一种即时检测阴道加德纳菌的荧光恒温检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种即时检测阴道加德纳菌的荧光恒温检测试剂盒，特别涉及一种不依赖于高能量分子的恒温扩增技术。
背景技术：
：阴道加德纳氏菌（gv）是引起细菌性阴道病（bv）的病原菌。其致病与厌氧菌共同作用有关，除引起bv以外，gv还可致早产、产褥热、新生儿败血症、绒毛膜羊膜炎、产后败血症、脓毒血症、尿路感染、肾周脓肿及膀胱炎等。gv是一种大小为1.5～2.5×0.5μm，多形性，无荚膜，无鞭毛，革兰氏染色不稳定的细菌。在普通琼脂培养基上不生长，在血琼脂培养基、巧克力培养基上生长，但不需x因子、v因子、辅酶因子。兼性厌氧，在足够co2的环境中，容易生长。生长最适温度为35～37℃，ph为6.0～6.5。几十年来，国内外学者研究表明，该菌还可以引起宫颈炎，不洁流产，术后感染，尿道感染等多种疾病，是新认识的一种性传播疾病的病原菌和条件致病菌。阴道加德纳菌是引起细菌性阴道病和尿道炎的重要病原体，在bv的微生物菌群中处于优势地位，含量明显高于其他非正常菌群，已被确认为bv的重要病原体。在bv患者与健康人群中，加德纳菌的检出率存在显著差异，加德纳菌抗原检测可作为bv的一项重要检测指标，结合临床表现进行bv诊断。同时临床研究表明，加德纳菌感染还与不孕不育、异常妊娠高度相关，可引起输卵管妊娠、胎膜早破和新生儿早产等不良妊娠结局，不孕和不良怀孕史患者中30~40%可检出加德纳菌，配偶之间互感率高达90%。检测阴道加德纳菌对于妇产科疾病以及不孕不育的预防和诊断有着较为重大的意义。基于病原体dna直接进行检测，相比amsel等传统方法大大提高灵敏度，可以极大提升阳性检出率。阴道加德纳菌检测最常用的是生化检测和免疫荧光检测技术，但涂片镜检测等人工操作多，人为主观因素占重要部分，免疫方法检测多采用间接法，受样本采集方法影响大，灵敏度不及核酸检测方法。阴道加德纳菌的dna检测目前在国内还没有商业推广用的试剂盒，国外最常见就是bd公司的affirmtm阴道微生物检测系统。本发明的恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下（如37℃）进行核酸的扩增，与生化检测和免疫荧光检测技术相比，有着更少人为干预，不需要人为判断，能够直接检测病原体，灵敏度高等特点。与传统的pcr技术相比，不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。另外，恒温扩增体系有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远远高于传统pcr技术，所用时间更短，最短可以在5min内实现。最后，相对于目前其他恒温扩增技术平台相比，本发明所用的重组酶依赖扩增技术平台是新一代核酸检测的利器，在检测的时效性，便捷性和技术参数等多个方面都优于其它恒温扩增技术平台，通过试剂的有效匹配，甚至可以在人体腋下进行扩增反应。在该技术平台上，除了可以开发基于小型便携式设备用于医疗检测机构如医院急诊科、妇产科、手术室；社区服务中心和基层医疗机构；检验检疫疾病防控机构的分子诊断产品，还可以开发出适合家庭使用的分子诊断产品，使我国不同区域即便存在经济条件参差不齐的情况下，也可以展开全国性病毒性疾病、肿瘤和遗传性疾病的定期和即时普查。这是一个非常巨大的潜在市场，其经济价值和社会效益不可估量。当前我们已经开发适用于医疗机构和家庭使用的hiv检测产品和宫颈癌hpv检测产品。随着平台的不断成熟，可进一步拓展到食品安全、检验检疫、防恐等多个领域。本发明阴道加德纳菌即时检测试剂盒将恒温扩增技术应用到阴道阴道加德纳菌感染的检测上，缩短了反应时间，降低了体系对反应条件的要求，大大地提高了检测的效率，也不需要人为主观判读结果，同时检测结果不受混合其他病原体感染的干扰，因此能更准确的提示阴道加德纳菌感染，非常有利于临床的即时诊断和对症治疗。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种即时检测阴道加德纳菌的荧光恒温检测方法及其试剂盒，包括反应液，启动液，反应酶系，阴道加德纳菌特异性引物及探针。阴道加德纳菌恒温检测方法及其试剂盒反应液的具体组分如下：品名浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）tris-hcl80mmkcl40mmnacl10mm二硫苏糖醇5mm甜菜碱1m海藻糖3.5%peg3.5%bsa0.1mg/ml作为上述反应液的进一步改进，tris-hcl的ph为7.0～9.0，优选ph为8.3。阴道加德纳菌恒温检测方法及其试剂盒启动液的具体组分如下：品名摩尔浓度氯化镁5mm~20mm作为上述启动液的进一步改进，氯化镁的优选浓度为10mm。阴道加德纳菌恒温检测方法及其试剂盒反应酶系的具体组分如下：品名浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul单链结合蛋白262ng/ul重组酶（e.colirect）360ng/ul上游引物200nm下游引物200nm作为上述反应酶系的进一步改进，重组酶选自e.colirect蛋白。阴道加德纳菌恒温检测方法及其试剂盒特异性引物及探针序列如下：上游引物1ataggctttttactggtgtatcactggtaagg（seqidno：1）下游引物1cactcttctcaaccccgtcagaggctgaacagt（seqidno：2）荧光探针1ggaccgatgaaggacgtgacgggctgcga(fam-dt)a(dspacer)(bhq-dt)tgcctcggggagctg（seqidno：3）作为本发明方法的进一步改进，恒温扩增的温度为35～42℃，优选扩增温度为40℃。本发明的有益效果：本发明的恒温扩增体系，不依赖于atp、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在15min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。本发明的恒温扩增体系使用荧光实时定量技术，应用范围更广，适用于市面上大多数荧光定量扩增仪。本发明检测阴道加德纳菌。对比常规检测的培养方法和镜检方法，时间更短，灵敏度高受培养条件限制少，人为误操作几率低。附图说明图1为最适反应温度下荧光扩展曲线结果，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。图2为非最适反应温度下荧光扩展曲线结果，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。图3为非最适反应温度下荧光扩展曲线结果，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。图4为重复性特异性实验荧光扩展曲线结果，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。图5为实验荧光扩展曲线结果，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。图6为灵敏度实验荧光扩展曲线结果，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。具体实施方式一种即时检测阴道加德纳菌的荧光恒温检测方法及其试剂盒，采用了一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。试剂盒成分包括反应液，启动液，反应酶系，阴道加德纳菌特异性引物及探针，各成分的具体组分如下：阴道加德纳菌恒温检测方法及其试剂盒反应液的具体组分如下：品名浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）tris-hcl（ph8.3）80mmkcl40mmnacl10mm二硫苏糖醇5mm甜菜碱1m海藻糖3.5%peg3.5%bsa0.1mg/ml阴道加德纳菌恒温检测方法及其试剂盒启动液的具体组分如下：品名摩尔浓度氯化镁10mm阴道加德纳菌恒温检测方法及其试剂盒反应酶系的具体组分如下：品名浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul单链结合蛋白262ng/ul重组酶（e.colirect）360ng/ul上游引物200nm下游引物200nm阴道加德纳菌恒温检测方法及其试剂盒特异性引物及探针序列如下：上游引物1ataggctttttactggtgtatcactggtaagg（seqidno：1）下游引物1cactcttctcaaccccgtcagaggctgaacagt（seqidno：2）荧光探针1ggaccgatgaaggacgtgacgggctgcga(fam-dt)a(dspacer)(bhq-dt)tgcctcggggagctg（seqidno：3）下面结合具体的实验，进一步说明阴道加德纳菌恒温检测方法及其试剂盒的优势，但并非限制本发明。实验样本来源：以细菌性阴道炎患者中分离的阴道加德纳菌经提取得到的核酸溶液作为样本；以外购金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、阴道毛滴虫、白色念珠菌经提取得到的核酸溶液作为特异性实验的样本；以正常人阴道分泌物提取物为阴性对照样本。实施例1（阴道加德纳菌的检测）：取2个200ul反应管，分别标记为反应管1~2。在反应管1~2中分别加入20ul反应液、5ul反应酶系；在反应管1、2中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）。在反应管1中加入阴道加德纳菌样本2ul，反应管2加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：40℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光。实施例2（非最优扩增温度条件的检测）：同实施例1，不同之处在于上机条件改为：35℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图2。实施例3（非最优扩增温度条件的检测）：同实施例1，不同处在于上机条件改为：42℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图3。实施例4（特异性实验）：按照实施例1配制体系8管，分别标记1~8反应管。在1~8反应管的体系中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）；在1~8号反应管中按顺序分别加入阴道加德纳菌、黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、阴道毛滴虫、白色念珠菌样本2ul；各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：40℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图4。实施例5（阴道加德纳菌重复性实验）：按实施例1配制体系10管，分别标记反应管1~10。在反应管1~10中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）。在反应管1~5中均加阴道加德纳菌样本2ul，在反应管6~10中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：40℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图5。实施例6（阴道加德纳菌灵敏度实验）按实施例1配制体系8管，分别标记反应管1~8。在反应管1~10中加入上游引物1（200nm）、下游引物1（200nm）、荧光探针1（150nm）。在反应管1~7中加入不同浓度的阴道加德纳菌样本2ul，在反应管8中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。选择荧光定量pcr仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：40℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图6。结论：1.从图1的结果可以看出，阴道加德纳氏菌反应管有“s”型扩增曲线，阴道对照管没有扩增曲线，说明本发明试剂盒的阴阳性恒温扩增效果好。2.从图2、3的结果可以看出，即使不是在最适温度下进行扩增反应，仍然得到稳定的阳性结果，说明本发明试剂盒有较宽的反应温度范围，非最优扩增温度下的样本出峰时间和信号值影响不大，试剂的容错率高、稳定性强，可以适用于温度不能精确控制的仪器或反应装置，使试剂盒的使用范围更为广泛。3.从图4的结果可以看出，非本试剂盒检测范围内的其他阴道内微生物（黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株、阴道毛滴虫、白色念珠）没有曲线增长，检测结果阴性，而阳性对照（阴道加德纳）扩增结果阳性，说明试剂盒特异性较强。4.从图5的结果可以看出，阴道加德纳菌进行了重复实验，均得到相应的“s”型扩增曲线，扩增曲线出峰时间相差不超过1min，荧光信号波动范围小，说明本试剂盒的重复性好。5.从图6的结果可以看出，阴道加德纳菌进行了灵敏度实验，均得到相应的“s”型扩增曲线，样本浓度从1×105~1×102cfu/ml，在1×102cfu/ml下均为阳性，即使样本在极浓度下本试剂盒仍能稳定检测出阳性，说明本试剂盒的灵敏度高，适应临床上各种发病期的样本。。综上，本发明试剂盒的扩增效果好，特异性强，容错率高，稳定性强，灵敏度高。sequencelisting<110>广州和实生物技术有限公司<120>一种即时检测阴道加德纳菌的荧光恒温检测试剂盒<130>2016<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列<400>1ataggctttttactggtgtatcactggtaagg32<210>2<211>33<212>dna<213>人工序列<400>2cactcttctcaaccccgtcagaggctgaacagt33<210>3<211>45<212>dna<213>人工序列<400>3ggaccgatgaaggacgtgacgggctgcgaatgcctcggggagctg45当前第1页12