本发明具体涉及一种检测同型半胱氨酸代谢相关基因mthfra66g的rs1801394snp位点的单核苷酸多态性(snp)的试剂盒，属于生物医学领域。。
背景技术：
同型半胱氨酸(hcy)，或称为高半胱氨酸或同半胱氨酸，是从s-腺苷基甲硫氨酸透过两个反应步骤途径形成，并能回转成甲硫氨酸，或经过转硫途径而回转为半胱氨酸或牛磺酸。缺乏维他命如叶酸、vb6或vb12，hcy水平都会上升。补充叶酸、vb6、vb12或三甲基甘氨酸会减少血液内的hcy的浓度。高水平的hcy与心脑血管疾病，胎儿发育异常，肿瘤发生等密切相关。叶酸，hcy的代谢中相关酶基因的突变将导致酶活性的降低，使hcy水平上升。
过去的大量研究表明，同型半胱氨酸代谢相关酶mthfr的基因遗传多态性直接或间接影响同型半胱氨酸在体内的代谢过程。正常的mthfr活性能保持叶酸和甲硫氨酸循环的有效性，维持体内hcy的正常水平，其中a66g多态将使相关基因编码的酶活性下降，减低机体对于叶酸的吸收利用能力，易造成叶酸缺乏，同时孕妇先兆流产。
然而，目前尚缺少能有效、准确的检测mtrra66g基因突变的相关手段。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种同型半胱氨酸代谢相关基因mtrra66g的检测试剂盒，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种同型半胱氨酸代谢相关基因mtrra66g的检测试剂盒，其包括检测mthfr基因rs1801394位点的引物对，所述引物对中上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2所示。
进一步的，所述的检测试剂盒还包括检测mthfr基因rs1801394位点的荧光探针对，所述探针对中上游探针和下游探针的核苷酸序列分别如seqidno.3、seqidno.4所示，且所述上游探针的5’端和下游探针的5’端还分别连接有荧光基团。
进一步的，所述荧光基团包括fam或vic基团。
进一步的，所述上游探针的5’端连接有fam基团。
进一步的，所述下游探针的5’端连接有vic基团。
进一步的，所述上游探针的3’端和下游探针的3’端还均连接有mgb基团。
进一步的，所述试剂盒还可包括pcr反应缓冲液，聚合酶和dntp。
进一步的，所述试剂盒还可包括正常基因型对照gdna标本。
藉由本发明的试剂盒，能够高灵敏度、特异性、准确（检测阴性、阳性参考品的符合率为100%）、简便快捷（一个检测周期最短可以控制在数分钟内）实现mthfra66g的rs1801394snp位点的单核苷酸多态性检测，，适合临床和科研使用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、试剂盒的组成及配置
1、主要原材料来源及制备方法：
本试剂盒的引物和探针序列如下：
上游引物rs1801394-fp如seqidno.1所示：
5′-ctacacagcagggacaggca-3′；
下游引物rs1801394-rp如seqidno.2所示：
5′-gatctgcagaaaatccatgtacca-3′；
上游荧光探针rs1801394-fam如seqidno.3所示：
5′-fam-tgctcacatatttc-mgb-3′。
下游荧光探针rs1801394-vic如seqidno.4所示：
5′-vic-tgctcacacatttc-mgb-3′。
2、每次实验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，视该次实验无效，需重复。为证明是否有污染存在，每次实验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次实验无污染；如结果为阳，则视该次实验无效，需重复。
3、引物和探针：
将genebank数据库中调取的mtrra66g基因组全序列进行比对分析，用primerpremier5.0和oligo6.0设计pcr引物扩增获取目的dna片段，同时在这个片段上设计特异性探针。要求各探针tm值相差不超过5℃，在同一温度下具有最适宜的杂交灵敏度和特异性。
引物和探针均为人工合成寡聚核苷酸，均由苏州金唯智生物技术有限公司合成。序列合成完毕后由公司人员核对，然后根据需要稀释成所需浓度。
4、taqdna聚合酶、dn(u)tp等均可从市场够得，例如taqdna聚合酶可使用takara公司公司产品。dn(u)tp可使用上海普洛麦格(promega)生物技术有限公司产品，稀释至使用浓度分装备用。
5、阳性参考品：获取自合作医院，为十位mthfra66grs1801394snp位点突变患者的基因样品，经基因测序标定。
6、阴性参考品：获取自合作医院，为十位健康人员的基因样品，经基因测序标定。
7、配置阳性反应体系：pcr管内加入阳性参考品4.8μl、加入5μl扩增缓冲液（含10×pcrbuffer、25mmmgcl2，100mmdatp、100mmdgtp，100mmdctp、100mmdttp，前述上、下游引物及上、下游探针，余量为超纯水）和0.2聚合酶(2.5u/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，避光备用。
8、配置阴性反应体系：pcr管内加入阴性参考品4.8μl、加入5μl扩增缓冲液（含10×pcrbuffer、25mmmgcl2，100mmdatp、100mmdgtp，100mmdctp、100mmdttp，前述上、下游引物及上、下游探针，余量为超纯水）和0.2聚合酶(2.5u/μl)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，避光备用。
9、对上述阴性、阳性反应体系同时进行pcr反应，pcr程序见下表：
同时于stratagenemx3005p荧光定量pcr仪上进行扩增检测。检测结果：阳性参考品及阴性参考品的检测符合率达到100%。
12、随机选取一百位人员，并探询其家族病史和个人既往病史，其中1位的家族成员中普遍存在叶酸缺乏病症，2位人员曾被检出叶酸缺乏，其余均正常。
（1）全血基因组dna的提取：取100位受检者外周静脉血300μl，加入700μl细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离心1分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加入300μl双蒸水，涡旋震荡混匀成100份细胞裂解悬液。
（2）参照前述阳性或阴性反应体系的配置方法，分别将前述的各细胞裂解悬液4.8μl与5μl扩增缓冲液和0.2μl聚合酶(2.5u/μl)混合构成独立的反应体系。
（3）参照前述的第9步骤对这些独立的反应体系进行pcr扩增和荧光定量检测。检测结果：其中1位待检人员存在rs1801394位点突变，该待检人员为家族成员中普遍存在叶酸缺乏病症的待检人员。其余人员均正常。
（4）采集步骤（3）中检出的、存在rs1801394位点突变的待检人员的基因，并利用基因测序法对其mtrra66g的rs1801394位点进行检测，发现其中存在碱基突变。
同时，利用基因测序法对其余99位待检人员基因进行检测，其mtrra66g的rs1801394位点均无突变。
本发明的检测试剂盒具有高特异性和灵敏度，且使用时操作简单、经济高效、可进行高通量的样本检测。
应当指出，以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110>苏州康吉诊断试剂有限公司
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