一种微卫星引物及用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱及方法与流程

文档序号:12412798阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种微卫星引物,其特征在于:其源于许氏平鲉,该引物(HJ5-132)的序列为:

F: CCCTCCTCTTCCATCTGT

R: ACCCTGAATGAGTTACCG。

2.一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱,其特征在于通过如下步骤实现:

1)选取能完全识别其种类的成熟的许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉各60个,剪取每个个体少量鱼鳍分别充分剪碎,,用干净的滤纸吸除水分,分别放入1.5mL离心管中,再加入400μl裂解液和10μl浓度为10mg/ml蛋白酶K,在振荡器上混匀,55℃水浴消化3~5 h,直到裂解液澄清为止;

2)分别在离心管中加入200μL饱和酚、200μL24:1的氯仿/异戊醇混合液抽提三次;

3)分别用600μL的无水乙醇沉淀DNA,经70%酒精洗涤,室温晾干后溶于50μL的超纯水中;

4)紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性,若完整性符合要求则;

5)以提取的三个物种基因组DNA为模板,进行PCR扩增反应:PCR反应体系的总体积为25μL,其中各种成分及终浓度分别为:DNA模板50 ng,Buffer 10 mM,引物各 0.2 mM,dNTP 0.2 mM,Mg2+ 2.0 mM,Taq DNA聚合酶 1U,用灭菌水补足25μL;所述的引物为权利要求1所述的序列;反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min,变性至延伸三个步骤重复30次,72℃延伸10min;

6)PCR反应结束后,取0.2μL扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,22 V稳压电泳4小时,电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中,用去离子水清洗两次,然后加入0.1%AgNO3溶液染色10min;染色后加入去离子水再次清洗一次,加入显色液显色,直至条带清晰为止,分别得到许氏平鲉、朝鲜平鲉、褐菖鲉的图谱,将三种图谱合并形成如附图所示的标准图谱。

3.根据权利要求2所述的一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱,其特征在于:所述的AgNO3溶液为比例为1g AgNO3 在1000mL dH2O 的溶液;所述的显色液为2%NaOH、0.4%甲醛、0.2%NaS2O3、dH2O 1000mL的混合溶液。

4.一种用于用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的方法,其特征在于包含如下步骤:

a)剪下少许待鉴鲉的鱼鳍,按照权利要求2步骤1)-4)的酚氯仿抽提法提取待鉴别鲉鱼个体的基因组DNA;

b)对提取的基因组DNA进行如权利要求2步骤5)的PCR扩增,得到扩增产物;

c)将扩增产物进行如权利要求2步骤6)的聚丙烯凝胶电泳及染色,得到对比图谱;

d)将对比图谱与权利要求2得到的标准图谱进行对比,若

在305bp~330bp区间内出现1~2条条带,则该DNA样品为许氏平鲉,出现1条条带说明该个体为纯合子,出现2条条带则说明该个体为杂合子;

若在286bp~295bp区间内出现1~2条条带,则该DNA样品为朝鲜平鲉,出现1条条带说明该个体为纯合子,出现2条条带则说明该个体为杂合子;

若在252bp~270bp区间内出现1~2条条带,则该DNA样品为褐菖鲉,出现1条条带说明该个体为纯合子,出现2条条带则说明该个体为杂合子。

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