抑制甲硫氨酰tRNA合成酶产生HTL的Hcy结构类似物AHT及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种Hcy结构类似物及其应用，该Hcy结构类 似物作为抑制剂，用于（种属）甲硫氨酷tRNA合成酶，抑制其将同型半脫氨酸转化成同型 半脫氨酸硫内醋（HTL)，从而抑制蛋白质的N-同型半脫氨酸修饰；还设及该抑制剂W及其 可接受的衍生物在制备预防或治疗高同型半脫氨酸血症相关疾病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 高同型半脫氨酸血症（Hyperhomo巧steinaemia，皿巧），是指血液中的同型半脫氨 酸（Hcy)的水平异常增高的状况。Hcy是甲硫氨酸（Met)代谢的中间产物，当饮食中叶酸或 维生素B6,维生素B12缺乏或同型半脫氨酸代谢相关基因缺陷时，体内Hcy水平升高。高 Hcy血症是屯、血管疾病如冠状动脉硬化性屯、脏病，外周血管疾病，脑血管疾病及静脉血栓 形成等的危险因素，亦是出生缺陷，尤其是先天性屯、脏病和神经管崎型的一个十分重要的 危险因素，除此之外也是老年病、糖尿病、肾脏病和一些神经精神疾病的一个重要的危险因 子。
[000引由于Hcy结构与Met类似，可W被甲硫氨酷tRNA合成酶错误识别，甲硫氨酷tRNA合成酶的主要功能是在翻译过程中将Met与tRNAmet生成甲硫氨酷tRNA,Hcy是Met的代谢 产物，结构与甲硫氨酸类似，因此会被甲硫氨酷tRNA合成酶错误识别，被其转化为HTL。 [0004] 同型半脫氨酸硫代内醋（HTL)W异构肤键与蛋白质的赖氨酸残基结合，形成 N-Hcy-蛋白质，运一过程称为蛋白质的N-同型半脫氨酸化。 阳0化]虽然皿cy是许多疾病的独立高风险因子，但是降低Hcy水平运一策略在屯、脑血管 疾病，中风等疾病的预防治疗中并没有取得理想的效果，有报道表明，其中的原因在于，虽 然叶酸及维生素B联用可W降低总Hcy水平，但是并不能降低N-Hcy抗体的水平，即不能降 低蛋白质同型半脫氨酸化修饰水平。 阳006] HTL的产生和蛋白质的高N-Hcy修饰被很多人认为是高同型半脫氨酸血症的主要 致病机制。 阳007] 有报道表明，在体外试验中，甲硫氨酸可W竞争性抑制MRS对化y的识别，从而 减少HTL的生成。但在体内由于Met是Hcy的代谢前体，会导致Hcy水平升高，因此Met不 能作为体内OTL生成的抑制剂，但运提示我们其它化y的结构类似物可能具有抑制OTL生 成的作用。
[0008] 诱发氧化应激及细胞调亡是高同型半脫氨酸血症主要的致病机制之一，但其中的 具体机制还不是非常清楚，但很多报道显示，OTL是高同型半脫氨酸血症导致活性氧上升的 主要因素，因此，我们推测Hcy结构类似物AHT可能可W通过降低OTL的产生从而降低活性 氧的生成。
[0009] 高同型半脫氨酸血症可W激活Wnt/ 0 -catenin信号通路，Wnt/ 0 -catenin信号 通路在调节细胞增殖，细胞调亡等活动中发挥着重要的作用，该信号通路的失衡会导致许 多疾病比如神经管崎形，屯、脏发育崎形，神经退行性疾病， 神经管崎形是与高同型半脫氨酸血症高度相关的一类出生缺陷，已有文献报道高同型 半脫氨酸血症导致神经管崎形的机制在于诱发了氧化应激，从而激活了在发育中起到重要 作用的Wnt- 0 -catenin信号通路，我们推测AHT可W通过抑制OTL产生从而抑制活性氧产 生，进而抑制Wnt-0-catenin信号通路的异常激活，从而达到抑制神经管崎形的发生的作 用。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的之一是提供一种Hcy结构类似物，作为抑制同型半脫氨酸硫内醋 (HTL)生成的抑制剂。
[0011] 本发明的另一目的是提供上述Hcy结构类似物及其可接受的衍生物在制备预防 或治疗高同型半脫氨酸血症相关疾病的药物中的应用。
[0012] 本发明的抑制剂也是N-同型半脫氨酸化修饰抑制剂。
[0013] 本发明所述的抑制剂的药物设计原理，即通过Hcy类似物抑制MRS催化的OTL生 成及蛋白质N-同型半脫氨酸化修饰。
[0014] 本发明所述的Hcy结构类似物作为HTL及N-Hcy修饰抑制剂在HTL及N-Hcy修饰 研究中的应用。
[0015] 本发明所述的抑制剂通过抑制OTL产生从而抑制了OTL升高造成的高N-同型半 脫氨酸化修饰导致的活性氧升高及Wnt-0-catenin信号通路激活，最终达到预防和治疗 高同型半脫氨酸血症相关疾病的目的。本文W神经管崎形为模型，验证了本发明抑制剂的 效果。
[0016] 本发明设及的化y的结构式为：
[0017] 本发明提供的作为抑制同型半脫氨酸硫内醋化TL)生成的抑制剂的Hcy结构类似 物，其分子结构如下：
[0018] 本发明通过体外生化实验检测了AHT对MRS生成OTL活性的抑制作用，通过细胞 试验检测了AHT对于细胞内总蛋白和抗氧化蛋白S0D1/2的N-同型半脫氨酸修饰水平的降 低作用，并进一步检测了AHT对于活性氧累积和Wnt- 0 -catenin信号通路异常激活的抑制 作用，通过动物实验检测了AHT对于大鼠神经管崎形的抑制作用，并验证了运种预防作用 是通过降低了蛋白质N-Hcy修饰实现的。
[0019] 本发明所述Hcy结构类似物AHT及其衍生物，可用于制备预防或治疗高同型半脫 氨酸血症相关疾病的药物。
[0020] 皿巧相关疾病包括神经管崎形，屯、脏发育崎形巧日先天性屯、脏病)，屯、脑血管疾病 咖冠屯、病，动脉粥样硬化，中风)，神经退行性疾病咖阿兹海默症)，糖尿病，骨质疏松等。
[0021] 由于N-Hcy修饰也可能发生在DNA上，本发明抑制剂抑制蛋白质的N-同型半脫氨 酸化修饰但不只限于蛋白质的修饰。
【附图说明】 W22] 图1为AHT抑制MARS将Hcy转化为HTL。 阳02引图2为AHT降低蛋白质N-同型半脫氨酸化修饰水平。
[0024] 图3为AHT降低SODN-同型半脫氨酸化修饰水平。 阳0巧]图4为AHT抑制Hcy诱导的活性氧水平升高。 阳0%] 图5是AHT抑制化y对0 -catenin的累积作用，但对OTL对0 -catenin的累积 作用没有影响。
[0027] 图6为ATRA升高大鼠肝脏及血浆的化y水平。 阳02引图7为ATRA升高大鼠胎盘，母鼠肝脏，胎鼠脑，脊髓蛋白质N-Hcy修饰水平。
[0029] 图8为AHT抑制神经管崎形的发生率。
[0030] 图9为AHT降低大鼠胎盘，母鼠肝脏，胎鼠脑，脊髓蛋白质N-Hcy修饰水平，蛋白质 同型半脫氨酸化修饰水平。
[0031] 图10为AHT降低胎鼠脑中活性氧水平。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合实验例对本发明进一步详述但不限制本发明。 阳〇3引实施例1:AHT的合成： 称量5g化-homo巧Steine于250血圆底烧瓶中，成置换，加入无水甲醇160血，冰 浴下逐滴加入SOClz4mU撤去冰浴室溫揽拌24h。
[0034] 停止反应后，旋干溶剂。该粗产物加入DCM溶解，冰浴加入10. 35血化3N，然后加 入BoC2〇8. 9g，室溫揽拌2. 5h。
[0035] 停止反应后，旋干溶剂。该粗产物加CH3OH80血，H2O35血，逐滴加入S下基麟 9.2血，50°C揽拌30分钟。该反应体系用200血乙酸，100血&0稀释，分出有机相。水 相用乙酸（2X100mL)萃取两次，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水Na2S〇4干燥，旋干，经 柱层析（PE:EA=20:1)得无色油状物(化合物2)。
[0036]称量3g化合物2，加入邸3地120血，S乙胺9. 24血，室溫揽拌30min,加入 舰乙酷胺2. 64g，室溫揽拌12h。停止反应，旋干溶剂，加入DCM溶解，水洗，饱和食盐水洗， 无水Na2S〇4干燥，旋干，经柱层析（DCM:CH30H=80:1)得无色油状物(化合物3)。
[0037] 称量4g化合物3,加入DCM 60血，TFA 10血，室溫揽拌12 h。停止反应后，旋 干溶剂，油累抽干，得黄色油状物(化合物4)。
[0038]
称量2.7g化合物4,加入化OH11g，室溫揽拌12h。停止反应后，旋掉THF，稀盐酸 酸化至抑=6,旋掉水后产物加乙醇溶解，不溶物过滤，收集滤液旋干，油累抽干得黄色固体 (化合物5)。
[0039] 实施例2、薄层层析实验验证化y结构类似物AHT可W在体外抑制MRS将化y转 化OTLo
[0040] 反应体系配置： 50mM胎pes(p册.0)，10mMMgCl2，l〇mM2-琉基乙醇，1.5mMATP，5mM同型半脫氨酸， 30yM甲硫氨酷tRNA合成酶，AHT，在25反应IOOmin 薄层层析检测OTL的生成 点样：用铅笔在距硅胶板一端2cm处划直线并做点样标记。用微量移液器吸取4ul样 品点于已标记的加样处，每个点的直径不得大于0. 5cm，冷风吹干。
[0041] 展开：按正下醇：冰乙酸：水=4 :I:I配制展开剂，均匀混合后倒入展开缸， 将点样的薄板置于层析缸内的展开剂显色液中，严密封口。当展开剂前沿达到薄板3/4位 置时，将薄板取出，用吹风机吹干或置65 °C烘箱中烘干。
[0042] 显色：显色液配好并充分混匀后倒入喷雾壶，对着烘干后的硅胶板均匀喷雾，之后 置105 °C烘箱中至硅胶板上出现清晰可见的氨基酸斑点。
[0043] 结果显示，AHT在体外实验中可W明显的抑制MARS将Hcy转化成为HTL。且抑制 效果呈现剂量依赖型的下降巧日图1)。 W44] 实施例3、AHT对细胞总蛋白同型半脫氨酸修饰的影响 OTL是N-同型半脫氨酸化修饰的直接前体，AHT作为OTL产生的抑制剂，可W降低细胞 总蛋白同型半脫氨酸化修饰，并且可W纯化Hcy对于细胞内总蛋白同型半脫氨酸修饰的增 加作用。
[0045] 选用细胞：肥K293T及NI册T3,培养条件：含10%小牛血清的DMEM，37°C，5%0)2。
[0046] 药物处理：细胞培养至汇合度为80%左右时，在培养基中加入AHT，同时AHT处理 组及空白对照组全部加统一浓度的化yW模拟高同型半脫氨酸血症，处理条件见下表：
样品收集及检测：Hcy处理细胞4h后用PBS清洗细胞1-2遍，加1XSDS上样缓冲液收 集并裂解细胞后，置99°C加热10-15分钟使裂解液中的蛋白充分变性，将获得的蛋白样品 通过免疫印迹（western-blot)实验检测细胞裂解液中总蛋白的赖氨酸同型半脫氨酸化修 饰水平。
[0047] 结果显示，AHT处理使细胞总蛋白Hcy修饰水平呈现剂量依赖型下降（图2)。
[0048] 实施例4、AHT对于超氧化物歧化酶N-Hcy修饰的抑制作用。
[0049] 我们前期通过质谱实验检测到超氧化物歧