本发明属于生物技术领域，属于从猪鼻骨中提取硫酸软骨素的方法。
背景技术：
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate)是一种酸性粘多糖，广泛存在于哺乳动物的软骨、喉骨、鼻骨和气管中。硫酸软骨素是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结而成的双糖聚合物，它含有50～70 个双糖基本结构,分子量为10000～50000。按其化学组成和结构,可分为CSA、C、D、E、F、H 等多种同分异构体,药用硫酸软骨素是从动物软骨中提取的,主要是A、C 及各种硫酸软骨素的混合物。CSA 和CSC 均由D2氨基葡萄糖醛和N2乙酰2D2氨基半乳糖组成,只是硫酸基团位置不同。
硫酸软骨素通常与蛋白质结合成糖蛋白的形式存在，当其水解时发生消去反应，连接硫酸软骨素与蛋白质中丝氨酸羟基的苷键断裂，可以得到游离态的硫酸软骨素。硫酸软骨素为白色或微黄色粉末,具有吸湿性，易溶于水而成粘度较大的溶液，难溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有机溶剂，并且遇热不稳定，乙酰基易发生水解脱落，在酸性条件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎症及抗肿瘤等生理活性，临床上可用于预防动脉粥状硬化、提高机体免疫力、治疗风湿病和肾炎及由链霉素引起的听觉障碍。硫酸软骨素与铜等金属离子结合可用于治疗皮肤病，与硝酸铋或氢氧化铝反应得到的络合物可用于治疗消化性溃疡，与苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉剂。作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。在化妆品中添加硫酸软骨素，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水分和改善发质。
随着硫酸软骨素生物活性不断被揭示和其应用领域的不断扩展,有关硫酸软骨素的提取、纯化和分离技术已取得了一定的研究成果,但应用于生产实际还有许多需要改进和完善之处。目前，硫酸软骨素生产厂家主要采用的方法成本高，产率和纯度低。所以，本公司开发了复合酶法从猪鼻骨中提取硫酸软骨素，以降低成本，提高效益。
技术实现要素：
本发明提供了一种全新的方法（复合酶法）从猪鼻骨中提取硫酸软骨素，能够有效地降低成本，并提高产品的产率和纯度。
为此，本发明通过以下技术方案予以实现：
1、复合酶酶解
将干燥的猪鼻骨粉碎至粉末，加入其4倍重量的水。加热至80℃，保温4～6小时，然后降温。降温至50~60℃时加入原料量1%~7%的复合酶（蛋白酶，淀粉酶，果胶酶的质量比为47∶31∶22），保温搅拌酶解12～15 小时。
2、盐解
用盐酸将复合酶水解液的pH调到6.2～7.5，按复合酶水解液体积的10%~14%加入浓度为2%的氯化钠溶液，搅拌溶解后，升温到85℃，保温2小时，然后降温至室温，用双层纱布过滤；留下滤液，测量质量待用。
3、二次酶解
用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.0～9.0，按滤液与胰蛋白酶1000∶1.3的质量比加入胰蛋白酶，于40～50℃酶解1.5小时后，再按1000∶1.8的质量比加入胃蛋白酶，40～50℃酶解2小时。
4、超滤膜纯化
用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液，设定溶液的透过速度为50L/h·m²~80 L/ h·m²，同时加场强为1600V/m~1900V/m的直流电场（方向与溶液流动的方向一致）和频率为40000Hz~50000Hz的超声波场（功率为270瓦），弃掉滤液，所得到的糊状物即为较高纯度的硫酸软骨素。
5、脱水
最后，用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥，即可。
本发明的有益效果是：采用复合酶法分离猪鼻骨中的硫酸软骨素，并且增加了纯化过程，有效地降低了生产成本，并且提高了产品的产率和纯度。
四、具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例一：
1、复合酶酶解
称取100千克干燥的猪鼻骨粉碎至粉末，加入其400L的水。加热至80℃，保温5.5小时，然后降温。降温至59℃时加入原料量6%的复合酶（蛋白酶，淀粉酶，果胶酶的质量比为47∶31∶22），保温搅拌酶解14 小时。
2、盐解
用盐酸将复合酶水解液的pH调到7.3，按复合酶水解液体积的13%加入浓度为2%的氯化钠溶液，搅拌溶解后，升温到85℃，保温90min，然后降温至室温，用双层纱布过滤；留下滤液，测量质量待用。
3、二次酶解
用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.9，按滤液与胰蛋白酶1000∶1.3的质量比加入胰蛋白酶，于44℃酶解1.5小时后，再按1000∶1.8的质量比加入胃蛋白酶，于48℃酶解2小时。
4、超滤膜纯化
用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液，设定溶液的透过速度为70L/h·m²，同时加场强为1850V/m的直流电场（方向与溶液流动的方向一致）和频率为48000Hz的超声波场（功率为270瓦），弃掉滤液，所得到的糊状物即为较高纯度的硫酸软骨素。
5、脱水
最后，用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥，即可。
6、对照
称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用传统工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量25146L,产出硫酸软骨素20.36kg,纯度74.26%，产率48.24%。称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用稀碱—酶解结合法工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量0L,产出硫酸软骨素27.29kg,纯度91.05%，产率79.28%。通过对比发现：传统工艺明显地成本高，效益低。通过对照发现：传统工艺明显地成本高，效益低。
实施例二：
1、复合酶酶解
称取100千克干燥的猪鼻骨粉碎至粉末，加入其400L的水。加热至80℃，保温5小时，然后降温。降温至53℃时加入原料量2%的复合酶（蛋白酶，淀粉酶，果胶酶的质量比为47∶31∶22），保温搅拌酶解13 小时。
2、盐解
用盐酸将复合酶水解液的pH调到6.3，按复合酶水解液体积的14%加入浓度为2%的氯化钠溶液，搅拌溶解后，升温到85℃，保温2小时，然后降温至室温，用双层纱布过滤；留下滤液，测量质量待用。
3、二次酶解
用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.1，按滤液与胰蛋白酶1000∶1.3的质量比加入胰蛋白酶，于45℃酶解1.5小时后，再按1000∶1.8的质量比加入胃蛋白酶，于46℃酶解2小时。
4、超滤膜纯化
用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液，设定溶液的透过速度为55L/h·m²，同时加场强为1680V/m的直流电场（方向与溶液流动的方向一致）和频率为42000Hz的超声波场（功率为270瓦），弃掉滤液，所得到的糊状物即为较高纯度的硫酸软骨素。
5、脱水
最后，用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥，即可。
6、对照
称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用传统工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量25146L,产出硫酸软骨素20.36kg,纯度74.26%，产率48.24%。称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用稀碱—酶解结合法工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量0L,产出硫酸软骨素26.81kg,纯度90.94%，产率77.80%。通过对比发现：传统工艺明显地成本高，效益低。
实施例三：
1、复合酶酶解
称取100千克干燥的猪鼻骨粉碎至粉末，加入其400L的水。加热至80℃，保温5小时，然后降温。降温至56℃时加入原料量4%的复合酶（蛋白酶，淀粉酶，果胶酶的质量比为47∶31∶22），保温搅拌酶解12 小时。
2、盐解
用盐酸将复合酶水解液的pH调到6.8，按复合酶水解液体积的12%加入浓度为2%的氯化钠溶液，搅拌溶解后，升温到85℃，保温2小时，然后降温至室温，用双层纱布过滤；留下滤液，测量质量待用。
3、二次酶解
用浓度为1%的氢氧化钠溶液将滤液调节pH到8.4，按滤液与胰蛋白酶1000∶1.3的质量比加入胰蛋白酶，于46℃酶解1.5小时后，再按1000∶1.8的质量比加入胃蛋白酶，于44℃酶解2小时。
4、超滤膜纯化
用50nm孔径的管型聚丙烯腈超滤膜过滤上步得到的溶液，设定溶液的透过速度为67L/h·m²，同时加场强为1740V/m的直流电场（方向与溶液流动的方向一致）和频率为44000Hz的超声波场（功率为270瓦），弃掉滤液，所得到的糊状物即为较高纯度的硫酸软骨素。
5、脱水
最后，用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥，即可。
6、对照
称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用传统工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量25146L,产出硫酸软骨素20.36kg,纯度74.26%，产率48.24%。称取100千克同一批次的猪鼻骨，采用稀碱—酶解结合法工艺提取其中的硫酸软骨素,乙醇用量0L,产出硫酸软骨素28.41kg,纯度97.31%，产率88.21%。通过对比发现：传统工艺明显地成本高，效益低。