基因及用途、基因元件、合成奇数中链脂肪醛的方法以及合成偶数中链脂肪烃的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因及用途、基因元件、合成奇数中链脂肪醒 的方法W及合成偶数中链脂肪姪的方法。
【背景技术】
[0002] 中链脂肪醇因具有两亲的特性而在工业中具有非常重要的应用，可用于表面活性 剂、医药、化妆品W及能源领域，具有1-1. 2亿美元的市值。而碳链长度在6-16的脂肪姪类 分子是航空煤油的主要成分，具有热值高、蒸汽压低、凝固点低W及吸湿性低等优点。50% 的商用脂肪醇从植物种子或者动物脂肪中提取，剩余脂肪醇W及全部姪类都从石油中精炼 而来。无论是哪一种方法，都不能满足现代社会对可持续性和环境友好的生产要求。相反 的，在合成生物学手段快速发展的条件下，基因工程菌株却可W利用糖、木聚糖或者甘油等 可再生能源，特异性的合成所需产品。
[0003] 在工程改造的大肠杆菌中，脂肪醇和姪类物质主要从脂肪酸合成途径进行衍生合 成。分别可W利用脂醜-ACP/CoA和自由脂肪酸Η种分子作为合成前体物。在姪醇的合成 中，将脂醜-ACP/CoA或脂肪酸转化为脂肪醒是一个关键性步骤，随后脂肪醒再被还原为 脂肪醇或经脱撰基反应成为少一分子碳的姪类物质。W脂醜ACP/CoA为前体物的脂肪醇 /姪类物质的微生物合成自2010年起出现报到。而W自由脂肪酸为底物合成中链姪醇类 物质的人工合成体系直到2013年才出现两篇报道。化ward等人在大肠杆菌中过表达来 自香棒树（Cinnamomum camphora)中的硫醋酶，将特定长度的自由脂肪酸从脂醜-ACP中 释放出来，并同时表达发光杆菌（Photorh油dus luminescens)的luxC, lu址，luxE基因 编码的脂肪酸还原酶（fatty acid reductase, FAR)和来自念珠藻（Nostoc punctiforme PCC73102)中的脂肪醒脱撰基酶，将自由脂肪酸还原成脂肪醒并脱駿成减一个碳原子的姪 类分子，构建了能够合成长度相对可控的W自由脂肪酸为底物的姪类合成系统。A化tar等 人发现来自海鱼分枝杆菌（Mycobacterium marinum)中的駿酸还原酶（carbo巧lie acid re化ctase，CAR)能够将链长范围从C6到C18的自由脂肪酸转化为相应的脂肪醒。将送个 酶与脂肪醒还原酶或者脂肪醒脱駿酶结合，可W在体外构建生产偶数链长（C8-C16)的脂 肪醇和奇数链长（C7-C15)的姪类化合物。当在胞内将该路径与能产生特定链长自由脂肪 酸的硫醋酶相结合后，E. coli BL2UDE3)菌株在W葡萄糖为碳源的最小培养基中能够合成 出产量高达350mg/L的脂肪醇。
[0004] W上两种W自由脂肪酸为底物的姪类合成系统因都采用还原酶进行成醒反应，故 称之为还原型姪类合成系统。因为在相同的底物条件下，还原酶需要细胞为其提供还原力 (NAD(巧H)和能量（AT巧才能发生反应，而氧化酶则是由氧分子来提供反应动力，因此氧化 型合成体系是更为经济的微生物合成体系。目前还没有氧化型姪类人工合成构建的相关工 作被发表出来。
[0005] 另外一方面，在现有报道的工作中，无论是W脂醜-ACP/CoA还是W自由脂肪酸为 前体物的姪醇人工合成体系，因为第一步的还原反应均不涉及脱碳反应，因此所合成的脂 肪醇均为偶数碳链，而姪类分子因为一步脱撰基反应而均为奇数碳链。实际上，石油基的化 学品和燃料结构都具有多样性，同时包含直链和支链、奇数链和偶数链的分子，一个理想的 生物燃料应该是在结构和化学特性上都与现行的石油基燃料相类似。曾有工作通过改变上 游脂肪酸合成路径用于下游合成支链和偶数链焼姪。但还没有任何工作直接调控下游合成 路径。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供基因及用途、基因元件、合成奇数中链脂肪醒的方法W及合 成偶数中链脂肪姪的方法。α-加双氧酶将前体物脂肪酸分子转化为重要中间代谢物一 脂肪醒的过程为氧化反应，不需要细胞提供额外的还原力和能量，降低了细胞生产的负担； 填补了脂肪醇产物链长仅为偶数，脂肪姪产物链长大多为奇数的技术局限，可W使生物基 大宗化学品W及生物燃料的分子与石油基相关产品更为匹配。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种基因，其具有：
[000引 （I )如SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列；或
[0010] ( II )女口 SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列的互补序列；或
[0011] (III)与（I )或（II )的核巧酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而 与（I )或（II )的核巧酸序列不同的序列；或
[0012] (IV )与（I )或（II )或（III)所述序列至少有80%同源性的序列。
[0013] 本发明还提供了上述基因用于合成脂肪醒、奇数中链脂肪酸、偶数中链脂肪姪的 用途。
[0014] 在本发明的一些实施例中，所述脂肪醒为奇数中链脂肪醒。本发明所述中链脂肪 酸、中链脂肪醇、中链脂肪姪分别表示含有含有8-14个碳原子的脂肪酸、脂肪醇和脂肪姪 分子。
[0015] 在本发明的一些实施例中，所述脂肪醒为奇数中链脂肪醒。
[0016] 在本发明的一些实施例中，所述脂肪醒为1-十一醒、十Η醒或十五帰醒。
[0017] 在本发明的一些实施例中，所述奇数中链脂肪酸为1-^ 醇、1-十Η醇或1-十五 醇。
[001引在本发明的一些实施例中，所述偶数中链脂肪姪为链长为C12和C14的脂肪姪。
[0019] 本发明还提供了 一种含有上述基因的载体。
[0020] 本发明还提供了一种含有上述载体的宿主细胞。
[0021] 在本发明的一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0022] 本发明还提供了一种用于脂肪醒的基因元件，其含有上述的基因。
[0023] 本发明还提供了一种用于合成奇数中链脂肪醒的基因元件的构建的方法，包括如 下内容：
[0024] 1)将大肠杆菌内源硫醋酶基因（tesA')连接到pTr地is2A载体中，形成 pHisTrc-tesA 质粒；
[002引 2)将含有Ph。启动子的硫醋酶序列连接到pACYCDuet-1质粒中，形成 pACYC-Trc-tesA 质粒；
[002引扣将569 ID N0:11所示的α-加双氧酶基因（α-dox)连接到祀T21a质粒中，形 成祀T21a-Dox质粒。
[0027] 本发明还提供了一种用于合成奇数中链脂肪醇的基因元件，其含有上述的基因和 醒基还原酶基因。
[0028] 在本发明的一些实施例中，所述醒基还原酶基因选自具有如SEQ ID No. 2所示的 核巧酸序列的基因、a化P、yj浊、y化D或a化E。
[0029] -种用于合成奇数中链脂肪醇的基因元件的构建的方法，其特征是；将不同类型 或来源的醒基脱氨酶基因（曰化？、7北8、7化0、3化6和569 10^:2所示的3山1192)连接 到祀T28a 质粒中，形成 28a-A化P、28a-Yj浊、pET28a-YcihD、祀T28a-A化E、祀T28a-Slrll92 质粒。
[0030] 本发明还提供了一种用于合成偶数中链脂肪姪的基因元件，其含有上的基因和撰 基脱撰酶基因。
[0031] 在本发明的一些实施例中，所述撰基脱撰酶基因选自具有如SEQ ID No. 3、4或5 所示的核巧酸序列的基因或ad73102。
[0032] 本发明还提供了一种用于合成偶数中链脂肪姪的基因元件的构建的方法将 不同类型或来源的醒基脱撰酶基因 （SEQ ID N0:3所示的cerUSEQ ID N0:4所示的 a贴313、沈Q ID N0:5所示的ad7942、ad73102)连接到祀T28a质粒中，形成祀T28a-CER1, 祀T28a-AD9313, pET28a-AD7942 和祀T28a-AD73102 质粒。
[0033] 本发明提供了一种合成奇数中链脂肪醒的方法，包括如下步骤：
[0034] 步骤1 ;将上述的基因连接到载体中，构建表达载体；
[0035] 步骤2 ;将所述表达载体转化宿主细胞，表达，收集表达产物，即得。
[0036] 具体的，包括如下步骤：
[0037] 1)将α -加双氧酶基因从祀T21a-Dox质粒中带RBS的dox基因连接到 pACYC-Trc-tesA质粒中，形成CYX134质粒
[003引。将〔￥乂134质粒转化进入E. coli化21触扣菌株中，发酵，收集产物，即得。
[0039] 本发明还提供了一种合成奇数中链脂肪醇的方法，包括如下步骤：
[0040] 步骤1 ;构建含有硫醋酶基因及所述硫醋酶基因启动子的第一载体；
[0041] 步骤2 ;将上述的基因经酶切连接到所述第一载体，构建第二载体；
[0042] 步骤3 ;将醒基还原酶基因经酶切连接到所述第二载体，构建表达载体；
[0043] 步骤4 ;取所述表达载体转化宿主细胞，表达，收集表达产物，即得。
[0044] 具体的，包括如下步骤：
[0045] 1)将不同来源的醒基还原酶基因从28a-A化P、28a-Yj浊、pET28a-YqhD、 祀T28a-A化E、祀T28a-Slrll92的质粒中用甜al和BamHI酶切后分别连接到用Spel和 BamHI 酶切的 CYX134 质粒中，形成 CYX143、CYX144、CYX14