黑木耳菌种的制作方法

本发明涉及一株黑木耳菌种。
背景技术：
：黑木耳[auriculariaauricula(lexhook)underw]隶属于担子菌门、层菌纲、木耳目、木耳科、木耳属，是世界上最早开始人工栽培的高等胶质担子菌，具有滋润强壮，清肺益气，补血活血等功效，深受人们的喜爱。浙江省丽水市是中国南方黑木耳的主栽地区，近年来的栽培规模稳定在1.5亿棒左右。随着黑木耳代料栽培规模的扩大，市场上对黑木耳级别的划分也产生了不同的标准，黑褐色、耳片小，单片、肉厚等特征越来越成为优质耳的评价标准。现有的本地传统栽培品种中，品种“916”片大、前期优质耳比例低；另一主栽品种“新科”耳形好、大小适中，但抗流耳能力较差，主要用于段木栽培。随着黑木耳产业的发展，后备品种不足的问题日益凸显，选育品质优、产量高、商品性佳、市场前景好的优良品种显得尤为重要。技术实现要素：本发明要解决现有生产中使用的黑木耳菌种存在着小孔出耳不易形成单片、产量低、品质差的技术问题，而提供一株品质优、产量高、商品性佳、市场前景好的黑木耳菌种。本发明的黑木耳菌种丽耳3号，属于黑木耳属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年7月5日，保藏编号为cgmccno.12525，分类命名为auriculariaauricula。丽耳3号菌种在pda培养基上菌丝体呈匍匐状，菌丝较浓密，边缘整齐、分支明显。子实体为单片单生，小孔出耳单片率达到90%以上，耳片大小适中，无根，呈碗状或耳状，干耳背面灰色，腹面黑色、有光泽，正反面颜色差别大，耳片边缘圆整、背面筋脉不明显。丽耳3号由黑木耳“新科”和“916”通过单双杂交育成，杂交菌株编号“x6”，筛选后进入栽培试验，菌株统一编号后为“a18”。栽培试验表明，该菌株具有早熟性好、子实体单生、背筋少的遗传表现型特征。该菌株改良了其亲本“新科”易流耳、产量低，以及另一亲本“916”出耳片成丛生状的缺点，融合了亲本“新科”早熟、耳形好和“916”高产、抗性好的优点，综合性状优良，定名为“丽耳3号”。本发明的黑木耳菌种经dna（issr）指纹多态性分析，其结果为：15条引物对待检菌株1~3均扩增出稳定的条带，多态性条带在7~19条，15条issr引物对3个黑木耳待检菌株1~3共扩增出201条稳定性条带，其中多态性条带达145条，多态性比率为72.14%。待检菌株黑木耳-丽耳3号与对照菌株黑木耳-“新科”相似性系数为62%，与对照菌株黑木耳“916”的相似性系数为47%，可推定待检菌株黑木耳-丽耳3号为不同于两个对照菌株的新品种。rapd指纹图谱分析结果表明：待检菌株黑木耳-丽耳3号与对照菌株黑木耳-“新科”相似性系数为74%，对照菌株黑木耳“916”相似性系数为56%，也可推定待检菌株黑木耳-丽耳3号为不同于两个对照菌株的新品种。应用菌株的拮抗反应对丽耳3号与其亲本菌株“新科”及“916”的差异的判断，检测结果表明，3个供试黑木耳菌株彼此之间交界处菌丝均呈现沟型，有明显拮抗反应，进一步推定待检菌株黑木耳-丽耳3号是不同于两个对照菌株的新品种。由于本发明所提供的丽耳3号菌种具有子实体单片单生，耳片大小适中，无根，呈碗状或耳状，干耳背面灰色，腹面黑色、有光泽，正反面颜色差别大，耳片边缘圆整、背面筋脉不明显等黑木耳的品质特点，且黑木耳出耳单片率达到90%以上，改良了“新科”抗性差和“916”耳型差的缺点，具有良好的推广前景。附图说明图1、引物h9、h23、p19、p23、p26对黑木耳菌株扩增的issr指纹图谱（从左到右菌株编号依次为1~3，marker为dl2000）；图2、引物h33、h26、h28、h25、p11对黑木耳菌株扩增的issr指纹图谱（从左到右菌株编号依次为1~3，marker为dl2000）；图3、引物h19、h20、p4、p27、p20对黑木耳菌株扩增的issr指纹图谱（从左到右菌株编号依次为1~3，marker为dl2000）；图4、黑木耳待检菌株issr多态性的聚类图；图5、引物r2、r4、r5、r13、r6对黑木耳菌株扩增的rapd指纹图谱（从左到右菌株编号依次为1~3，marker为dl2000）；图6、引物r16、r18、r20、r14、r7对黑木耳菌株扩增的rapd指纹图谱（从左到右菌株编号依次为1~3，marker为dl2000）；图7、引物r8、r9对黑木耳菌株扩增的rapd指纹图谱（从左到右菌株编号依次为1~3，marker为dl2000）；图8、黑木耳待检菌株rapd多态性的聚类图；图9、黑木耳丽耳3号(平板左)与“新科”(平板右)拮抗反应图；图10、黑木耳丽耳3号(平板左)与“916”(平板右)拮抗反应图；图11、黑木耳“新科”(平板左)与“916”(平板右)拮抗反应图。具体实施方式实施例1：选用当地主栽的黑木耳“新科”和“916”做杂交亲本，通过单单杂交和单双杂交技术获得f1代杂交菌株，经实验室菌丝生长观察和栽培试验，筛选出菌丝生长旺盛、子实体单生、产量高于亲本的菌株，收集子实体通过组织分离技术得到2代菌株；进一步开展栽培试验，筛选得到目标农艺性状较为稳定的优良菌株，组织分离后获得杂交菌株编号“x6”，筛选后进入栽培试验，该菌株早熟性好、子实体单生、背筋少，在品比栽培试验中高产、稳产性表现突出。后经单株筛选后获得稳定株系，该菌株改良了老品种“新科”易流耳、产量低和“916”丛生的缺点，融合了亲本新科早熟、耳形好和916高产、抗性好的优点，综合性状优良，定名为“丽耳3号”。依据中华人民共和国农业行业标准《ny/t1730-2009食用菌菌种真实性鉴定issr法》，对本菌株进行与其亲本的dna差异对比。送检材料：黑木耳菌株3个，其中待检菌株为丽耳3号，对照菌株2株分别为“新科”和“916”。检验方法：issr试验引物序列（表1）主要参考文献《中国黑木耳主要栽培菌株issr指纹分析及scar标记》、《黑龙江地区野生黑木耳菌种的issr指纹分析》、《黑木耳栽培菌株的issr分析》，由擎科生物技术有限公司合成。待检菌株菌丝体活化，培养，基因组dna提取，质量检测，pcr扩增及电泳检测均按照中华人民共和国农业行业标准《ny/t1730-2009食用菌菌种真实性鉴定issr法》。表1菌种真实性鉴定所用issr引物待检种类引物名称引物序列黑木耳h1gagagagagagagagat黑木耳h2gagagagagagagagac黑木耳h3agagagagagagagagg黑木耳h4agagagagagagagagc黑木耳h5gsgtgtgtgtgtgtgtgt黑木耳h6agagagagagagagagt黑木耳h7tctctctctctctctcc黑木耳h8agagagagagagagagya黑木耳h9agagagagagagagagyc黑木耳h10gagagagagagagagayc黑木耳h11gagagagagagagagayt黑木耳h12gagagagagagagagayg黑木耳h13gagagagagagagagaa黑木耳h14tgcacacacacacac黑木耳h15gtgacacacacacac黑木耳h16agtgtgtgtgtgtgt黑木耳h17ccagtggtggtggtg黑木耳h18ggagtggtggtggtg黑木耳h19agagagagagagagaggc黑木耳h20acacacacacacacaccg黑木耳h21acacacacacacacac黑木耳h22acacacacacacacacc黑木耳h23gtgacgactctctctct黑木耳h24cacacacacacacacag黑木耳h25acacacacacacacacg黑木耳h26agagagagagagagagyt黑木耳h27cacacacacacacacarc黑木耳h28acacacacacacacacya黑木耳h29cacacacacacacacaa黑木耳h30tgtgtgtgtgtgtgtgc黑木耳h31tgtgtgtgtgtgtgtgg黑木耳h32agcagcagcagcagcagc黑木耳h33gacagacagacagaca黑木耳p4ggatgcaacacacacacac黑木耳p5cgtgtgtgtgtgtgt黑木耳p11gagagagagagagagaac黑木耳p13tctctctctctctctccg黑木耳p15gtgtgtgtgtgtgtgtta黑木耳p16tgtgtgtgtgtgtgtgga黑木耳p19acacacacacacacacct黑木耳p20acacacacacacacacctg黑木耳p21agcagcagcagcagcagcg黑木耳p22aagaagaagaagaagaagc黑木耳p23gagagagagagagagact黑木耳p24cacgagagagagagaga黑木耳p25gagagagagagagagacc黑木耳p26caccacacacacacaca黑木耳p27gtatgtatgtatgtatgg黑木耳p28gtatgtatgtatgtatgc结果与分析：黑木耳菌株的issr指纹图谱：利用49条引物对3个供试黑木耳菌种进行了issr扩增，从中选取能够扩增出稳定特异条带的15条引物，分别为h9、h19、h20、h23、h25、h26、h28、h33、p4、p11、p19、p20、p23、p26、p27。15条引物对待检菌株1~3均扩增出稳定的条带，多态性条带在7~19条，15条issr引物对3个黑木耳待检菌株1~3共扩增出201条稳定性条带，其中多态性条带达145条，多态性比率为72.14%(图1~图3)。聚类分析：对扩增产物进行分析，将试验出现的稳定性条带进行统计，有条带的记为1，无条带记为0，用ntsys-pc2.0软件进行聚类分析。检测结论。issr分析结果表明：待检菌株黑木耳-丽耳3号与对照菌株黑木耳-新科相似性系数为62%，与对照菌株黑木耳916的相似性系数为47%，推测待检菌株黑木耳-丽耳3号为不同于两个对照菌株的新品种（图4）。丽耳3号在不同海拔的环境适应性及产量结果表明，具有一定的丰产特征。参试菌株：浙耳608、916、丽耳2号、新科、842、早黑1号、862、丽耳3号。试验地点：庆元、淳安、丽水百果园、莲都区、武义。试验安排：菌种统一制作，各试验点按照当地生产管理方式进行栽培管理。试验结果：试验发现，丽耳3号菌丝生长速度较快，菌丝菌棒时间较其它菌株短2天以上，菌株长势较好。年试验菌株发菌速度统计单位：mm/d菌株庆元丽水百果园莲都区淳安武义平均发菌速度浙耳6083.553.963.703.273.503.609163.573.964.113.543.303.70丽耳2号2.883.343.503.083.003.16新科3.163.643.573.203.003.318423.313.933.943.383.403.59早黑1号3.054.164.813.373.503.788623.224.124.073.203.703.66丽耳3号3.274.483.593.574.003.78栽培发现，丽耳3号耳芽形成时间早于其它菌株，比916和新科提早5天以上；较强的耳芽形成能力可促使耳芽及早封住刺孔口，降低杂菌侵染几率，有效降低排场后菌棒污染率。产量：栽培试验结果表明，丽耳3号的产量高于其它菌株。经方差分析和产量统计学分析，各试验点处理间、地点、品种、品种与地点均具有极显著的差异；丽耳3号与菌株842无显著性产量差异，但与其它6个菌株间存在显著性产量差异。试验菌株产量结果统计单位：g/棒菌株庆元丽水百果园莲都区淳安武义平均单产浙耳60867.8648.0739.654.4463.0054.5991671.0947.3740.256.1272.0057.35丽耳2号33.0264.6026.453.8730.0041.57新科63.549.1732.853.1173.0054.3184256.481.3742.657.7866.0060.83早黑1号61.171.4137.255.5361.0045.0486264.356.4633.554.4458.0053.34丽耳3号78.456.0447.958.4074.0062.94试验菌株产量方差分析表变异来源自由度平方和均方ff0.05f0.01区组256.8428.421.573.114.89处理间3925466.55652.9935.98**1.561.87地点412502.923125.73172.24**2.493.57品种74816.44688.0637.91**2.132.88地点×品种288147.19290.9716.03**1.621.98误差781415.5118.15总变异11926938.9注：数据采用stst方差分析软件分析，统计分析时，小数点后取一位。试验菌株产量统计学分析品种平均产量（g/棒）5%差异1%差异丽耳3号63.8aa84262.0aab91658.8bbc早黑1号58.1bcbcd新科55.2cdcd浙耳60855.2cdcd86253.9dd丽耳2号41.6ee丽耳3号在不同海拔表现出了较强的环境适应性，虽遭遇2015年秋冬季高温多雨的恶劣天气，仍表现出优良的菌株特性；从接种菌棒到第一次耳片采收，丽耳3号约需78-89天，菌株早熟性好；耳芽形成快，年内可采耳2-3潮，秋冬耳在总产量中占比80%以上，优质耳比例高；耳片单生、商品性好；出耳早，年后采收1-2潮后即可结束栽培过程，有效缩短了生产周期，节省了时间和管理成本，又可避过春季的多雨天气，整体上大幅提高了产品品质和经济效益。实施例2：以rapd法进行对本菌株与其亲本的dna差异对比。检测依据：依据中华人民共和国农业行业标准《ny/t1743-2009食用菌菌种真实性鉴定rapd法》进行菌种dna的提取和最优引物的确定。送检材料：黑木耳菌株3个，其中待检菌株为丽耳3号，对照菌株2株分别为“新科”和“916”。检验方法：实验引物序列（表6）依据《ny/t1743-2009食用菌菌种真实性鉴定rapd法》，由擎科生物技术有限公司合成。待检菌株菌丝体活化，培养，基因组dna提取，质量检测，pcr扩增及电泳检测均按照中华人民共和国农业行业标准《ny/t1743-2009食用菌菌种真实性鉴定rapd法》。表6.菌种真实性鉴定所用rapd引物待检种类引物名称引物序列黑木耳r1aatcgggctg黑木耳r2acttcgccac黑木耳r3aggggtcttg黑木耳r4agtcagccac黑木耳r5caatcgccgt黑木耳r6caggcccttc黑木耳r7cccatatccc黑木耳r8ccgatatccc黑木耳r9ccgcatctac黑木耳r10gaaacgggtg黑木耳r11gaccgcttgt黑木耳r12gacggatcag黑木耳r13gggaattcgg黑木耳r14gggtaacgcc黑木耳r15ggtgatcagg黑木耳r16gtgacgtagg黑木耳r17gtgaggcgtc黑木耳r18gtgatcgcag黑木耳r19gttgccagcc黑木耳r20tcggcgatag黑木耳r21tgagtgggtg黑木耳r22tgccgagctg结果与分析：黑木耳菌株的rapd指纹图谱。利用22条引物对3个黑木耳菌种进行了rapd扩增，从中选取能够扩增出稳定特异条带的12条引物，分别为r2、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r13、r14、r16、r18、r20。12条引物对黑木耳菌株1~3均扩增出稳定的条带，多态性条带在6~16条，12条rapd引物对3个黑木耳菌株1~3共扩增出133条稳定性条带，其中多态性条带达57条，多态性比率为57.14%(图5~图7)。聚类分析：对扩增产物进行分析，将试验出现的稳定性条带进行统计，有条带的记为1，无条带记为0，用ntsys-pc2.0软件进行聚类分析。检测结论：rapd指纹图谱分析结果表明：待检菌株黑木耳-丽耳3号与对照菌株黑木耳-新科相似性系数为74%，对照菌株黑木耳916相似性系数为56%，推测待检菌株黑木耳-丽耳3号不同于两个对照菌株的新品种（图8）。实施例3：以拮抗反应法进行对本菌株与其亲本的dna差异对比。检测依据：依据中华人民共和国农业行业标准《ny/t1845-2010食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应》进行待检样品的接种、培养和观察。送检材料：黑木耳菌株3个，其中待检菌株为丽耳3号，对照菌株2株分别为“新科”和“916”。检验方法：严格按照无菌操作，用φ5mm打孔器分别打取活化后适龄菌种菌落边缘作接种块，两接种块间隔30mm，分别置于距pda平板中心点的15mm处，菌丝朝上。在25℃的温度下，通风、避光培养至接种块菌丝接触后，再在自然光下培养5d~7d。结果与分析：在灯下或自然光下，观察培养物表面两菌株交界处菌丝反应，结果如图所示(图9-图11)。检测结论：检测结果表明，3个供试黑木耳菌株彼此之间交界处菌丝均呈现沟型，有明显拮抗反应，推测待检菌株黑木耳-丽耳3号不同于两个对照菌株的新品种。当前第1页12