预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型dna疫苗的制作方法

专利名称：：预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型dna疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种具有预防鸡毒害艾美耳球虫病作用的免疫调节型的DNA疫苗，属于生物兽药
技术领域：
。是本疫苗含有毒害艾美耳球虫(五^er/""ec^r/x)子孢子表面抗原NA4基因和鸡白细胞介素-2基因(chlL-2)。本疫苗包含有多个T细胞免疫应答元件。
背景技术：
：鸡球虫病是艾美耳球虫寄生所引起的原虫病，病原有毒害艾美耳球虫(五.weo^/x)、柔嫩艾美耳球虫C&fc"e//^、堆型艾美耳球虫(五.wecflr/x)、巨型艾美耳球虫CE.wax/wa)、布氏艾美耳球虫CE.6rawe衍)、早熟艾美耳球虫(E/raeco;c)、和缓艾美耳球虫(五.w跑)。其中毒害艾美耳球虫致病力很强，是工厂化养鸡危害最为严重的疫病之一，能引起鸡的消化功能障碍，生长发育迟缓，增重减慢，产蛋率下降。从20世纪40年代开始，各国主要采用抗球虫药为常规的饲料添加剂进行预防，这种方法的缺点是球虫会产生抗药性,在肉蛋产品中产生药残，损害人类健康。目前抗球虫药仍是防治鸡球虫病的主要手段，随着鸡球虫抗药性问题的日趋严重以及人们对食品安全的日益关注，人们期待用更理想的方法代替抗球虫药的使用。球虫活囊疫苗的成功研制和应用提供了一种可代替药物控制鸡球虫病的技术手段，但活疫苗不可避免地存在成本高、难保存、存在散毒及潜在的致病威胁等缺点。随着分子生物学和现代生物技术的发展，DNA疫苗以其独特的优势显示其在未来畜禽疫病控制中的诱人前景。特别是在球虫免疫过程中，细胞免疫占主要作用，而DNA疫苗能够诱导强烈的细胞免疫反应，因此，DNA疫苗作为新型预防家禽球虫病的措施逐渐受到重视。鸡球虫保护性抗原基因的克隆是基因工程疫苗及核酸疫苗研究的基础。鸡球虫的生活史复杂、基因组庞大，不同发育阶段的免疫原性和抗原构成都有差异。Jeurissen等(1996)研究表明子孢子是免疫有关的最重要的发育阶段(JeurissenSHM，JanseEM,VermeulenAN,etal.五/附en'afewe〃ainfectionsinchickens:aspectsofhost-parasite:interaction.VetImmunolImmunopathol1996;54:231-238.)。NA4是五.wecaW;c子孢子表面抗原，其重组蛋白对wcaWx经口感染雏鸡能产生部分保护力，其编码基因与柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊表面抗原TA4的基因具有高度同源性，并已证实TA4抗原可以减少卵囊排出数、降低盲肠病变记分等，在球虫免疫保护性方面效果较好(FeilsJQPaulLS，GabeJD.IdentificationandCharacterizationofgeneforamajorsurfaceantigenof5/附e"'afewe〃a.In:MoleclarstrategiesofParasticInvasion,UCLASymposiaonMolecularandCellularBiology,NewSeries,1987,42:713-723)。球虫感染鸡后，既可引起体液免疫应答也可引起细胞免疫应答，体液免疫主要通过腔上囊B淋巴细胞实现，细胞免疫主要是通过依赖胸腺的T淋巴细胞实现。分别摘除胸腺和腔上囊的实验结果表明抗体作用居于次要地位，而细胞免疫居于主要地位。T细胞免疫应答反应在球虫免疫应答中处于核心地位，T细胞反应与整个抗球虫免疫效应的表达过程密切相关。近年来的研究表明，作为控制鸡球虫病的新型策略---DNA免疫能够诱导机体产生长期的体液和细胞免疫抵抗多种疾病，包括球虫病。鸡感染球虫后会产生多种细胞因子，这些细胞因子多数在体内或体外有抑杀球虫的作用，研究较多的是鸡y干扰素(cMFN-tO和鸡白介素2(chlL-2)。鸡y干扰素的产生及其活性虽然没有特异性，但据Kaspers的研究(KasperB，LillehojHS,JenkinsMC,etal.Chickeninterferon陽mediatedinductionofmajorhistocompatibilitycomplexClassIIantigensonperipheralbloodmonocytes.VetImmunolImmunopathol1994;44:71-84.)，它可以通过激活淋巴细胞和促进主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原的表达来调节特异性免疫。鸡Y干扰素在体外可抑制鸡成纤维细胞和巨噬细胞内五.的发育。鸡IL-2是另一个重要的细胞因子，鸡初次和再次感染Eflc"TO//"a，脾和十二指肠的IL-2mRNA显著增多，也使十二指肠TCR1细胞的百分比升高。Gaarter等(CaarterLL，etal.RegulationofTcellsubsetsfronmnativetomemory.JImmunol.1998;21(3):181-187.)报道在感染第3天和第5天给鸡注射IL-2可使卵囊排出量降低。这些结果提示球虫抗原对鸡IL-2的产生具有潜在的刺激作用，而这种细胞因子具有广泛的免疫调节功能，若能诱导它们大量产生，则对宿主抗球虫感染十分有利。本发明利用鸡IL-2基因作为佐剂连接到球虫抗原基因上，旨在增强DNA疫苗的免疫效果。
发明内容技术问题本发明的目的在于提供一种有预防或治疗鸡球虫病作用的免疫调节型DNA疫苗。该DNA疫苗编码鸡毒害艾美耳球虫子孢子阶段抗原，编码的抗原具有较高的免疫原性，含有集中的T细胞表位。并且连接有cML-2基因作为免疫佐剂。将chlL-2基因与球虫保护性基因一起引入真核质粒，能够进一步增强所述球虫保护基因的免疫保护效果。本发明提供一种有预防或治疗鸡球虫病作用的免疫调节型DNA疫苗，该疫苗包含其中插入鸡毒害艾美耳球虫子孢子表面抗原NA4基因的开放阅读框，核苷酸序列为SEQIDNO.l的第1-744个碱基。该DNA疫苗还包含鸡白细胞介素-2(chIL-2)基因，核苷酸序列分别为SEQIDNO.l的第763-1194个碱基，并在chIL-2基因的5，端引入了一段凝血因子Xa特异性水解序列的编码基因，核苷酸序列为SEQIDNO.l的第745-762个碱基。chlL-2基因、cML-2基因的5'端引入的一段凝血因子Xa特异性水解序列的编码基因与所述NA4基因连接在一起组成一融合表达载体pVAX-NA4-IL-2。所述的真核质粒载体为pVAXl、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax。该DNA疫苗可以在制备预防或治疗鸡球虫病的药物制剂中应用。有益效果本发明部分建立在本实验室下列发现之上含有毒害艾美耳球虫子孢子表面抗原NA4基因的真核质粒载体能够为鸡提供针对毒害艾美耳球虫的有效免疫保护；将chlL-2基因与球虫保护性基因一起引入真核质粒，能够进一步增强所述球虫保护基因的免疫保护效果。在本发明的另一个方面，提供了一种生产鸡毒害艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗的方法。简而言之，其技术路线如下1.克隆毒害艾美尔球虫(五."ec"W;c)子孢子表面抗原NA4基因并进行测序。2.构建￡.wecfl^x核酸疫苗重组质粒pVAX-NA4、pVAX-NA4-IL2(构建流程见附图4一8)3.重组质粒在鸡体内表达的检测4.鸡免疫保护性实验本发明具有以下优点和效果1.该疫苗是DNA疫苗，与传统疫苗相比，具有安全性高、在体内维持时间长、制备简单、热稳定性良好、便于贮藏和运输、使用省时省力等优点。2.鸡球虫的生活史复杂、基因组庞大，不同发育阶段的免疫原性和抗原构成都有差异。该疫苗包含编码鸡毒害艾美耳球虫子孢子阶段抗原，能够诱导强烈的免疫应答反应。3.鸡感染球虫后会产生多种细胞因子，包括chlL-2。这些细胞因子在免疫反应中具有广泛的调节作用，并且多数在体内或体外有抑杀球虫的作用。该疫苗含有chlL-2基因，增强了该疫苗的免疫保护效果。试验证明，免疫调节型DNA疫苗pVAX-NA4-IL-2在抗球虫感染中，具有良好的免疫保护效果。图1为本发明毒害艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗的结构示意图图2为重组质粒pMD18-T-NA4的构建流程图图3为重组质粒pET28a-NA4的构建流程图图4为重组质粒pVAX-NA4的构建流程图图5为重组质粒pMD18-T-NA4(不含NA4终止密码子)的构建流程图图6为重组质粒pVAX-NA4(不含NA4终止密码子)的构建流程图图7为重组质粒pVAX-IL-2的构建流程图图8为重组质粒pVAX-NA4-IL-2的构建流程图图9为pVAX-NA4-IL-2的酶切鉴定图M:DNA分子量标准物DL2000;1.PVAX1.0-NA4-IL2重组质粒经过BamHI和EcoRI双酶切片段；2.PVAX1.0-NA4-IL2重组质粒经过EcoRI和ApaI双酶切片段；3.PVAX1.0-NA4-IL2重组质粒经过BamHI和ApaI双酶切片段；4.未经酶切的重组质粒图10为pVAX-NA4、pVAX-NA4-IL-2的RT-PCR检测图M:DNA分子量标准物DL2000;1.DNA疫苗pVAX1.0-NA4重组质粒注射部位的NA4基因RT-PCR(NA4基因引物)2.DNA疫苗pVAX1.0-NA4-IL-2重组质粒注射部位的NA4基因RT-PCR(NA4基因引物)4.DNA疫苗pVAX1.0-NA4-IL-2重组质粒注射部位的IL-2基因RT-PCR(IL-2基因引物)6.非注射部位肌肉的RT-PCR对照实施例基础材料1.孢子化卵囊江苏株毒害艾美耳球虫孢子化卵囊(K"M^r/jC)(索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京:中国农业大学出版社,1998.本实验室对外提供)，每三个月经鸡体复壮并孢子化，孢子化率在80%以上。2.实验动物0日龄的小公雏购自南京某种鸡场，自出壳至实验结束时饲养在严格消毒，无球虫的环境中，自由采食和饮水。3.质粒与菌种宿主菌￡co//DH5a、BL21(Invitrogen公司)，质粒pET28a(Novagen公司)、真核表达载体pVAXl(Invitrogen公司)；pMD18-Tvector克隆载体，购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司4.工具酶与试剂Trizol试剂为Promega公司产品；DEPC为Amresco公司产品；P-巯基乙醇为Fluka公司产品；反转录酶AMV、01igo(dT)18、rTaq酶、dNTP、DNA分子量标准物DL2000、T4DNALigase、限制性内切酶，水饱和酚、琼脂糖胶回收试剂盒均为大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司产品；其余试剂为国产分析纯。5.主要仪器设备冷冻台式离心机(EppendorfcentrifUge5417R);紫外可见分光光度计(Bio-Rad);PCR仪(HYBAID公司)；空气浴摇床(THZ，江苏太仓市实验设备厂)；紫外分析仪(WD-9304C型，北京市六一仪器厂)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)。实施例1.NA4基因的制备1.1合成引物根据柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原TA4基因核苷酸序列，利用软件primerpremier5.0设计NA4引物P1、P2，并送往大连宝生物(TaKaRa)合成引物。序列如下Pl:5'—GGGATCCATGGCTCGTCTCTCT—3'，P2:5'_GAATTCCTAGAAGAGAGCGAAA—3'。其中下划线部分分别为引入的酶切位点5awHI和五coRI，；方框部分为起始密码子。1.2毒害艾美耳球虫子孢子总RNA的提取采用一步法提取孢子化卵囊总RNA，具体操作步骤如下取纯化的五."ec"Wx孢子化卵囊约107个分别置于用DEPC处理过的无核酶的玻璃匀浆器中，加入lmlTrizol试剂，迅速研磨5分钟。将匀浆后溶液置于1.5mlEppendorf管中，室温下温育5min，加入200pL氯仿，剧烈震荡混匀静置10min;4°C，12000r/min离心15min，分三相，吸取上层水相转至新的Eppendorf管中，加入500pL异丙醇，混匀室温静置10min沉淀RNA，随后4°C12000r/min离心15min，去上清，加入75%乙醇洗涤沉淀两次，然后12000r/min离心5min。弃去液体待管壁稍干燥后加入用25pL无RNA酶DEPC处理的超纯水水溶解沉淀。紫外分光光度计测定RNA的含量及纯度。1.3cDNA的合成以上述的总RNA为模板，用oligodT18为引物进行反转录，合成cDNA第一链，反应体系为20nL:总RNA7pL，oligodT^L，混匀后75。C变性5min，迅速冰浴5min，再加入下列成分5xRTBuffer4^L，MgCl2(25mM)2.0pL，dNTP(10mM)2.0pL，M-MLV反转录酶(5U/pL)1.0pL，RNasin(40U/pL)1.0pL，无RNase水补至20^L。充分混匀，42°C反应lh。95'C5min灭活反转录酶。1.4NA4基因PCR扩增以反转录产物为模板，采用以下反应体系进行PCR:cDNA模板2.5tiL，10xPCRBuffer2.5nL，MgCl2(25mM)1.5pL，上游引物P1(50pM)0.5^L，下游引物P2(50pM)0.5nL，dNTP(2.5mM)l攀，Taq酶(5U4iL)0.5pL，补加灭菌超纯水至25^L，充分混匀，于PCR仪上94。C预变性3min，94。C变性45sec，56。C退火45sec，72。C延伸60sec，30个循环，72'C延伸10min。1.5NA4基因的克隆(见图2)取上述获得的PCR产物25pl，1%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切下目的条带处琼脂糖凝胶，用大连宝生物公司的胶回收试剂盒回收纯化目的片段，方法参照说明书。取纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，反应体系如下PCR回收产物4.5^1pMD18-T载体0.5^1Ligationsolutioni5.0jj!总体积10.0^1将上述成分在薄壁eppendorf管中混合均匀后16'C连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆菌，提取质粒，用5flwHI和5coRI双酶切鉴定，用P1、P2引物PCR鉴定及测序等鉴定，确定为pMD18-T-NA4，经测序表明，扩增得到NA4基因。1.6NA4基因的表达(见图3)分别用5』1和￡coRI双酶切克隆质粒载体pMD18-T-NA4和质粒pET28a，回收NA4目的基因和pET28a大片段(片段大小5363bp左右)，按照合适比例(摩尔比为1:1)进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，确定为pET28a-NA4。实施例2.dna疫苗的制备2.1重组质粒pVAX-NA4的构建(见图4)7分别用Ba附HI和五coRI双酶切克隆质粒载体pMD18-T-NA4和pVAXl，回收NA4目的基因和pVAXl大片段，按照合适比例进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用5awHI和五coRI双酶切鉴定，确定为pVAX-NA4。2.2重组质粒pVAX-NA4-IL-2的构建(见图5-8)2.2.1合成引物为构建串联细胞因子的重组质粒，利用软件primerpremier5.0设计NA4不含终止密码子的特异性引物P3，并在NA4的3'端加入凝血因子Xa特异性水解序列编码核苷酸序列(方框部分)，下划线部分为引入的酶切位点五coRI。由大连宝生物(TaKaRa)合成引物。引物P3序列如下P3:5'_GAATTCCCTTCCCTCTATGAAGAGAGCGA—3'2.2.2构建pVAX-NA4-IL-2DNA疫苗以pMD18-T-NA4为模板，Pl、P3为引物，进行PCR扩增，获得不含终止密码子的NA4基因，回收纯化目的片段，再与pMD18-T载体连接，构建新的pMD18-T-NA4质粒，用酶切、PCR和测序进行鉴定。用SawHI和五coRI双酶切新构建的pMD18-T-NA4质粒和pVAXl，回收NA4目的基因和pVAXl大片段，连接构建新的pVAX-NA4质粒。用五coRI和力al双酶切质粒pcDNA3.1b-TA4-IL-2(Qi羅ingXu,XiaokaiSong，LixinXu,RuofengYan,MohammedAliA.Shah,XiangruiLi.VaccinationofchickenswithachimericDNAvaccineencodingEimeriatenellaTA4andchickenIL-2inducesprotectiveimmunityagainstcoccidiosis.VeterinaryParasitology,2008，156(3-4):319-323)禾卩pVAXl，回收IL-2目的基因和pVAXl大片段，连接构建pVAX-IL-2质粒。用五coRI和J;al双酶切新构建的pVAX-NA4质粒和pVAX-IL-2质粒，回收pVAX-NA4大片段G740bp左右)和IL-2小片段(450bp左右)，按照合适比例(摩尔比1:1)进行连接，经酶切、PCR鉴定(见图9)，确定为pVAX-NA4-IL-2重组质粒DNA疫苗。实施例3.DNA疫苗在鸡体内表达情况的检测分别提取pVAX-NA4和pVAX-NA4-IL-2重组质粒，经胸部肌肉注射14日龄雏鸡(100ng/只)，7天后分别取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)。3.1RT-PCR检测DNA疫苗的转录一步法提取肌肉总RNA，加入DNaseI除去残余的重组质粒和基因组DNA，用RT-PCR法分别扩增目的基因。结果表明DNA疫苗在鸡肌肉细胞内获得了转录(见图10)。3.2Westernblot检测DNA疫苗的翻译3.2.1重组pET28a-NA4蛋白抗血清的制备将pET28a-NA4转化入大肠杆菌BL21进行原核表达，当细菌OD600为0.5时，用异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，6h后收集细菌进行超声波裂解，纯化包涵体，并进行SDS-PAGE分析。将纯化的包涵体用弗氏佐剂乳化后，在SD大鼠背部皮下注射免疫(200pg/只)，首次免疫和二次免疫相隔15天，之后每隔78天加强免疫1次。用ELISA检测血清效价，收集高免血清，置-20'C保存备用。3.2.2Westernblot检测分别取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)制样，SDS-PAGE电泳后转印硝酸纤维素膜，洗涤后加入5%脱脂奶粉封闭无关蛋白结合位点1小时，然后加入抗重组蛋白免疫大鼠血清(一抗)作用1小时，洗涤缓冲液洗涤后加入HRP标记的羊抗大鼠抗体(二抗)作用1小时，最后DAB显色液显色。结果发现DNA疫苗在鸡肌肉细胞内获得了很好的表达。实施例4.免疫保护性实验1.实验设计150羽1日龄雏鸡，随机分为5组，每组30羽，设立感染非免疫组(第一组)、非感染非免疫组(第二组)、空载体对照组(第三组)、pVAX-NA4(第四组)和pVAX-NA4-IL-2(第五组)。14日龄和21日龄时分别肌肉注射100nlTE(第一组)、100^1TE(第二组)、100吗pVAX(第三组)、100吗pVAX-NA4(第四组)、100吗pVAX-NA4-IL-2(第五组)。28日龄时除第一组外其余各组经口感染毒害艾美耳球虫孢子化卵囊(1><105个/羽)。35日龄逐只称重，全部扑杀，分别取每只鸡的小肠，进行病变记分和卵囊计数，对免疫保护效果进行统计分析。2.免疫保护效果的观察2.1增重效果注射DNA疫苗前，逐羽称重，然后分别在攻虫时和宰杀时(即攻虫后第8天)逐羽称重，观察注射后至攻虫前、以及攻虫后到宰杀时鸡体重变化情况，然后计算平均增重和相对增重。平均增重1=攻虫时重一首免时重；平均增重2=宰杀时重一攻虫时重；增重率=(宰杀时平均体重一攻虫时平均体重)/攻虫时平均体重X100%。2.2OPG值(克盲肠内容物卵囊数)按麦克马斯特法计算卵囊，具体为攻虫后第7天，宰杀全部鸡，逐羽取其盲肠内容物，各取2g，加10mL水，搅匀，然后再加50mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满两个计数室，静止1-2分钟，镜检计数两个计数室的卵囊数。计数室容积为1X1X0.15=0.15mL，0.15mL内含粪便2X0.15/(10+50)=0.005g，两个计数室则为0.01g所得卵囊数乘100即为OPG值。2.3肠道病变记分攻虫后第8天，宰杀全部鸡只，逐羽观察小肠病变，并按Johnson方法进行病变记分，并将盲肠病变分为0-+4五个等级。0分表示正常，无肉眼病变；+1分从小肠中部浆膜面看到散在的针尖状出血点或白色斑点，粘膜损伤不明显；+2分从小肠中部浆膜面看到有多量的出血点，也可见到中部肠管稍充气；+3分小肠腔有大量出血，浆膜面见有红色或白色斑点。粘膜面粗糙，增厚，有许多针尖状出血点。肠内容物含量少；充气达小肠下半段，小肠粗度明显加大但长度明显縮小；+4分小肠因严重出血而呈暗红色、褐色，大部分肠管气胀明显，粘膜增厚加剧，肠腔内充满血液和粘膜组织的碎片，从浆膜面看，在感染部位组织见到白色或红色病状，在死亡鸡只病灶为白色和黑色，呈"白盐与黑胡椒"之外观，有些情况，可见到寄生性肉芽肿，肠管增粗一倍，长度缩短一倍。2.4综合抗球虫指数(ACI)ACI是包括存活率、增重、病变、卵囊产量等多项参数，综合评定后作为判定球虫耐药性或药物效力的指标，也可用于球虫疫苗保护效果检测的指标。ACI=(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)存活率=(试验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)X100%相对增重率=(试验组增重率/非感染非免疫组增重率)X100%病变值(040)=各试验组的平均病变记分(04)X10卵囊值(040)按以下方法计算盲肠内容物充分进行捣碎均匀后，加饱和食盐水作40倍稀释，用麦克马斯特计数板记数，并换算为卵囊值，换算标准见表l:表l克盲肠内容物卵囊值换算标准盲肠内容物OPG(xl05)卵囊值0—0.100.1--1.012.0—5.0106.0—10.020>11.040以AC&180为保护效果明显，ACI=160—179为保护效果一般，ACK160为无保护效果。3.免疫保护效果分析(见表2)pVAX-NA4和pVAX-NA4-IL-2的ACI分别为175.99和180.54，具有较好的免疫保护效果。表2DNA疫苗抗球虫综合保护效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>感染非免疫非感染非免疫pVAX质粒pVAX-NA4重组质粒pVAX-NA4-IL-2重组质粒10010010010010032.3810037.9391.0994.04用pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax代替真核质粒载体为pVAXl本领域技术人员很容易做到。大家都知道，作DNA疫苗，真核表达载体差别不是太重要，关键是目的基因，有了pVAX-NA4-IL-2，就很容易得至ljpcDNA3.0-NA4-IL-2，pcDNA3.1-NA4-IL-2和pcDNA4/HisMax-NA4-IL-2，而且免疫保护效果不会差别太大。序列表南京农业大学预防鸡毒害艾美耳球虫的免疫调节型DNA疫苗说明书002008-10-185Patentlnversion3.111194丽人工合成pVAX-NA4-IL-2(l)..(1194)1〈110〉<120〉〈130〉〈140〉〈141〉〈160〉〈170〉〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈221〉〈222〉〈223〉〈400〉atggctcgtcgccagagctcgagctcagaactgccagcatgaaatotgtccteactggcactggagtactgcgttgaacaccca^axxcaggscgc鄉cttggc鄉agtctg犯aagagttatctccgatctttggcttcag犯aa^tactctgcagt3CgggtC"t肌tttcctgatt〈210〉2〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈221〉<222〉〈223〉〈400〉2gggatccatggctcgtctct〈210〉322DNA人工合成tctcttttgt肌gcagcaggEictcgcacgaccaaagtcttactttgcctagg犯aggcggaccccgctgtgccccgttgtttgcggcagggctcaccaccagggtggsgtctttcgctctgtatttcggtgg犯33CtCtttcatctcgagttacctgggaagaMttgtatcacaccggttctccatgattctcttcttCCC肌C8gC8gcttcctg犯ggcc娜gcgaggaggagcactaccccgtcactttcgcaggtac^tgactagttgcgtaattcgacgacttctccagtccttcatagagagcaatgctotcaaacattagctctacacaaactgctatt犯gtgaatgcactgaccaactctctgtcactgctcttcggga犯cgatggagtgtag卿tttgga犯tgCtgttgg3g3gcaccagtggctgaaactct3gggCC33g3gtgttoccgs3ccg3cggc8aasgagagtgttcaacgataaaattcccccagggccgtctcctttgtcgcctactccagtgccctaatgcgctgtcatttgcttgacaaaga^gc犯tggaiagaei肌ttgtggcccttcagtagccctcatgg卿gg组tcstgatgtgatgactacagcttatggagc3to犯gg3tttag3aatattccaactggigacccaggagtg3ctctg犯g3犯gaaactgs犯gatctgtgaagcta^caeitttgtgagatatctgcaaaaggcgatgaactgca_gta_gttgtgg犯gscgagctgtc犯gcagcgatgctaacatttcaacctatacaac郷aggtggtccctgctccttgactctctactctgcggcgatctctatcagga犯8tatcC3CCC3gC犯agatgacsctcaagagtcttataa22DNA人工合成引物Pl(l)..咖ct〈211〉〈212〉〈213〉<220>〈221><222>〈223〉60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140119422引物P2(l)..咖12<400>3gaattcctsgaagagagcgaaa22<210>429腿人工合成〈211〉<212>〈213〉〈220〉<221〉<222><223>〈400>引物P3(l)..(29)4gaattcccttccctctatgaagagagcga〈210>5248PRT人工合成<211><212><213〉<220>〈221><222><223><400>NA4编码的氨基酸(1).5MetAlaArg1GlyGinGinMetGluCys35ProGluPhe50SerHisGlu65GlulieCysGluAlaValGlyLysArg115SerGinPhe130ProAlaVal145ProLysProAlaGlyGlylieCysLeu195AspAspGlu210GlyGlyVal225VallieSer(248)LeuSer5AlaAla20ArgGluGlyAsnAlaArgProLys85LysLeu100GluCysAsnAspTyrAsnSerPro165GlyGly180ThrAsnGinTrpSerProAlaPhe245PheArgAlaAlaAla70ValThrSerLysAsp150ValArgProLysVal230AlaValSerLeuLeuSerLeuSerLeuI>euPhe1015AlaGinGluThrTyrProThrAlaGluThr2530MetAsnGluLeuArgLysAlaAlaGlyLeu4045ValGlyAspAlaValValLeuProAlaTyr5560AlaProValAlaGluThrLeuTrpLysThr7580LeuGlyGlyAlaArg.AlaLysSerValThr9095GlyAsnPheAlaTyrTyrProValThrAsp105110AspAlaLeuGluTyrTrpLysGlyGlyLeu120125lieProProThrPheGinAlaLeuAsnAsn135140ArgAlaValSerPheValAlaLeuTyrAsn155160ValSerCysValLeuLeuGinCysProAsn170175ArgLeuAlaAlaGlyThrThrAspAlaVal185190AlaProLeuAlaAlaGlySerProProPhe200205LyslieValAspSerLeuSerGluLysLys215220GlyProSerValAlaLeulieSerAlaAla235240LeuPhe29权利要求1、一种鸡毒害艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗，该疫苗包含其中插入的鸡毒害艾美耳球虫子孢子表面抗原NA4基因，核苷酸序列为SEQIDNO.1的第1-744个碱基。2、根据权利要求1所述的DNA疫苗，其中进一步还包含鸡白细胞介素-2即chlL-2基因，核苷酸序列为SEQIDNO.l的第763-1194个碱基，并在chlL-2基因的5'端引入了一段凝血因子Xa特异性水解序列的编码基因，核苷酸序列为SEQIDNO.l的第745-762个碱基。3、根据权利要求2所述的DNA疫苗，其中chlL-2基因、chlL-2基因的5'端引入的一段凝血因子Xa特异性水解序列的编码基因与权利要求1所述鸡毒害艾美耳球虫子孢子表面抗原NA4基因连接在一起组成一融合表达载体pVAX-NA4-IL-2，核苷酸序列为SEQIDNO.l。4、根据权利要求1-3中任一项所述的DNA疫苗，其中所述的真核质粒载体为pVAXl、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax。5、权利要求1-4中任一项所述的DNA疫苗在制备预防或治疗鸡球虫病的药物制剂中的用途。全文摘要本发明涉及一种鸡毒害艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗，属于生物兽药
技术领域：
。利用分子生物学技术将毒害艾美耳子孢子表面抗原NA4基因和鸡白细胞介素-2(chIL-2)基因进行串连，构建了融合表达载体pVAX-NA4-IL-2。该疫苗包含其中插入的鸡毒害艾美耳球虫子孢子表面抗原NA4基因，和鸡白细胞介素-2即chIL-2基因。本疫苗包含有多个T细胞免疫应答元件，具有安全性高、在体内维持时间长、制备简单、热稳定性良好、便于贮藏和运输、使用省时省力等优点，能够有效地预防和治疗鸡的球虫病。试验证明，免疫调节型DNA疫苗pVAX-NA4-IL-2在抗球虫感染中，具有良好的免疫保护效果。文档编号A61K39/002GK101422605SQ200810155080公开日2009年5月6日申请日期2008年11月3日优先权日2008年11月3日发明者严若峰,宋小凯,娜张,徐立新,李祥瑞申请人:南京农业大学