（TaKaRa），转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒经序列测定为SEQ ID NO.1。

实施例2 植物表达载体pEarleyGate103-ZmPDI的构建（图2）。

设计引物进行PCR反应，在目的基因ZmPDI的上游和下游分别引入酶切位点BamHⅠ和EcoRⅤ，PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切的ZmPDI片段与BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切的pENTR1A连接，转化，提取的阳性质粒经NsiⅠ单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应（Invitrogen），转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID NO.1；

上游引物ZmPDI-BamHⅠ-F：5′- GGATCCGGATGGCGATCCACTCCAGGGT -3′（SEQ ID NO.4）；

下游引物ZmPDI-EcoRⅤ-R：5′- GATATCTGAGCTCATCCTTGACGGCCT -3′（SEQ ID NO.5）。

①以实施例1中的阳性质粒为模板，用高保真酶（PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase，TaKaRa）进行PCR反应，25 µL反应体系：10×HS RCR Buffer 2.5 µL，ZmPDI-BamHⅠ-F、ZmPDI-EcoRⅤ-R引物各1.0 µL (10 µmol·L^-1)，dNTP mix 2.0 µL (2.5 mmol·L^-1)，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.2 µL，质粒模板 1 µL，ddH₂O 17.3 µL；反应程序：95 ℃预变性4 min，然后94 ℃解链30 sec，60 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min 30 sec，反应30个循环，72 ℃延伸10 min；PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN, USA）回收，连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T Simple-ZmPDI。

②取gateway入门载体pENTR1A (Invitrogen) 和pMD19-T Simple-ZmPDI用BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切，双酶切体系（40 µL）：10×K Buffer 4 µL，质粒pENTR1A或pMD19-T Simple-ZmPDI15 µL，BamHⅠ 2 µL，EcoRⅤ 2 µL，ddH₂O 17 µL；37 ℃反应2 h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收质粒pENTR1A大片段和pMD19-T Simple-ZmPDI小片段。用TaKaRa连接体系连接两个回收的产物，反应体系（5 µL）：Solution 2.5 µL，pENTR1A大片段0.5 µL，pMD19-T Simple-ZmPDI小片段2 µL；16 ℃连接2h，连接产物转化TOP10感受态细胞；37 ℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pENTR1A-ZmPDI。

③取质粒pENTR1A-ZmPDI用NsiⅠ单酶切，酶切体系（40 µL）：10×FD Buffer 4 µL，0.1% BSA 4 µL，质粒pENTR1A-ZmPDI 15 µL，NsiⅠ2 µL，ddH₂O 15 µL；37 ℃反应5 min，65℃反应15 min，用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收质粒pENTR1A-NsiⅠ片段；将回收的片段与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，反应体系（5 µL）：pENTR1A-ZmPDI大片段3 µL，pEarleyGate103质粒1 µL，LR Clonase^TMⅡ enzyme mix 1 µL；25 ℃反应1 h，加入1 µL Proteinase K，37 ℃反应10 min；重组产物转化TOP10感受态细胞，37 ℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pEarleyGate103-ZmPDI，电泳和测序验证为SEQ ID NO.1；植物表达载体pEarleyGate103-ZmPDI的构建成功。

实施例3 植物表达载体pEarleyGate103-ZmPDI遗传转化拟南芥及其耐盐性鉴定。

①农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化：从YEB（50 µg/mL 利福平）平板上挑取EHA105单菌落，接种于50 mL 含50 µg/mL 利福平的YEB液体培养基中，220 rpm，28℃培养至OD值0.6，而后冰浴菌液30 min，离心收集菌体，悬浮于2 mL预冷的的100mM CaCl₂（20%甘油）溶液中，200 µL/管分装，待用；取5 µL pEarleyGate103-ZmPDI载体质粒，加入100 µL 感受态细胞，冰浴30 min，液氮冷冻5 min，37℃ 5 min，加入800 µL YEB 液体培养基，28℃ 200 rpm预培养3 h，菌液涂板于YEB（50 µg/mL 利福平 + 50 µg/mL卡那霉素）固体培养基上，28℃ 暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。

②拟南芥花序浸染及种子采收：将阳性单克隆接到50 mL 的YEB（50 µg/mL 利福平 + 50 µg/mL卡那霉素）液体培养基中，培养36小时，5000 rpm离心20分钟，然后用转化液（5%蔗糖+500uL/L的Silwet L-77）剧烈悬浮沉淀至完全悬起；将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养24小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。

③种子消毒于播种：将种子放入5mL的离心管中，加入50%巴斯消毒液，添加0.1%的Triton X-100摇晃15分钟，然后在超净台中用无菌水洗5次，而后直接把种子倒在灭菌过的滤纸上，吹干种子（放置1小时），轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基（1/2MS + 20mg/L 草胺磷 + 25mg/L氨苄青霉素）筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿。

④耐盐评价：待抗性苗7～8片叶，提取拟南芥叶片DNA，PCR（引物ZmPDI-F和ZmPDI-R）鉴定（图3）；经PCR鉴定的T₁代转基因苗继续生长，采收T₂代种子。对野生型和T₂代抗性转基因拟南芥置于盐处理（0mM和200mM NaCl+MS培养基）生长14天，发现3个转ZmPDI基因拟南芥的生长明显优于野生型拟南芥（图4），耐盐性显著提高。

综上所述，本发明构建了含有耐盐基因的植物表达载体pEarleyGate103-ZmPDI，其中ZmPDI首次报道；所构建的载体可导入植物中，提高植物的耐盐特性。

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 沟叶结缕草中一个新的耐盐基因ZmPDI及其植物表达载体和应用

<160> 5

<210> 1

<211> 1530

<212> DNA

<213> 沟叶结缕草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 沟叶结缕草耐盐基因ZmPDI核苷酸序列

<400> 1

atggcgatccactccagggtctggatctcgctgctgctcgcgctcgccgtcgcgctctgc 60

gcgcgggcggaggaggccgcgggcgaggaggccgtgctcaccctcgacgtcgacaacttc 120

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caggagtacaagggccccagggaggctgagggaattgttgagtacctgaagaagcaggtc 420

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gagcttgttgttgacagcaaggacttcgatgttgctgctctggagaagtttattgatgct 720

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ccgttcaagaagtctgagcctattcctgagaccaacaatgagcctgttaaggtggttgtc 1140

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gagactgctggacagtcgacaacagagaaggtggctgagaaggtagccgagaaggtggaa 1500

gctaccactgaggccgtcaaggatgagctc 1530

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反应扩增ZmPDI基因用上游引物ZmPDI-F

<400> 2

atggcgatcc actccagggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反应扩增ZmPDI基因用下游引物 ZmPDI-R

<400> 3

gagctcatcc ttgacggcct 20

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反应扩增ZmPDI基因引入BamH I酶切位点用上游引物ZmPDI-BamH I-F

<400> 4

ggatccggat ggcgatccac tccagggt 28

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PCR反应扩增ZmPDI基因引入EcoR V酶切位点用下游引物ZmPDI-EcoR V-R

<400> 5

gatatctgag ctcatccttg acggcct 27