专利名称：：预防鸡堆型艾美耳球虫的免疫调节型dna疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物兽药
技术领域：
，是一种具有预防鸡堆型艾美耳球虫病作用的免疫调节型的DNA疫苗。本疫苗含有堆形艾美耳球虫(&wen'fl"cen;^'wfl)乳酸脱氢酶(LDH)基因和鸡白细胞介素-2基因(chlL-2)。本疫苗包含有多个T细胞免疫应答元件。
背景技术：
：鸡球虫病是一种专性细胞内寄生的原虫病，是约化养鸡业最为多发、危害最为严重的且防治困难的疾病之一，堆形艾美耳球虫(及w^7'aacerraZ/wa)就是其中重要病原只一。迄今为止，鸡球虫病的防治主要依赖于药物的预防，但是抗药性、药物残留等问题的出现，使得抗球虫药的使用大大受到限制。因此利用免疫预防来代替药物防治控制球虫病己经成为寄生虫学界的共识。目前，己经商品化的鸡球虫疫苗有活毒苗和弱毒苗，但是强毒苗和致弱球虫苗存在稳定性差、接种量难以控制等问题。随着分子生物学和现代生物技术的发展，DNA疫苗以其独特的优势显示其在未来畜禽疫病控制中的诱人前景。特别是在球虫免疫过程中，细胞免疫占主要作用，而DNA疫苗能够诱导强烈的细胞免疫反应，因此，DNA疫苗作为新型预防家禽球虫病的措施逐渐受到重视。Schaap等(DSchaap,GArts,JKroeze,etal.AnEimeriavaccinecandidateappearstobelactatedehydrogenase;characterizationandcomparativeanalysis.Parasitology.2004，128:603-616)鉴定了分子量为37kDa的￡acerKi/"'/7a乳酸脱氢酶(LDH)蛋白，该蛋白主要在子孢子阶段和第一代裂殖体阶段表达，对球虫感染的有一定保护性，说明LDH是一种很有潜力的疫苗抗原。本实验室用堆型艾美耳球虫LDH基因构建了核酸疫苗，并在动物实验中获得了良好的保护效果。鸡感染球虫后会产生多种细胞因子，这些细胞因子多数在体内或体外有抑杀球虫的作用，研究较多的是鸡Y干扰素(chIFN-Y)和鸡白介素2(chlL-2)。鸡y干扰素的产生及其活性虽然没有特异性，但据Kaspers的研究(KasperB,LillehojHS,JenkinsMC,etal.Chickeninterferon-mediatedinductionofmajorhistocompatibilitycomplexClassIIantigensonperipheralbloodmonocytes.VetImmunolImmunopathol1994;44:71-84.)，它可以通过激活淋巴细胞和促进主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原的表达来调节特异性免疫。鸡Y干扰素在体外可抑制鸡成纤维细胞和巨噬细胞内￡.te^Z/a的发育。鸡IL-2是另一个重要的细胞因子，鸡初次和再次感染acerv"/,'wa，脾和十二指肠的IL-2mRNA显著增多，也使十二指肠TCR1细胞的百分比升髙。Gaarter等(CaarterLL，etalRegulationofTcellsubsetsfronmnativetomemory.JImmunol.1998;21(3):181-187.)报道在感染第3天和第5天给鸡注射IL-2可使卵襄排出量降低。这些结果提示球虫抗原对鸡IL-2的产生具有潜在的刺激作用，而这种细胞因子具有广泛的免疫调节功能，若能诱导它们大量产生，则对宿主抗球虫感染十分有利。本发明利用鸡IL-2基因作为佐剂连接到球虫抗原基因上，旨在增强DNA疫苗的免疫效果。
发明内容技术问通本发明的目的在于提供一种有预防或治疗鸡球虫病作用的复合免疫调节型的DNA疫苗。该DNA疫苗编码鸡堆型艾美耳球虫多阶段部分抗原(子孢子和第一代裂殖体阶段抗原)，编码的抗原含有集中的T细胞表位。并且连接有chlL-2基因作为免疫佐剂。将cML-2基因与球虫保护性基因一起引入真核质粒，能够进一步增强所述球虫保护基因的免疫保护效果。技术方案预防鸡堆型艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗，该疫苗包含其中插入鸡堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶基因(LDH)整个开放阅读框，核苷酸序列分别为SEQIDNO.l的第1-990个碱基。该DNA疫苗还包含鸡白细胞介素-2(cML-2)基因，核苷酸序列为SEQIDNO.l的第1009-1440个碱基，并在chIL-2基因的5'端引入了一段蛋白酶凝血因子Xa特异性水解序列编码基因，核苷酸序列为SEQIDNO.l的第991-1008个碱基。其中cWL-2基因、cWL-2基因的5'端引入了一段凝血因子Xa特异性水解序列的编码基因与权利要求1所述基因SEQIDNO.l的第1-990个碱基连接在一起组成一融合基因pVAX-LDH-IL-2，其核苷酸序列为SEQIDNO.l。其中所用的真核质粒载体为pVAXl、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax。该DNA疫苗可以在制备预防或治疗鸡球虫病的药物制剂中应用。有益效果本发明部分建立在本实验室下列发现之上含有堆型艾美耳球虫第一代裂殖体阶段抗原基因LDH的真核质粒载体能够为鸡提供针对堆型艾美耳球虫的有效免疫保护；将cML-2基因与球虫保护性基因一起引入真核质粒,能够进一步增强所述球虫保护基因的免疫保护效果。在本发明的另一个方面，提供了一种生产鸡堆型艾美耳球虫复合免疫调节型DNA疫苗的方法。简而言之，其技术路线如下1.克隆堆形艾美尔球虫(￡.fl"n;M/z>^)乳酸脱氢酶(LDH)基因并进行测序。2.构建E.acm;M/z'"fl核酸疫苗重组质粒pVAX-LDH、pVAX-LDH-IL2(流程见附图4—8)3.重组质粒的体内检测4.动物免疫保护性实验本发明具有以下优点和效果1.该疫苗是DNA疫苗，与传统疫苗相比，具有安全性高、在体内维持时间长、制备简单、热稳定性良好、便于贮藏和运输、使用省时省力等优点。2.鸡球虫的生活史复杂、基因组庞大，不同发育阶段的免疫原性和抗原构成都有差异。该疫苗包含编码鸡堆型艾美耳球虫子孢子和第一代裂殖体阶段抗原的基因，与单阶段抗原基因相比，能够诱导更为全面、强烈的免疫应答反应。3.鸡感染球虫后会产生多种细胞因子，包括chlL-2。这些细胞因子在免疫反应中具有广泛的调节作用，并且多数在体内或体外有抑杀球虫的作用。该疫苗含有chlL-2基因，增强了该疫苗的免疫保护效果。试验证明，复合免疫调节型DNA疫苗pVAX-LDH-IL-2在抗球虫感染中，具有良好的免疫保护效果。图1为本发明堆型艾美耳球虫复合免疫调节型DNA疫苗的结构示意图图2为重组质粒pMD18-T-LDH的构建流程图图3为重组质粒pET28a-LDH的构建流程图图4为重组质粒pVAX-LDH的构建流程图图5为重组质粒pMD18-T-LDH(不含LDH终止密码子)的构建流程图图6为重组质粒pVAX-LDH(不含LDH终止密码子)的构建流程图图7为重组质粒pVAX-IL-2的构建流程图图8为重组质粒pVAX-LDH-IL-2的构建流程图图9为pVAX-LDH、pVAX-LDH-IL-2的酶切鉴定图M:DNA分子量标准物DL2000;1,7:pVAX-LDH、pVAX-LDH-IL-2的5awHI和￡coRI双酶切鉴定(LDH，1007bp);2,10:pVAX-LDH、pVAX-LDH-IL-2质粒对照；8:pVAX-LDH-IL-2的五coRI和J;7al双酶切鉴定(IL-2,445bp);9:pVAX-LDH-IL-2的5awHI和Jpal双酶切鉴定(LDH-IL-2，1452bp)。图10为pVAX-LDH、pVAX-LDH-IL-2的RT-PCR检测图M:DNA分子量标准物DL2000;5h空白对照2,4:分别为注射pVAX-LDH质粒、pVAX-LDH-IL-2质粒，以LDH为引物的扩增产物；5:注射pVAX-LDH-IL-2质粒以IL-2为引物的扩增产物。实施例基础材料1.孢子化卵囊江苏株堆型艾美耳球虫孢子化卵囊(E3cern/h'"a卵囊)(索勋，李国淸.鸡球虫病学[M].北京:中国农业大学出版社，1998.本实验室对外提供)，每三个月经鸡体复壮并孢子化，孢子化率在80%以上。2.实验动物O日龄的小公雏购自南京种鸡场，自出壳至实验结束时饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由采食和饮水。3.质粒与菌种宿主菌五.co/,'DH5a、BL21(购自Invitrogen公司)、质粒PET28a(购自Novagen公司)、真核表达载体pVAXl(购自Invitrogen公司)；pMD18-Tvector克隆载体，购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司4.工具酶与试剂Trizol试剂为Promega公司产品；DEPC为Amresco公司产品；P-巯基乙醇为Fluka公司产品；反转录酶AMV、01igo(dT)18、rTaq酶、dNTP、DNA分子量标准物DL2000、T4DNALigase、限制性内切酶，水饱和酚、琼脂糖胶回收试剂盒均为大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司产品；其余试剂为国产分析纯。5.主要仪器设备冷冻台式离心机(EppendorfcentrifUge5417R);紫外可见分光光度计(Bio-Rad);PCR仪(HYBAID公司)；空气浴摇床(THZ,江苏太仓市实验设备厂)；紫外分析仪(WD-9304C型，北京市六一仪器厂)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)。实施例l.LDH基因的制备1.1合成引物根据LDH的公开的核苷酸序列(GenBank登记号AY143388),利用软件primerpremier5.0设计特异性引物Pl、P2,并送往大连宝生物(TaKaRa)合成引物。序列如下Pl:5'-GGATCC!ATGlGCGGTCTTCGAGAA-3':P2:5'-SMO￡GCTGCTGCTTACTTGGAT-3'其中下划线部分分别为引入的酶切位点BawHI和五coRI,;方框部分为起始密码子。1.2￡3ce/rw"'/7a第一代裂殖体的提取①用108个￡acerw/h'朋卵囊感染无球虫感染鸡，42小时后取十二指肠。②用不含钙、镁的Hanks溶液(NaCl8.000g,KC10.4026g，KH2P040.06g,Na2HP040.0482g,D-glucosel.Og,NaHC030.3528g，PH调至7.4,定溶为1L)冲洗十二指肠，并将其剪碎，用Hanks溶液悬浮。③用含EDTA(lmmol/L)的Hanks溶液(NaCl8.000g,KC10.4026g,CaCl2-2H200.1912g,MgS04*7H200.1972g,KH2P040.06g，Na異0.0482g,D-glucose1.0g,NaHC030.3528g，PH调至7.4,定溶为1L)处理上述悬浮液10min，使肠上皮细胞释放出来。④离心(400g，5min)收集细胞。用含0.1%皂角苷的Hanks溶液处理上述细胞15min，并用注射器进行机械剪切，使裂殖体从上皮细胞释放出来。用45%(w/v)Percoll离心(700g，20min,4'C)收集裂殖体。U第一代裂殖体总RNA的提取取￡acerwh'"a第一代裂殖体O.lg(约107个)置玻璃匀浆器中，加入lmlTrizol试剂，研磨5分钟使卵囊壁破裂，一步法提取子孢子总RNA。具体步骤如下将匀浆后溶液置1.5mleppendorf管中，加入0.2mL24:l的氯仿/异戊醇混合物，用力摇动样品15s，置冰上5min,4"C12000转离心15min,小心将含有RNA的水相(上层)转到另一eppendorf管中并置冰上，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀样品并置室温10min,4"C12000转离心15min，RNA在试管底形成黄白色沉淀，小心去掉异丙醇，加入lml70%乙醇洗涤RNA沉淀，通过摇晃或吸打使RNA沉淀重新悬浮，4'C12000转离心8min，去掉乙醇，室温干燥，测A260/A280比值，加入20^1DEPC处理过的水，置-20'C保存。1.4cDNA的合成按下列比例加入试剂合成cDNA第一链-总RNA2.0nl50(Hig/mlOligo(dT)l.Opl上述试剂混匀后75'C放置5分钟，立即置冰上冷却，再加入下列成分10mmol/LdNTP2単RNASin(TaKaRa公司)1.0^15xRTbuffer4.0^15U/jUAMV1.5pl25mmol/LMgCL22.0nl用无RNase水补至20nl混匀，低速瞬时离心，甩下管壁上的液滴，42°0反应lh。95'C5min灭活反转录酶。反转录产物立即进行PCR或-20'C保存备用。1.5LDH基因的PCR扩增在薄壁PCR管中加入下列成分进行PCR扩增:cDNA1%12.5mmol/LdNTPPl(50pmoDl.OulP2(50pmo1)10xPCRbuffer25mmol/LMgCL22.5plT叫DNA聚合酶(5U/^1)0.5nlddH2014.5^1总计将上述成分离心混匀后，于PCR仪上94'C变性5min;94'C70sec，51X:70sec，72'C70sec，共30个循环；然后72'C延伸15min。1.6￡acerrah'朋LDH基因的克隆(见图2)取上述获得的PCR产物25W，1%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切下目的条带处琼脂糖凝胶，用大连宝生物公司的胶回收试剂盒回收纯化目的片段，方法参照说明书。取纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，反应体系如下PCR回收产物4.5nlpMD18-T载体Ligationsolutioni5.0mJ总体积lO.Ojil将上述成分在薄壁eppendorf管中混合均匀后16'C连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,挑取阳性克隆菌，提取质粒，用5a加HI和五coRI双酶切鉴定，用P1、P2引物PCR鉴定及测序等鉴定，确定为pMD18-T-LDH，经测序表明，扩增得到的LDH基因具有如SEQE)NO:1中第1-990位所示的核苷酸序列。实施例2.dna疫苗的制备2.1重组质粒pVAX-LDH的构建(见图4)分别用5flOTffl和五coRI双酶切克隆质粒载体pMD18-T-LDH和pVAXl,回收LDH目的基因(约1000bp)和pVAXl大片段(约3000bp)，按照合适比例(摩尔比1:1)进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21,提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，确定为pVAX-LDH。2.2重组质粒pVAX-LDH-IL-2的构建(见图5-8)2.2.1合成引物为构建串联细胞因子的重组质粒，利用软件primerpremier5.0设计不含终止密码子的特异性引物P3，加入凝血因子Xa特异性水解序列编码核苷酸序列(方框部分)，下划线部分为引入的酶切位点五coRI。由大连宝生物(TaKaRa)合成引物。引物P3序列如下P3:5'-QMHdCCTACCCTCGAilCTTGGATGCATCAA-3'2.2.2构建pVAX-LDH-IL-2DNA疫苗以pMD18-T-LDH为模板，Pl、P3为引物，进行PCR扩增，获得不含终止密码子的LDH基因，回收纯化目的片段，再与pMD18-T载体连接构建新的pMD18-T-LDH质粒，用酶切、PCR和测序进行鉴定。用5awHI和五coRI双酶切新构建的pMD18-T-LDH质粒和pVAXl，回收LDH目的基因和pVAXl大片段，连接构建新的pVAX-LDH质粒。用五coRI和力flrl双酶切质粒pcDNA3.lb-TA4-IL-2(QianmingXu^XiaokaiSong^LixinXUjRuofengYan，MohammedAliA.Shah，XiangruiLi.VaccinationofchickenswithachimericDNAvaccineencodingEimeriatenellaTA4andchickenIL-2inducesprotectiveimmunityagainstcoccidiosis.VeterinaryParasitology,2008，156(34):319-323)和pVAXl，回收IL-2目的基因(约450bp)和pVAXl大片段(约3000bp),连接构建pVAX-IL-2质粒。用￡coRI和却al双酶切新构建的pVAX-LDH质粒和pVAX-IL-2质粒，回收pVAX-LDH大片段(约3900bp)和IL-2小片段(约450bp)，按照合适比例(摩尔比l:1)进行连接，经酶切、PCR鉴定(见图9)，确定为pVAX-LDH-IL-2DNA疫苗。实施例3.DNA疫苗在鸡体内表达情况的检测分别提取pVAX-LDH和pVAX-LDH-IL-2重组质粒，经胸部肌肉注射14日龄雏鸡(100ug/只)，7天后分别取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)。3.1RT-PCR检测DNA疫苗的转录一步法提取肌肉总RNA,加入DNaseI除去残余的重组质粒和基因组DNA,用RT-PCR法分别扩增目的基因。结果表明DNA疫苗在鸡肌肉细胞内获得了转录(见图10)。3.2Westemblot检测DNA疫苗的翻译3.2.1重组pET28a-LDH蛋白抗血清的制备用丑a/nHI和5coRI双酶切实施例1中获得的pMD18-T-LDH质粒和pET28a载体，回收纯化酶切产物，连接构建pET28a-LDH重组质粒(见图3)，用酶切、PCR和测序进行鉴定，确定为pET28a-LDH。将pET28a-LDH转化入大肠杆菌BL21进行原核表达，当细菌OD600为0.5时，用异丙基-e-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，6h后收集细菌进行超声波裂解，纯化包涵体，并进行SDS-PAGE分析。将纯化的包涵体用弗氏佐剂乳化后，在SD大鼠背部皮下注射免疫(200Ug/只)，首次免疫和二次免疫相隔15天，之后每隔78天加强免疫1次。用ELISA检测血清效价，收集高免血清，置-20卩保存备用。3.2.2Westernblot检测分别取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)制样，SDS-PAGE电泳后转印硝酸纤维素膜，洗涤后加入5%脱脂奶粉封闭无关蛋白结合位点1小时，然后加入抗重组蛋白免疫大鼠血清(一抗)作用1小时，洗涤缓冲液洗涤后加入HRP标记的羊抗大鼠抗体(二抗)作用1小时，最后DAB显色液显色。结果发现DNA疫苗在鸡肌肉细胞内获得了很好的表达。实施例4.免疫保护性实验1.实验设计(见表l)150羽1日龄雏鸡，随机分为5组，每组30羽，设立非感染非免疫组(第一组)、感染非免疫组(第二组)、空载体对照组(第三组)、pVAX-LDH(第四组)、和pVAX-LDH-IL-2(第五组)。14日龄和21日龄时分别肌肉注射100ulTE(第一组)、100ulTE(第二组)、100ulpVAXl(第三组)、100ugpVAX-LDH(第四组)、100ugpVAX-LDH-IL-2(第五组)。28日龄时除第一组外其余各组经口感染￡//nen'aflcervw/i'朋孢子化卵囊(1》105个/羽)。35日龄逐只称重，全部扑杀，分别取每只鸡的十二指肠，进行病变记分和卵囊计数，对免疫保护效果进行统计分析。2.免疫保护效果的观察2.l.增重效果平均增重1-攻虫时重一首免时重平均增重2=宰杀时重一攻虫时重增重率=(宰杀时平均体重一攻虫时平均体重)/攻虫时平均体重X100%2.2.0PG值(克盲肠内容物卵囊数).卵襄值的转换方法盲肠内容物卵囊百万数x0.4按麦克马斯特法计算卵囊，具体为攻虫后第6天，宰杀全部鸡，逐羽取其盲肠内容物，各取2g,加10mL水，搅匀，然后再加50mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满两个计数室，静止1-2分钟，镜检计数两个计数室的卵囊数。计数室容积为IXIX0.15=0.15mL,0.15mL内含粪便2X0.15/(10+50)=0.005g，两个计数室则为O.Olg所得卵囊数乘100即为OPG值。2.3.盲肠病变记分攻虫后第6天，宰杀全部鸡只，逐羽观察盲肠病变，并按Johnson方法进行十二指肠病变记分。即将十二指肠病变分为0"+4五个等级。O分表示正常，无肉眼病变；+1分十二指肠有小淤点；+2分十二指肠和小肠前半段有白色病变；+3分小肠前半段有白色病变，水肿；+4分出血，白色病变融合，死亡鸡只也记+4分。2.4.抗球虫指数(ACI)ACI是包括存活率、增重、病变、卵囊产量等多项参数，综合评定后作为判定球虫耐药性或药物效力的指标，也可用于球虫疫苗保护效果检测的指标。但是，不同的研究者在计算ACI采用的参数指标、计算方法和判定标准不尽相同，我们采用如下ACI判定公式进行判定。ACI=(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)存活率=(实验结束时存活鸡只数/实验组鸡只数)xioo%相对增重率=(实验组增重率/非感染非免疫组增重率)X100%病变值(040)=各实验组的平均病变记分(04)X10卵囊值(040)按上述方法计算以ACI^180为保护效果明显，ACI=160179为保护效果一般，ACK160为无保护效果。2.5.卵襄减少率卵囊减少率=(红对照卵囊产量一实验组卵囊产量)/红对照卵囊产量乂100%3.免疫保护效果分析(见表l)从平均增重看来，疫苗组明显高于感染非免疫组和空载体对照组，差异显著p〈0.05，而且pVAX-LDH-IL-2组高于pVAX-LDH组。pVAX-LDH-IL-2组的卵囊减少率最高，达到57.6%。pVAX-LDH-IL-2组的平均盲肠病变记分最低，ACI最高，分别为168.78,有一定的免疫保护效果。感染非免疫组和空载体对照组ACI小于160,没有免疫保护效果。综上所述，pVAX-LDH和pVAX-LDH-IL-2的抗球虫指数分别为162.50和168.78，在抗球虫感染中，具有一定的免疫保护效果。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax代替真核质粒载体pVAXl是本领域技术人员可以做到的。大家都知道，作DNA疫苗，真核表达载体差别不是太重要，关键是目的基因，有了pVAX-LDH-IL-2，就很容易得到pcDNA3.0-LDH-IL-2，pcDNA3.1-LDH-IL-2和pcDNA4/HisMax-LDH-IL-2，而且免疫保护效果不会差别太大。序列表<110>南京农业大学<120>预防鸡堆型艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗〈130>说明书<140>00<141>2008-10-18<160〉4<170>Patentlnversion3.1<210>1〈211〉函<212>DNA<213>人工合成<220>〈221>融合基因pVAX-LDH-IL-2<222>(l)..(函)<223〉<400>18tggCggtCttcg8gaag幼tacacgccccaag8ttgctatggtgggctccggtatgatt60ggaggcaccatggctttcctgtgC8gCttg鄉卿ctcggggatgttgtcctcttcgac120gttgtsccaaeicatgccgatgggga鄉cgatggatatatcgcacaattcgtcggtggtt180g8icacgggtataacagt8t3cggctcet幼ttcatacgagtgcttg卿ggtgcggacgta240gtaataataac明caggg8taacaaagatacccggaaagagcg8taaaga3tggtCt卿3008tggatctattacctgtg肌tataaagata8tg&ggg8ggtcggtgcagcaattaaatct360tactgtccta8tgC8tttgtacaaatccttt卿tgtgatggtetgctgct420cttcaagagtcatcaggactacctcatcettagastctgcggtatggctgggatgcttgat480agctctcgttttageicgtataatagctgataaatt8gaagtctctcctagagatgtacag540gggatggtcat鄉tgt8C3cggcgatcatatggtgcccctaagteig8t8tgcaacagtt600aacggcatcccgctagctgsigtttgttaag幼gggctggatC幼gC8LBgELagaagtagat660gatattgttcagaagactaaggtcgctgg8ggagagatcgtacgcctatt鄉ac卿gc720tctgcttactatgctccaggggcttcagctattccgatggctgagagctatctaaaggat780agaaagagagtg8tggtttgctcttgcteicttgcaaggacaatacggtgt8caga8tC8c840tacttaggagtaccttgtgttatcggtggg卿ggtgttgag卿attattgagtt柳a900ttgaccgcacacgB肪gac8ggagcttcaggggttctatcgatg鄉ttaagg聊tgcag960卿gctattgctgctcttgeitgcatcc卿at柳gggaagggaattcatgatgtgcaaa1020gt8ctgatctttggctgtatttcggteigcaatgct肪tgactacagcttatggagcatct1080ctatcatcag幼aaeitgg肪aactcttcaaacattaataaaggattt鄉aateittggaa1140a8t8tc肌ga8t肪gattC8tctcgagctct8cacacc肪ctgagacccaggetgtgcacc1200cagcaaactctgcagtgttacctgggagaagtggttactctgaagaaagaaactgaagat1260gacactgaaattaaagaagaatttgtaactgctettcaaaatatcgaaaagaacctcaag1320agtcttacgggtctaaatcacaccggaagtgaatgcaagatctgtgaagctaacaacaag1380aaaaaatttcctgattttctccatgaactgaccaactttgtgagatatctgcsaaaataa1440〈210〉2〈211>23<212>腿<213>人工合成〈220〉<221>引物P1〈222>(l)..咖<223><400>2ggatccatggcggtcttcgagaa23<210>3<211>24<212>DNA<213>人工合成<220><221>引物P2<222>(1),.(24)〈223>〈400〉3gaattcgctgctgcttecttggat24<210>4<211>32<212>腿<213>人工合成<220><221〉引物P3〈222〉(l).,咖<223>〈400>4gaattccctaccctcgatcttggatgcatcaa3权利要求1、一种鸡堆型艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗，该疫苗包含其中插入的鸡堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶基因LDH整个开放阅读框，核苷酸序列为SEQIDNO.1的第1-990个碱基。2、根据权利要求1所述的DNA疫苗，其中进一步还包含鸡白细胞介素-2即chlL-2基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.l的第1009-1440个碱基；并在chlL-2基因的5'端引入了一段凝血因子Xa特异性水解序列的编码基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.l的第991-1008个碱基。3、根据权利要求2所述的DNA疫苗，其中chlL-2基因、chlL-2基因的5，端引入了一段凝血因子Xa特异性水解序列的编码基因与权利要求1所述基因SEQIDNO.l的第l-9卯个碱基连接在一起组成一融合基因pVAX-LDH-IL-2，其核苷酸序列为SEQIDNO.l。4、根据权利要求1-3中任一项所述的DNA疫苗，其中所用的真核质粒载体为pVAXl、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax。5、权利要求1-4中任一项所述的DNA疫苗在制备预防或治疗鸡球虫病的药物制剂中的应用。全文摘要本发明涉及一种鸡堆型艾美耳球虫(Eimeriaacervulina)免疫调节型DNA疫苗，属于生物兽药
技术领域：
。利用分子生物学技术将堆型艾美耳球虫第一代裂殖体抗原乳酸脱氢酶的基因(lactatedehydrogenase(LDH))和鸡白细胞介素-2(chIL-2)基因进行串连，构建了融合表达疫苗pVAX-LDH-IL-2。本疫苗包含有多个T细胞免疫应答元件，能够有效地预防和治疗鸡的球虫病。文档编号A61K39/012GK101422604SQ200810155079公开日2009年5月6日申请日期2008年11月3日优先权日2008年11月3日发明者严若峰,宋小凯,宋鸿雁,徐立新,李祥瑞申请人:南京农业大学