一种联合miR‑676、miR‑181b和miR‑3591诊断急性高山病的试剂盒的制作方法

本发明涉及医学分子生物学技术领域，是一种将血浆中的microrna作为生物标志物用于急性高山病的诊断。

背景技术：

急性高山病(acutemountainsickness，ams)，又称作急性轻症高原反应，是人对高原自然环境未适应而产生的头痛，食欲减退，恶心，眩晕和疲劳等机体反应。是急进高原人群中最常见的高原特发疾病。现有研究由于人群年龄，进入高原海拔高度，速度以及ams诊断方法的不同，ams的发病率为16-100％(macinnismjetal.(2013)aprospectiveepidemiologicalstudyofacutemountainsicknessinnepalesepilgrimsascendingtohighaltitude(4380m)，《plosone》，8(10)，e75644.，mcdevittmetal.(2014)riskdeterminantsofacutemountainsicknessintrekkersinthenepalihimalaya：a24-yearfollow-up，《wildernessenvironmed》，25(2)，152-9.，gaillardsetal.(2004)awareness，prevalence，medicationuse，andriskfactorsofacutemountainsicknessintouriststrekkingaroundtheannapumasinnepal：a12-yearfollow-up，《highaltmedbiol》，5(4)，410-9.)，在随机对照研究中，ams的中位发病率为60％(waeberbetal.(2015)impactofstudydesignonreportedincidencesofacutemountainsickness：asystematicreview，《highaltmedbiol》，16(3)，204-15.)，是影响急进高原人群生活和工作的一个主要障碍。ams如果没有得到及时有效的控制，可能进展为具有高致死率的高原脑水肿进而危及生命(basnyatbandmurdochdr(2003)high-altitudeillness，《lancet》，361(9373)，1967-74.)。

尽管近年来对ams的诊断进行了大量的研究，现阶段国内外对ams的诊断主要依据患者所表现出的相关临床症状的严重程度进行评分诊断，现有的症状评分诊断系统有1980年提出的环境症状问卷计分诊断系统、1991年提出的中华人民共和国国家军用标准gjb1098-91、1993年加拿大路易斯湖国际诊断标准以及1995年中华医学会在国家军用标准基础上制定的急性轻症高原病症状分度与评分系统。由于症状评分存在较大的主观性，因此寻找更加可靠的客观性诊断指标成为ams诊断的又一研究热点。

microrna是一类广泛存在于真核生物中的内源性小分子非编码rna，长度为18～24个核苷酸。microrna通过转录后水平抑制靶基因的表达，调控细胞分化、增殖、凋亡等生命活动，在胚胎发育、机体代谢、疾病发生发展等多种生理和病理过程中发挥重要作用。近年来，研究人员在血液、唾液、尿液等多种体液中检测到microrna，提出循环microrna的概念。并且，microrna的表达水平的高低和其遗传基因的差异性高度相关，大量研究表明，循环microrna对肿瘤、高血压、卒中及一系列疾病的提前诊断和发病预测都有很好的特异性和敏感性。再者血液等体液标本易于获得，临床可操性强且创伤性小，而且循环microrna稳定性好，检测便利，因此，循环microrna具有作为ams无创性生物标志物的潜能。

而关于循环microrna与ams发病之间的相关性，尚未见报道。

更未见一种用于检测血浆中的microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p表达水平来诊断ams发病的报道。同样，3者联合诊断亦未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于检测ams的microrna标志物，通过检测被测者血清或者血浆中microrna-676-3p、microrna-181b-5p和microrna-3591-3p的含量，并与正常人血清或者血浆中的microrna-676-3p、microrna-181b-5p和microrna-3591-3p的水平进行分别比较来诊断ams，该microrna的灵敏度和精确度高

本发明解决上述技术问题的技术方案是：一种诊断ams的microrna标志物，所述标志物为及特征序列如下：

microrna-676-3p：cuguccuaagguuguugaguu

microrna-181b-5p：aacauucauugcugucggugggu

microrna-3591-3p：aaacaccauugucacacuccac

本发明的有益效果是：筛查出的microrna标志物，用于检测ams的精确度和灵敏度高。

更进一步的，在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

本发明还包括一种诊断ams的microrna标志物在制备ams诊断试剂中的用途。

附图说明

图1.ams发病者和健康对照的血浆中目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p)表达水平(即与cel-mir-39相比目的microrna的归一化水平)。

其中ams是ams发病者、non-ams为健康对照。*：p＜0.05，即有显著统计学差异，**：p＜0.01，即有极显著统计学差异，***：p＜0.001，即有极显著统计学差异。

图2为ams患者血浆3个目的microrna单独运用诊断的的工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，简称roc曲线)，该图中的很好的显示了ams发病者的roc曲线、曲线下面积(areaunderthecurve，auc)、灵敏性(sensitivity)、特异性(specificity)，其中auc反映了诊断效能(auc＝0.5，没有诊断学效能；0.5＜auc＜0.7很小的诊断价值；0.7＜auc＜0.9相当准确的诊断价值；0.9＜auc＜1，很准确的诊断价值)。

图3为ams患者血浆目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p)联合诊断的工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，简称roc曲线)，该图中的很好的显示了ams发病者的roc曲线、曲线下面积(areaunderthecurve，auc)、灵敏性(sensitivity)、特异性(specificity)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行描述，所列举的实施例仅仅是用来解释本发明，并非用于限制本发明的范围。

实施例1血浆标本目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p)的表达与ams发病的相关性研究

一、材料与标本收集描述

ams患者血浆标本收集自急进高原人群中的ams患者，合计37例。正常人群的血浆标本收集自急进高原人群中的正常健康人群，合计31例。ams的诊断是通过国际通用诊断标准-路易斯湖评分来确认的。ams患者在取血之前没有服用任何药物治疗。每个样本用edta-na抗凝管合计收集2ml血液。

二、样品处理和rna提取

在静脉血采集后10min内，在3000×g，25摄氏度下离心10分钟之后，用无rna酶和无细菌的吸头取上层血浆于无rna酶和无细菌的ep管中-80℃保存备用。血浆中的rna通过德国凯杰技术有限公司的血浆microrna柱式抽提试剂盒(mirneasyserum/plasmakit，货号：217184)按照说明书操作步骤进行提取和纯化。

三、实时荧光定量pcr(sybr染料法)

运用中国上海吉玛制药技术有限公司的microrna实时荧光定量pcr试剂盒(hairpin-ittmmirnasrt-pcrquantitationkit，货号：e01008)对目的microrna和外参cel-mir-39进行扩增；分别得到ct值(cyclethreshold)，通过公式：表达量＝2ct(cel-mir-39)-ct(目的microrna)在分别计算每例标本的目的microrna的表达水平，具体操作过程见说明书。每个样本重复三次实验。目的microrna和cel-mir-39引物序列见表3.

四、统计分析方法。

运用统计学软件spss19.0进行统计。正态性检验采用shapiro-wilk法，显著性差异用mann-whitney检验(mann-whitneytest)，工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，简称roc曲线)及线下面积(areaunderthecurve，auc)用于评价目的microrna的诊断效能。当p＜0.05时认为有统计学差异。

运用二元logistic回归，建立目的microrna的相关方程，得到预测概率p，并以预测概率p为检验变量进行roc曲线分析，继而评价目的microrna联合运用的诊断效能。当p＜0.05时认为有统计学差异。

五、结果分析

1.目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p)在ams及正常人群中的表达。

如图1所示，与外参cel-mir-39的水平相比的血浆目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p)的归一化水平在ams发病组和正常人群组之间具有显著性差异(p＜0.001)。

2.ams中目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p)的水平都可以作为生物标志物的诊断值，且联合诊断效能优于单独使用。

ams患者血浆目的microrna(microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p)单独作为生物标志物的诊断表现通过roc曲线(图2)可知。ams患者血浆microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p单独作为生物标志物的诊断表现良好，其auc分别为：0.713(95％ci，0.588-0.838)、0.735(95％ci，0.614-0.855)、0.8047(95％ci，0.699-0.911)。

3.microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p联合的诊断表现优于单独运用，作为生物标志物的诊断表现通过roc曲线(图3)可知其auc为0.856(95％ci，0.770-0.942)。

六、结论

血中microrna-676-3p、microrna-181b-5p、microrna-3591-3p的水平可以作为生物标志物来筛查和诊断ams，并且联合运用诊断效能优于单独使用。

表1ams发病组和健康对照组中血浆目的microrna的表达水平

***ams发病组vs健康对照组：p＜0.001，**ams发病组vs健康对照组：p＜0.01，数据以中位数(25％-75％分位数)表示

表2microrna基本信息

表3目的和cel-mir-39引物信息