专利名称：植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物中一种与胁迫相关的转录因子及其编码基因与应用，特别涉及一种植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因与其在培育抗逆性提高的植物中的应用。
背景技术：
干旱、高盐及低温等逆境胁迫都会影响植物的正常生长和发育。了解植物对逆境条件的应答与信号传导机制，提高植物特别是作物的抗逆性是作物遗传研究和品种改良的重要任务之一。
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。阐明植物对逆境的反应机制，将为植物抗逆的分子育种提供科学的理论基础。研究表明，植物在水分亏缺引起植物损伤之前，就能对干旱作出包括信号转导、基因表达和代谢调节在内的适应性调整并继续生长和发育。基因与环境是调节植物生长发育的两个基本因素，探索环境条件如何调控植物的基因表达，以及环境条件对植物体内的生理功能变化的影响已成为植物遗传育种学家的最大挑战，这正是信号转导(Signal transduction)机制研究的热点问题。
植物的许多基因已被证明受非生物逆境胁迫的诱导，这些基因的表达产物有的在抗逆性中直接发挥功能，有的负责调控下游基因的表达和逆境信号的传导。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。
转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。
目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答元件结合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。这五个转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其它四个家族均参与调节植物对干旱、高盐和低温等的逆境胁迫反应。其中，AP2/EREBP类转录因子在高等植物中广泛存在，它是植物所特有的一类转录因子，近年来，在拟南芥、烟草、玉米、水稻和油菜中均有报道，这表明AP2/EREBP类转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。
Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在对逆境应答基因rd29A基因的启动子区域的研究中，发现了一个逆境胁迫应答顺势作用元件，即脱水应答元件(DRE，dehydration-responsive element)。此后，发现许多逆境应答基因启动子区域含有DRE元件。Liu等人首次利用酵母单杂交系统，从拟南芥的cDNA表达文库中克隆到二种编码与DRE元件结合的转录因子脱水应答元件结合蛋白(DREB，dehydration-responsive element binding protein)cDNA，分别命名为DREB1A，DREB2A。它们在氨基酸序列上没有显著的相同性，但都含有一段非常保守的由58个氨基酸组成的DNA结合区域(EREBP/AP2结构域)。蛋白质三维分析表明，该区域含有3个β-折叠，对识别各类顺式作用元件起关键作用。其中位于第二个β-折叠中的第14、19位的两个氨基酸残基的差异，决定这类转录因子与不同顺式作用元件的特异结合。DREB类转录因子第14位氨基酸是缬氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREB1转录因子的第19位氨基酸就是缬氨酸。在DREB类蛋白中决定DNA结合的特异性方面，V14的作用明显要比E19重要；而ERF类转录因子第14位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特异结合DRE/CRT顺式元件，ERF特异结合GCC-盒。AP2/EREBP结构域的C-端区还包含1个由18个氨基酸残基组成的核心序列，该序列形成双亲性的α-螺旋，该α-螺旋可能参与同其它转录因子及DNA间的相互作用。
目前，在许多植物中都发现这种含有EREBP/AP2结构域的转录因子，并分别与抗病、抗逆等信号传递有关。刘强等认为，一个DREB基因可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达。Kasuga等的研究证实，导入到拟南芥的DREB1A基因可以同时促进与逆境胁迫耐性有关的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表达，转基因植株的抗逆性大大增强。同样，低温耐性转录因子CBF1的转基因植株的耐低温能力有显著提高。由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的综合抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
研究人员最早发现，在干旱、高盐及低温等逆境胁迫下，体内脱落酸(ABA)大量积累，许多与逆境胁迫耐性有关的基因是受ABA诱导的。在转录水平上研究ABA诱导基因表达调控，发现在功能基因的启动子区域内都有一个相当保守的序列(PyACGTGGC)，作为ABA应答元件(ABA responsive element，ABRE)。与ABRE特异结合的反式作用因子也相继被克隆。此外，还发现另外一些顺式作用元件参与ABA的应答反应，如在大麦HVA22基因中鉴定的偶联元件(Coupling element，CE)CE1，其核心序列是TGCCACCGG。
与此同时，研究也发现许多与逆境耐性有关的基因的表达与ABA无关，其中，有些基因受干旱和低温同时诱导，有些基因只对干旱或低温有应答反应。说明植物体内存在多条信号传递途径，负责逆境胁迫信号的感应、传递和基因表达的调控。Yamaguchi-Shinozaki等利用示差筛选法从干旱处理的拟南芥中，克隆了一批受干旱诱导的基因，其中，rd29基因编码与LEA蛋白非常相似的蛋白，它对干旱、高盐及低温胁迫均可产生应答反应，对其启动子的研究发现有二个不依赖于ABRE的DRE顺式作用元件(dehydration responsive element，DRE)。其核心序列是TACCGACAT。目前已分离克隆的与逆境耐性有关的基因，如rd17，kin1，cor6.6等基因的启动子区域内也都发现了DRE元件或DRE核心序列元件，此外，在低温应答元件CRT(C-repeat)、LTRE(Low temperature responsive element)也存在CCGAC保守序列，说明DRE元件普遍存在于逆境胁迫应答基因的启动子中，并对逆境胁迫应答起重要作用。
综合目前的研究结果，植物在逆境胁迫条件下的信号传递途径至少有以下六条途径依赖于ABA的信号传递途径有三条1)受干旱、高盐诱导，激活MYB、MYC类转录因子基因，调控具有MYBR或MYCR顺式作用元件的靶基因。
2)受干旱、高盐诱导，激活ABF/AREB类转录因子基因，调控具有ABRE顺式作用元件的靶基因。
3)受干旱、高盐诱导，激活CBF4，DREB1类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。
不依赖于ABA的信号传递途径有三条
1)受干旱、高盐诱导，激活DREB2类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。
2)受低温诱导，激活CBF1-3/DREB1A-C类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。
3)受干旱、高盐或乙烯诱导，激活EREB类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。
目前，在水稻、玉米等主要农作物中已有DREB转录因子基因克隆的报道，从大豆中克隆DREB转录因子基因还未见报道。
DNA迁移率变动试验(DNA mobility shift assay，EMSA)，又叫凝胶阻滞(gelretardation)试验，是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的特殊的凝胶电泳技术。基本原理为在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可证实特异性DNA与相应蛋白结合。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的植物脱水应答元件结合蛋白，名称为GmDREB3，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.))，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。
其中，序列表中的序列1由313个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第104位-105位氨基酸残基为核定位序列，自氨基端第120位-177位氨基酸残基序列为保守的AP2/EREBP结构域。
上述植物脱水应答元件结合蛋白编码基因(GmDREB3)，也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №2由939个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第939位碱基，编码具有序列表中SEQ ID№1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第358到第531位碱基为AP2/EREBP保守结构域的编码序列，编码58个氨基酸，自5’端第397到第399位碱基为缬氨酸的编码序列，自5’端第412到第414位碱基为亮氨酸的编码序列。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增GmDREB3中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
Northern blot实验证明GmDREB3基因受高盐诱导表达，而不受干旱、冷胁迫、ABA诱导表达；EMSA(凝胶阻滞实验)证明GmDREB3在体外与DRE具有结合特异性；酵母转录激活系统证明了GmDREB3的体内结合特异性和激活功能。本发明的GmDREB3基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物(特别是大豆)中发挥重要的作用。
图1A-图1D为GmDREB3受胁迫诱导表达的情况图2为GmDREB3的EMSA具体实施方式
实施例1、GmDREB3基因的克隆将生长14天左右的铁丰8号(抗盐碱大豆品种)大豆幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中处理12小时，采用Trizol法提取大豆总RNA，利用3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit(GIBCOBRL，CAT.NO.18373-019)按照其说明书的步骤操作获得GmDREB3基因的全长序列。其中，3’RACE的特异引物为GSP15’GGTCGCTGAAATCAGACT 3’；GSP25’GACTCCCAAAGAACCGCACGCGCCTCTG 3’。GmDREB3基因具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。序列1的自氨基端第104位-105位氨基酸残基为核定位序列，该核定位序列的编码序列为序列2的自5′端第310位碱基-315位碱基；序列1的自氨基端第120位-177位氨基酸残基为AP2/EREBP结构域，自氨基端第133位(AP2/EREBP保守结构域中的第14位)为缬氨酸，自氨基端第138位(AP2/EREBP保守结构域中的第19位)为亮氨酸。该AP2/EREBP结构域的编码序列为序列2的自5′端第358位碱基-531位碱基。GmDREB3是一个DREB蛋白。
GmDREB3基因的序列在Genabnk上进行比对，未发现与GmDREB3基因同源的大豆DREB基因，证明GmDREB3基因是一个新的基因。
实施例2、Northern bolt检测GmDREB3基因的表达特性
1、植物材料的准备取14天左右的大豆幼苗，进行以下处理(1)干旱处理将大豆幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养0.5小时、1小时、3小时、6小时和24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。
(2)盐渍处理将大豆幼苗的根系置于200mM NaCl溶液中，光照培养0.5小时、1小时、3小时、6小时和24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。
(3)冷害处理将小麦幼苗置于4℃培养箱，光照培养0.5小时、1小时、3小时、17小时和72小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。
(4)ABA处理给大豆幼苗喷洒200μM的ABA溶液中，光照培养0.5小时、1小时、3小时、17小时和72小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。
(5)对照的处理直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照。
采用Trizol法分别提取上述植物材料的大豆总RNA。
2、转膜(1)电泳及转膜用具的处理0.1N NaOH/1mM EDTA浸泡1h，用清水冲洗干净备用；(2)准备甲醛变性凝胶在一个三角烧瓶中加入10ml 10×MOPs，73ml DEPC处理的水和1g琼脂糖，加热融化；当冷却到55℃左右时加入17ml甲醛，混匀，倒入RNA专用的胶槽中；(3)在DEPC处理的0.5ml离心管中加入RNA+DEPC处理水4μl(大豆总RNA约为30μg)甲酰胺12.5μl甲醛 4.0μl10×MOPs 2.5μl溴酚兰(10×) 2.5μl(4)样品在65℃水浴处理5min，然后点样，开始电泳，缓冲液为1×MOPs。当溴酚兰到达凝胶1/3-1/2位置时，停止电泳；(5)用蒸馏水冲洗凝胶，用20×SSC转膜。将凝胶翻转后放在滤纸桥上，放上一张与凝胶大小相当的尼龙膜(Hybond-N+，Amarsharm)，赶除气泡，在膜上放3层滤纸，与尼龙膜大小相同，赶除气泡，将凝胶周围用胶片封好，放上大小相当的吸水纸，压上约500g的重物，转膜24h，其间更换吸水纸。转膜完成后，用2×SSC洗膜10min，用滤纸吸干，保鲜膜包好，紫外灯照射3min，4℃存放至杂交；3、探针的制备在GmDREB3基因的3’设计特异引物GmDREB3F和GmDREB3R(避开AP2/EREBP区域)，以克隆的GmDREB3基因为模板进行PCR扩增，程序及体系如下引物序列GmDREB3F5’CATCTAAGACACCACGGA 3’GmDREB3R5’CCAATCAATCTCCACAGA 3’反应体系(50μl)模板(60ng/ul) 0.5μldNTP(每种10mM) 1μl引物(各25μM) 1μl10×缓冲液 5μlddh2O 42.1μlTaq(5U/μl)0.4μl其中，10×缓冲液来自于TaKaRa Taq试剂盒(TaKaRa公司，Code No.DR100A)。扩增条件(PTC-200)先94℃2min；然后按如下条件进行30个循环94℃30sec，58℃45sec，72℃45sec；最后72℃5min。
取扩增产物2ul在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，溴化乙啶染色，紫外凝胶成像仪扫描，在600bp左右的位置处有一条亮带。
4、探针的回收采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收纯化探针。
5、探针标记探针标记为随机六聚体引物法，每1-2张膜加入步骤4的探针DNA约50-100ng和DNA分子量标记，加水14.5μl，100℃煮沸变性5min后立即置于冰浴中5min，瞬时离心，然后加入下列成分，终体积25μl，于37℃反应5h以上。
5×Oligo缓冲液5μlKlenow Fragment(5U/μl) 0.7μl10×缓冲液2.5ulBSA(10mg/ml) 1μlα-32P-dCTP(10mCi/ml)1.5μl
附1ml 5×Oligo缓冲液中含有160μl H2O250μl 1M Tris-HCl25μl1M MgCl25μl 1M巯基乙醇500μl 2M HEPES20μl100mM dATP20μl100mM dGTP20μl100mM dTTP10×缓冲液来自于Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.0(TaKaRa公司，Code No.D6045)6、预杂交和杂交反应根据要杂交的膜的数量配制预杂交液，每10ml预杂交液的成分组成如下。
ddH2O 6.5ml5×HSB2mlDenHardt’sIII1ml*ssDNA(10mg/ml) 0.5ml*ssDNA为鲑鱼精DNA(Sigma)加入之前需变性煮沸10min后立即放冰上10min。
附5×HSB(pH6.8)分子量(MW)g/200mlNaCl(3M)58.44 35.064PIPES(0.1M) 302.4 6.048EDTA(20mM) 372.241.488Denhardt’sIIIg/100ml2％Gelatin22％Ficoll-400 22％PVP-360210％SDS 105％Na4P2O·10H2O 5将预杂交液混匀，于65℃预热至澄清后放入尼龙膜，65℃预杂交5-6h(新膜)；探针标记完后，加入等体积的0.4N NaOH溶液，混匀后于室温静置10min使探针变性，然后加入到预杂交液中，65℃杂交过夜；
7、洗脱将杂交完的膜从杂交管中取出放入洗脱盒中，加入少量洗液I(2×SSC/0.1％SDS)漂洗除去过量杂交液，然后用洗液I于45℃洗两次，每次20min；再用洗液II(0.2×SSC/0.2％SDS)于45℃洗两次，每次15min。洗液I洗过后，检测杂交信号与背景情况，再决定是否继续洗脱。用滤纸吸干洗好的膜，保鲜膜包好(注意除去气泡)；8、放射自显影在X-射线摄影暗盒中，将杂交膜置于增感屏上，在暗室中将X-光片放在杂交膜上，再放上另一张增感屏，压紧X-射线摄影暗盒，-70℃冰箱曝光7-15天。
Northern blot分析结果如图1A-图1D所示，表明在干旱条件下GmDREB3基因表达不受影响；受高盐(200mM NaCl)胁迫的诱导表达；不受冷胁迫、ABA(200uM)胁迫诱导GmDREB3基因表达。说明该基因受高盐诱导，不受干旱、冷胁迫、ABA诱导。
实施例3、EMSA检测GmDREB3的体外结合特异性1、GmDREB3基因的原核表达将GmDREB3基因的全长序列插入原核表达载体pGEX-4T-1(购自AmershamPharmacia Biotech公司)的多克隆位点EcoRI和XhoI中，由于pGEX-4T-1的多克隆位点前面有GST(谷胱苷肽)基因，这样GmDREB3与GST蛋白就形成了融合蛋白，将构建好的表达载体转化受体大肠杆菌BL21，37℃培养6小时后，向培养基中添加IPTG至终浓度为0.5mM诱导表达12h，收集菌体，超声裂解后于4℃、12000rpm离心20分钟，取上清进行SDS-PAGE电泳，结果检测到64.43KD的条带，表明融合蛋白(GmDREB3-GST)已表达。
使用MicroSpin GST Purification Module Kit(Amersham，product code27-4570-03)按说明书的步骤纯化GmDREB3-GST融合蛋白。
2、DRE探针的标记根据GmDREB3基因序列，合成如下DRE探针序列(以下探针序列中带下划线的碱基为DRE的核心碱基)DRE15’＞ATT TCA TGGCCGACCTGC TTT CATGGCCGACCT GCT T＜3’DRE25’＞AAG CAGGTCGGCCAT GAA AGC AGGTCGGCC ATG AAA T＜3’DREm1(1)5’＞ATT TCA TGGAAGACCTGC TTT CATGGAAGACCT GCT T＜3’DREm1(2)5’＞AAG CAGGTCTTCCAT GAA AGC AGGTCTTCC ATG AAA T＜3’DREm2(1)5’＞ATT TCA TGGCCTCACTGC TTT CATGGCCTCACT GCT T＜3’DREm2(2)5’＞AAG CAGTGAGGC CAT GAA AGC AGTGAGGCC ATG AAA T＜3’
DREm3(1)5’＞ATT TCA TGGTTTTTCTGC TTT CATGGTTTTTCT GCT T＜3’DREm3(2)5’＞AAG CAGAAAAAC CAT GAA AGC AGAAAAACCATGAAA T＜3’其中，DRE1和DRE2为野生型的DRE探针，DREm1、DREm2、DREm3为各种突变的DRE探针。
使用T4多聚核苷酸激酶(T4-Polynucleotide Kinase，T4-PNK)对DRE探针进行(γ-32P)dATP标记，标记体系如下H2O 18.6μL10×T4-PNK缓冲液(Promega公司)2.5μLDRE探针(浓度为1ug/ul)1μLT4-PNK(Promega公司)(5U/μL) 1μL(γ-32P)dATP(浓度为10u Ci/ul) 2μL37℃标记30分钟，加入1μL 0.5M EDTA终止反应，65℃10分钟灭活酶，4℃备用。
3、标记的DRE探针与纯化的GmDREB3-GST融合蛋白进行结合反应以GST蛋白为对照。
结合反应体系如下5×结合缓冲液 4uL纯化的GmDREB3-GST融合蛋白(浓度为0.5mg/ml)或GST蛋白(浓度为0.5mg/ml) 10uL一种标记的DRE探针 2uL50％甘油 2uLH2O 2uL其中，5×结合缓冲液成分如下12.5mMHEPES-KOH(pH 7.6)250mM KCl2.5mM DTT2.5mM EDTA。
结合反应在冰上进行30分钟，反应的同时配好的SDS-PAGE胶200V进行1小时的预电泳，结合反应后加入1μL上样缓冲液(0.025％溴酚兰)进行SDS-PAGE电泳，170V电泳1-2小时后卸下电泳板，将胶放到水中，在将胶上的水吸干后压X光片检测GmDREB3-GST融合蛋白与标记的DRE探针的结合特性。结果如图2所示，表明野生型DRE探针都可以和纯化的GmDREB3-GST融合蛋白结合，而突变型DRE探针都不能和GmDREB3-GST融合蛋白结合，结果证明纯化的GmDREB3-GST融合蛋白与DRE具有结合特异性，GmDREB是DREB类转录因子。图2中，m1为DREm1(1)和DREm1(2)突变探针，m2为DREm2(1)和DREm2(2)突变探针，m3为DREm3(1)和DREm3(2)突变探针，pro为野生型DRE1和DRE2探针，prob为不加蛋白的自由探针(DRE1和DRE2)。
实施例4、GmDREB3的体内结合特异性和激活特性一、将GmDREB3基因构建到表达载体YEP-GAP上1、获得GmDREB3基因编码氨基酸部分的全序列根据已克隆的GmDREB3基因的序列设计引物，引物末端分别加EcoRI和XhoI酶切位点，以实施例1中盐处理的铁丰8号的基因组DNA为模板，PCR扩增获得编码氨基酸部分的全序列，程序及体系如下引物序列GmDREB3FF5’TATCCCGGGACCCCAGACCAAATTGTTCAG 3’GmDREB3FR5’GCAGAGCTCGCGGCCGCTTGCAGAAGCAGCCAAAGACA 3’反应体系(50μl)模板(60ng/ul)0.5μldNTP(每种10mM) 1μl引物(每种25μM) 1ul10×缓冲液 5μlddh2O 42.1μlTaq(5U/μl) 0.4μl其中，10×缓冲液来自于TaKaRa Taq试剂盒(TaKaRa公司，Code No.DR100A)。
扩增条件(PTC-200)先94℃2min；然后按如下条件进行30个循环94℃30sec，58℃45sec，72℃70sec；最后72℃5min。
取扩增产物2ul在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，溴化乙啶染色，紫外凝胶成像仪扫描，结果在939bp左右的位置处有一条亮带。
采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收纯化PCR产物。
2、将GmDREB3基因构建到表达载体YEP-GAP上将步骤1中纯化的PCR产物和表达载体YEP-GAP(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.，1998)，用EcoRI(Takara)和XhoI(Takara)分别酶切4-6hr。采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收纯化酶切产物。将纯化的酶切PCR产物和酶切载体YEP-GAP连接4-8hr，取0.5μl连接产物，电击转化JM109菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，测序分析序列是否正确，得到含有GmDREB3基因的重组表达载体YEP-GAP-GmDREB3。
二、GmDREB3的体内结合特异性和激活特性的验证1、酵母报道子的构建将含有4个DRE元件的片段5’-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3’(DRE的核心序列TACCGACAT)分别构建到pHis-1载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)的PminHIS3启动子和pLacZi载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)PCYCI启动子上游，分别得到重组载体pHis-1-DRE和pLacZi-DRE，用Xho I和Nco I内切酶分别将pHis-1-DRE和pLacZi-DRE载体切成线状。先将线状pHis-1-DRE载体转化到酵母细胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)内，获得能在SD/His-培养基上正常生长的酵母转化子(Yeast transformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复DRE元件的pLacZi-DRE载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His-/Ura-培养基上，选择获得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常双重酵母报道子；将4个DRE元件的核心序列CCGAC突变成TTTTT(MDRE)，即5’-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3’，按正常的双重酵母报道子构建方法，再构建一个含4个MDRE盒的突变体双重酵母报道子。
2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析(1)接种酵母菌株(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)到1ml YPD液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50ml YPD液体培养基的三角瓶中，30℃/250rpm摇过夜，测OD600＝1.7-1.8(计数约4×107个/mL)；(2)取30ml步骤(1)过夜培养物接到300ml新鲜的YPD培养基中，30℃/250rpm培养，约3小时至OD600＝0.5±0.1，室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积1×TE悬浮，1000g/5min离心；(3)吸弃上清，用1.5ml新鲜配制的1×TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；(4)取出0.1ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液0.1μg表达载体YEP-GAP-GmDREB3、0.1mg ssDNA(鲑鱼精DNA，Sigma)、0.6mlPEG/LiAc高速振荡1分钟，30℃/200rpm振荡培养30分钟；
(5)加入70ul DMSO(sigma#D8779)，轻轻倒置混匀，42℃热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min；(6)吸弃上清，加入0.5ml 1×TE buffer悬浮细胞；(7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0,15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-选择性培养基上画线培养。
(8)平板的一半培养步骤1构建的正常双重酵母报道子，另一半培养步骤1构建的突变体双重酵母报道子，以便做对照分析。
(9)颠倒放置于培养箱中，30℃培养3-4天。结果发现在0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。
3、半乳糖苷酶活性检测(1)从0mmol/L 3-AT的SD/His-/Ura-/Trp-的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5ml菌液，3000rpm离心30s；(2)弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻10min，取出使其自然融解，加50ul Z/X-gal溶液，30℃温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。说明转录因子GmDREB3能与DRE顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子(包括PminHIS3启动子和PCYCI启动子)，促使报道基因表达。从而证明了GmDREB3的体内结合特异性和激活功能。
三、药剂配制(1)YPD液体培养基细菌培养用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)10g/L细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone) 20g/L调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃以后加入40％的葡萄糖，使其终浓度为20g/L。
(2)SD/His-/Ura-/Trp-选择性培养基不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base) 6.7g/L营养缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml琼脂粉(Bacteriological agar) 20g/L调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。
(3)营养缺陷型混合物(Drop-out mix)(10X)L-Isoleucine(异亮氨酸)300mg/LL-Valine(缬氨酸) 1500mg/L
L-Adenine(腺嘌呤) 200mg/LL-Arginine(精氨酸) 200mg/LL-Histidine Hcl monohydrate(组氨酸)200mg/LL-Leucine(亮氨酸) 1000mg/LL-Lysine Hcl(赖氨酸) 300mg/LL-Methionine(甲硫氨酸) 200mg/LL-Phenylalanine(苯丙氨酸) 500mg/LL-Threonine(苏氨酸)2000mg/LL-Tyrosine(酪氨酸) 300mg/L(4)1×PEG/LiAc50％(w/v)PEG3350 8ml10×TE buffer 1ml10×LiAc 1ml(5)10×TE Buffer100mM Tris-Hcl10mM EDTA，pH＝7.5121℃高压灭菌，室温保存。
(6)1×TE/LiAc10×TE buffer 1ml10×LiAc1mlddH2O 8ml(7)Z BufferNa2HPO4·7H2O 16.1g/LNaH2PO4·H2O5.5g/LKCl 0.75g/LMgSO4·7H2O 0.246g/L调节pH至7.0，121℃/15min灭菌，4℃保存。
(8)X-gal储存液(X-gal Stock Solution)用N，N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20℃贮存。
(9)含有X-gal的Z buffer缓冲液100ml(Z buffer with X-gal)，注意现用现配Z buffer 98mlβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol) 0.27mlX-gal储存液(X-gal stock solution)1.67ml
序列表<210>1<211>312<212>PRT<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))<400>1Met Gly Thr Ala Ile Asp Met Tyr Asn Ser Ser Asn Ile Val Ala Asp1 5 10 15Phe Leu Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Leu Met Lys Ala Leu Lys Pro Phe20 25 30Met Lys Ser Asp Tyr Phe Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser35 40 45Gln Pro Cys Ser Phe Ser Ser Asn Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Pro Ser50 55 60Ser Asn Gln Ile Lys Leu Asn Gln Leu Thr Pro Asp Gln Ile Val Gln65 70 75 80Ile Gln Ala Gln Ile His Ile Gln Gln Gln Gln Gln His Val Thr Gln85 90 95Thr Gln Thr His Leu Gly Pro Lys Arg Val Pro Met Lys His Ala Gly100 105 110Thr Ala Ala Lys Pro Thr Lys Leu Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg His115 120 125Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Pro Lys Asn Arg Thr Arg130 135 140Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala Leu Ala Tyr145 150 155 160Asp Asn Ala Ala Phe Lys Leu Arg Gly Glu Phe Ala Arg Leu Asn Phe165 170 175Pro His Leu Arg His His Gly Ala Phe Val Phe Gly Glu Phe Gly Asp180 185 190
Tyr Lys Pro Leu Pro Ser Ser Val Asp Ser Lys Leu Gln Ala Ile Cys195 200 205Glu Ser Leu Ala Lys Gln Glu Glu Lys Pro Cys Cys Ser Val Glu Asp210 215 220Val Lys Pro Val Ile His Ala Ala Glu Leu Ala Glu Val Glu Ser Asp225 230 235 240Val Ala Lys Ser Asn Ala Glu Tyr Val Tyr Pro Glu Phe Glu Asp Phe245 250 255Lys Val Glu His Glu Asn Pro Met Phe Ser Gly Glu Ser Ser Ser Pro260 265 270Glu Ser Ser Val Thr Phe Leu Asp Phe Ser Asp Phe Ser Asp Ser Asn275 280 285Asn Gln Trp Asp Glu Met Glu Asn Phe Gly Leu Glu Lys Phe Pro Ser290 295 300Val Glu Ile Asp Trp Glu Ala Ile305 310<210>2<211>939<212>DNA<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))<400>2atgggaactg ctatagacat gtacaacagc agcaacatcg tagcggattt cctagatccg 60tatagtgaag agctgatgaa agcacttaag ccttttatga aaagtgatta tttctctgcc 120tcttcttctt cttcactcga atcacagcct tgttcttttt catctaattc tctccccact 180tcgtatccct cttccaacca aatcaagctc aaccaactca ccccagacca aattgttcag 240attcaggccc aaatccacat tcagcagcag cagcagcacg tgacccaaac ccaaacccac 300ctgggcccaa aacgcgtccc catgaagcac gctggcacgg ccgcgaaacc cacgaagctc 360taccgcgggg tgcggcaacg gcattggggc aagtgggtcg ctgaaatcag actcccaaag 420aaccgcacgc gcctctggct aggaacattc gacaccgcag aggaagcagc attagcgtac 480
gacaacgcag cgtttaagct cagaggcgag ttcgcgcgtc tcaattttcc tcatctaaga 540caccacggag ccttcgtttt cggcgagttc ggagattaca agcctctacc ttcttccgtg 600gattccaaac tgcaagctat ttgcgaaagc ttagcgaaac aagaggaaaa gccgtgttgc 660tccgtcgaag acgtgaagcc cgtgatacac gctgctgagc tggcagaggt cgagtctgac 720gtggcaaaat cgaacgctga atatgtttat cccgagttcg aggattttaa ggtcgagcac 780gagaacccaa tgttttctgg tgaatcttct tcgcctgaat ccagtgttac tttcttggat 840ttctcggact tctcggattc taataatcag tgggatgaaa tggagaattt tgggttggag 900aagttccctt ctgtggagat tgattgggaa gctatatga939
权利要求
1.植物脱水应答元件结合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述序列表中SEQ ID №1的自氨基端第120-177位为AP2/EREBP结构域。
3.编码权利要求1或2所述植物脱水应答元件结合蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于它具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求3或4所述植物脱水应答元件结合蛋白基因的植物表达载体。
6.含有权利要求3或4所述植物脱水应答元件结合蛋白基因的细胞系。
7.含有权利要求3或4所述植物脱水应答元件结合蛋白基因的宿主菌。
8.扩增权利要求3或4所述基因中任一片段的引物。
9.权利要求1或2所述的植物脱水应答元件结合蛋白在培育抗逆性提高的植物中的应用。
10.权利要求3或4所述的植物脱水应答元件结合蛋白基因在培育抗逆性提高的植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因与应用。该结合蛋白为具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质或为将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。其编码基因为序列表中SEQ ID №2的DNA序列；或编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。该蛋白及其编码基因可用于培育抗逆性提高的植物。
文档编号C12N15/63GK1796407SQ20041010347
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者陈明, 马有志, 李连城, 王巧燕, 徐兆师, 程宪国 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所