后的编码Slrll92的DNA分子具有SEQIDN0:2所示的核巧酸序列，在本 实验室内合成基因。
[0098] 质粒祀T28a购买自Novagen公司。
[0099] 实验方法：
[0100] 1.构建抑isTrc-tesA 质粒
[0101] 1)载体为pTrcHis2A，用化〇1和BamHI酶切，长度为4400,纯化
[010引 2)模板为pKSl,用引物化oI-tesA-fwd和BamHI-Spel-tesA-rev进行扩增，长度 为575,切胶回收，用化01和BamHI酶切，纯化，与载体连接。
[010引 3)菌落PCR用引物pTr地is2A-F和引物pTr地is2A-R正确长度为894
[0104] 2.构建 pACYC-Trc-tesA 质粒
[0105] 1)用引物 Aflll-pACYC-fwd 和 Pstl-pACYC-rev 扩增 pACYCDuet-1，长度为 3810， 切胶回收，用PstI和Af III酶切，纯化。
[0106] 2)片段模板为 pHisTrc-tesA,用 Pstl-Gibson-pHisTrc-fwd 和 Aflll-Gibson-rrnBTl-rev进行PCR，长度为1190,切胶回收，与载体进行Gibson连接
[0107] 3)菌落 PCR 用 Duet-seq-F 和 pACYCDuet-R，长度 1443。
[0108] 3.构建祀T21a-Dox 质粒
[0109] 1)载体为祀T21a，用Ndel和BamHI酶切，长度为5350
[0110] 2)片段模板为合成的dox基因，用引物Ndel-Dox-fwd和BamHI-Spel-Dox-rev扩 增，长度为1885,切胶回收，用Ndel和BamHI酶切，纯化，与载体连接；
[0111] 3)菌落PCR用引物祀T-fwd和引物祀T-rev，正确长度为2401.
[0112] 4.构建祀T28a-A化P质粒
[0113] 1)载体为祀T28a，用Ndel和BamHI酶切，长度为5400
[0114] 。片段模板为E. coli化21触扣基因组，用引物Ndel-A化P-fwd和 BamHI-Spel-A化P-rev 扩增，长度为 1036
[011引扣菌落PCR用引物祀T-fwd和引物祀T-rev，正确长度为1552.
[0116] 5.构建祀T28a-Yj浊，pET28a-YcihD，祀T28a-A化E，祀T28a-Slr 1192 质粒
[0117] 1)载体为祀T28a-A化P，用Ndel和Spel酶切，切胶回收长度为5350的片段
[0118] 2)片段模板为 E. coli BL2UDE3)基因组，用引物 NdeI-***-fwd 和 SpeI-***-rev 扩增不同的基因片段（***代表基因名称），引物序列见表3,片段名称、PCR后长度如表2所 示，其中化hD需要替换Ndel酶切位点，A化E需要替换化〇1酶切位点，因此需要W突变点 为中必左右PCR扩增两部分，片段切胶回收后再进行overlap,最后带了 Ndel和Spel酶切 位点的片段切胶回收，用Ndel和Spel酶切，纯化，与载体连接；
[0119] 3)菌落PCR用引物祀T-fwd和引物祀T-rev，正确长度如表2所示
[0120] 表2片段详情
[0121]
[0122] 表3用于合成奇数中链脂肪醇的基因元件的构建所需引物列表
[0123]
[0124]
[0125] 实施例3 ;用于合成偶数中链脂肪姪的基因元件的构建
[0126] 实验材料：
[0127] CER1 :脂肪醒脱撰酶，来源于拟南芥（Ar油idopsis thaliana)，蛋白序列为 化iProt邸/Swiss-Prot:F4HVY0. 1，按照大肠杆菌进行密码子优化，优化之后的编码CER1 的DNA分子具有SEQ ID N0:3所示的核巧酸序列，在genscript合成基因。
[0128] AD9313 ;脂肪醒脱撰酶，来源于原绿球藻（Prochlorococ州S marinus 1口9313)， 蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_895059. 1，按照大肠杆菌进行密码子优化，优化 之后的编码AD9313的DNA分子具有SEQ ID N0:4所示的核巧酸序列，在本实验室内合成基 因。
[0129] AD7942 ;脂肪醒脱撰酶，来源于聚球藻（Synechococ州S elongaUis PCC7942)，蛋 白序列为accession number ;ΥΡ_400610,按照大肠杆菌进行密码子优化，优化之后的编码 AD7942的DNA分子具有SEQ ID Ν0:5所示的核巧酸序列，在GE肥ART合成基因。
[0130] AD73102 ;脂肪醒脱撰酶，来源于念珠藻（Nostoc punctiforme PCC73102)，蛋白序 列为accession number ;ΥΡ_001865325,按照大肠杆菌进行密码子优化，优化之后的编码 AD73102 的 DNA 分子，由宾夕法尼亚州立大学（The 化nnsylvania State University, USA) 的Squire J. Booker课题组赠与。
[0131] 实验方法：
[0132] 1.构建祀T28a-C邸 1，祀T28a-AD9313,祀T28a-AD7942 和祀T28a-AD73102 和质粒
[0133] 1)载体为祀T28a-A化P，用Ndel和Spel酶切，切胶回收长度为5350的片段
[0134] 2)用引物NdeI-***-fwd和SpeI-***-rev扩增不同的基因片段（林*代表基因名 称），引物序列见表5,片段名称、PCR后长度如表4所示，切胶回收，用Ndel和Spel酶切， 纯化，与载体连接
[0135] 3)菌落PCR用引物祀T-fwd和引物祀T-rev，正确长度如表4所示.
[0136] 表4片段详情
[0137]
[0138] 表5用于合成偶数中链脂肪姪的基因元件的构建所需引物列表
[0139]
[0140] 实施例4 ; α -加双氧酶用于合成奇数中链脂肪醇和偶数中链脂肪姪的可行性验 证
[0141] 实验方法：
[0142] 1.构建 pACYC-Trc-tesA-Dox(CYX134)质粒
[0143] 1)载体为 pACYC-Trc-tesA，用 Spel 和 BamHI 酶切，纯化
[0144] 2)片段模板为21A-DOX，用甜al和BamHI酶切，长度为1911，切胶回收，与载体连 接。
[0145] 2.将质粒CYX134热激转化进入E. coli BL2UDE3)菌株中，并在LB固体平板上进 行筛选。细胞均在3(TC的培养箱中进行培养，固体及液体培养基中各抗生素的含量为氯霉 素 34μ g/mL。
[0146] 3.将转化了质粒pACYC-Dox-tesA'的E. coli BL21 (DE3)菌株进行发酵。挑重组 子单菌落接种于LB培养基中3(TC过夜培养，并按照1:100的比例接种于5mL M9培养基中， 在30°C，220巧m的摇床中进行进行发酵。当生物量长到0D600 = 1. 0-1. 2之间时，加入ImM 的IPTG，诱导表达4化之后，提取脂肪醇样品进行检测。
[0147] 4.脂肪醇的提取，具体做法如下：
[0148] 1)取诱导后3(TC发酵40h的培养基0. 5血，加入25mg/L的十六醇作为内标；
[0149] 。加入0. 5血的己酸己醋，縱润震荡5min，15000巧m离必2min ;
[0150] 3)吸取上层有机相，用0.22 μ m尼龙膜过滤。进样前将样品保存在-8(TC冰箱中。
[015。 5.脂肪醇提取样品的检巧[J。本实验中涉及的气质联用系统为Waters GCT Premier MICROMASS系统，其中包括：
[015引 1)Agilent 7683自动进样器
[0153] 2)Agilent 6890 气相色谱（GC, Agilent Technologies, USA)
[0154] 3)飞行时间质谱仪灯OF-MS，Waters Co巧.，USA)
[015引 4) J&W DB-5 毛细管石英柱（30m length, I. D. 0. 25mm，FilmO. 25 μ m, Agilent Technologies, USA)
[0156] GC条件如下；采用DB-5气相色谱柱，进样量为1 μ L采用柱后分流技术，分流比为 2:1。进样口温度为260°C，GC interface温度为28(TC。高纯氮为载气，9化pa恒压。色 谱分离的升温程序如下：初始温度7〇°C，保持2min，W 8°C · min 1的速度升到29(TC，并在 290°C保持 6min。T0F/MS.
[0157] 质谱条件如下：质谱电离方式为正离子模式的电轰击电离巧1+)，其电离电压为 70eV，源温保持在25(TC。质谱的扫描范围为50-800m/z，扫描速度为2scan . s-1。
[015引 产物的定性和定量分析采用Masslynx软件（Version 4. 1，Waters Co巧.，USA)对 GC-TOF/MS数据进行定性定量分