玉米根萤叶甲特异性SS‑COI引物及检测方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及玉米根萤叶甲特异性ss-coi引物及检测方法和应用。

背景技术：

玉米根萤叶甲diabroticavirgiferavirgiferaleconte，属鞘翅目、叶甲科、萤叶甲亚科、根萤叶甲属，是危害玉米的一种世界性毁灭性检疫害虫，2007年农业部将其列入中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录。玉米根萤叶甲的寄主植物主要包括禾本科、菊科、葫芦科以及豆科等，其中以玉米受害最重，也可以危害南瓜、甜瓜、大豆以及大麦和小麦等，但禾本科的高粱并非其适宜寄主。玉米根萤叶甲以成虫和幼虫在寄主植物的整个生长期进行为害，而幼虫是最主要的为害虫态。其中成虫主要以玉米植株的雌穗花丝、雄穗花穗、花粉、叶片以及玉米的幼嫩籽粒等为食，亦可取食其他植物的花粉和叶片；为害叶片时成虫主要取食叶片的上表皮，形成玻璃窗样半透明斑；授粉期为害雌穗花丝使花穗呈齐头剪断状，影响玉米的授粉和受精，导致结实不良。幼虫主要以玉米的须根和主根或其它寄主植物如大豆、南瓜等的根部为食；初孵幼虫取食须根，大龄幼虫钻入根部组织内蛀食为害，不仅影响水分和养分的输送，形成瘪粒造成减产，甚或使植株干枯死亡；此外，幼虫鉆蛀所形成的伤口还可诱发病菌侵染，导致植株根部腐烂，引发植株倒伏，甚至死亡。如若防治不及时，可造成玉米10-40％甚至高达90％的产量损失；在欧洲，玉米根萤叶甲每年造成的损失平均为4.72亿欧元；在美国，每年可造成大约8亿美元的玉米减产损失和2亿美元的防治费用，并因此被称为“10亿美元害虫”。

玉米根萤叶甲原产于北美洲南部和中美洲北部，1955年之前主要发生在美国的中西部地区，一直是该地区最重要的玉米害虫之一。但此后的50年间却以每年64-80公里的速度迅速向东扩展，1985-2005年扩散至大西洋沿岸并在北美地区广泛分布，发生区域主要有美国、加拿大、哥斯达黎加、危地马拉、墨西哥和尼加拉瓜等国家。1992年，玉米根萤叶甲首次在欧洲的塞尔维亚首都贝尔格莱德国际机场附近的田间被发现，之后在欧洲快速传播蔓延，目前已在阿尔巴尼亚、奥地利、白俄罗斯、比利时、波斯尼亚和黑塞哥维那、保加利亚、克罗地亚、捷克共和国、丹麦、爱沙尼亚、芬兰、法国、德国、希腊、匈牙利、意大利、黑山共和国、荷兰、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、塞尔维亚、斯洛伐克、斯洛文尼亚、西班牙、瑞士、乌克兰、英国等28个国家严重发生，使玉米生产遭受了严重打击，是世界玉米产业的一种毁灭性害虫。目前，我国尚未有玉米根萤叶甲的发生，因此加强对玉米根萤叶甲的检疫检验，是保障我国玉米产业健康发展的首要前提。

玉米根萤叶甲为小型甲虫类昆虫，成虫体长约5.0-6.0mm；卵长0.65mm，宽0.45mm，形同美式橄榄球，初产时为白色，近孵化时变为淡黄色，肉眼很难发现。雌性成虫主要将卵产于大约20cm深的土层当中，幼虫一经孵化即自主寻找寄主植物的根部取食须根，龄期大了以后潜入根部组织内进行取食为害；幼虫老熟后在土中挖洞化蛹，蛹为白色。而加强检疫和监测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于玉米根萤叶甲鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定；2)pcr技术等。但目前国内针对玉米根萤叶甲尚没有标准的检测方法。

coi技术曾用于区分玉米根萤叶甲的不同地理种群和遗传分化。mtdnacoi技术检测是利用通用型的引物，在dna聚合酶的催化下，对目标dna进行体外扩增，然后将pcr产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。ss-coipcr技术检测是在mtdnacoi技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期dna条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性好和稳定性强等优点。

技术实现要素：

本发明的目的为提供一对玉米根萤叶甲特异性ss-coi引物。

本发明的另一目的为提供一种玉米根萤叶甲的特异性快速pcr检测方法。

本发明的再一目的为提供一种玉米根萤叶甲的特异性快速pcr检测试剂盒。

本发明根据玉米根萤叶甲的线粒体dna序列，设计一对种特异性引物，该引物只对玉米根萤叶甲具有扩增能力。是对玉米根萤叶甲mtdnacoi技术检测方法的补充和改进。同时，本方法采用ss-coipcr技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在玉米根萤叶甲检测/监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国各口岸推广。

根据本发明的一对玉米根萤叶甲特异性ss-coi引物为：

引物dvvzce1：5′-gtacgagcagaattaggaagg-3′；和

引物dvvzcf1：5′-aattacgacagctcaaacaaatagg-3′。

根据本发明的玉米根萤叶甲种特异性检测方法包括使用上述ss-coi引物进行pcr扩增的步骤。

根据本发明的玉米根萤叶甲种特异性检测试剂盒包括上述玉米根萤叶甲特异性ss-coi引物。

本发明的玉米根萤叶甲种特异性ss-coi引物及快速pcr检测方法，用于快速检测玉米根萤叶甲。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：

1)检测准确性高。本方法根据玉米根萤叶甲种特异性ss-coi标记设计的引物dvvzce1和dvvzcf1，在pcr快速检测玉米根萤叶甲时，可扩增出462bp的片段，不仅对玉米根萤叶甲的单头成虫可以进行检测，对于单粒卵、幼虫和成虫残体包括触角、头部、胸部、腹部、前足、后足等也能准确检测。

2)操作简便快捷。本发明采用pcr技术，操作过程简单、快速、高效。一般整个过程可在3.5个小时内完成。

3)特异性强。本发明设计的引物可特异性检测玉米根萤叶甲，在其同域发生的其他叶甲类害虫中无扩增产物。

因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测/检测的需要。

附图说明

图1为引物dvvzce1/dvvzcf1对玉米根萤叶甲以及其他常见叶甲类害虫的ss-coipcr扩增结果，

m:分子量标准dgl2000；1:玉米根萤叶甲diabroticavirgiferavirgiferaleconte；2:莲草直胸跳甲agasicleshygrophilaselmanandvogt；3:油菜蚤跳甲psylliodespunctifronsbaly；4:枸杞负泥虫lemadecempunctatagebler；5:双斑长跗萤叶甲monoleptahieroglyphica(motschulsky)；6:榆黄毛萤叶甲pyrrhaltamaculicollis(motsch.)；7:褐足角胸叶甲(蓝绿型)basileptafulvipes(motschulsky)biotypeblue-green；8:褐足角胸叶甲(红棕型)basileptafulvipes(motschulsky)biotypered-brown；9:水(阴性对照)。

图2为引物dvvzce1/dvvzcf1对玉米根萤叶甲卵、幼虫以及成虫残体的ss-coipcr扩增结果，

m:分子量标准dgl2000；美国种群：1:雌性成虫(腹部1/4)，2:2龄幼虫(腹部1/3)；匈牙利种群：雌性成虫：3:头部，4:胸部(1/2)，5:腹部(1/3)；6:卵(单粒)；7:前足(1对)，8:后足(1对)，9:触角(1对)；10:雄性成虫(腹部1/3)；11:水(阴性对照)。

图3为引物dvvzce1/dvvzcf1对玉米根萤叶甲最低检测阈值的测定，

m:分子量标准dgl2000；1-15:105.2×10³,52.6×10³,26.3×10³,13.15×10³,6.575×10³,3.288×10³,1.644×10³,821.88,410.94,205.47,102.73,51.37,25.68,12.84和6.42pg/μl，相当于1/120,1/240,1/480,1/960,1/1920,1/3840,1/7680,1/15360,1/30720,1/61440,1/122880,1/245760,1/491520,1/983040,1/1966080头雌性成虫；16:水(阴性对照)。

具体实施方式

实施实例1：引物dvvzce1/dvvzcf1对玉米根萤叶甲的扩增效果

1)叶甲类害虫模板dna的制备

将单头叶甲类害虫成虫的部分组织置于1.5ml的离心管中，提取其dna，然后后每管加入30μl超纯水，充分溶解后于-40℃保存备用。

2)检验玉米根萤叶甲的特异性引物的合成

primerdvvzce1：5′-gtacgagcagaattaggaagg-3′

primerdvvzcf1：5′-aattacgacagctcaaacaaatagg-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3)pcr扩增反应

反应体系为25μl，其中10×pcrbuffer2.5μl、dntp(10mm)0.5μl、taq聚合酶(5u/μl)0.3μl、上游引物和下游引物(10pm)各0.5μl、模板dna2.0μl、超纯水18.7μl。

4)pcr扩增程序

95℃预变性5min；35个循环：94℃30sec、53℃30sec、72℃40sec；最后72℃延伸7min。

5)pcr产物的鉴定

取5μlpcr产物用含有goldview的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶进行电泳分离，然后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

实施结果

利用引物primerdvvzce1/dvvzcf1以玉米根萤叶甲dna为模板，以莲草直胸跳甲、油菜蚤跳甲、枸杞负泥虫、双斑长跗萤叶甲、榆黄毛萤叶甲、褐足角胸叶甲蓝绿型以及褐足角胸叶甲红棕型等7种/生物型其他常见叶甲类害虫为对照进行ss-coipcr扩增。在1泳道的玉米根萤叶甲中扩增出了462bp的目的条带(见附图1的1泳道)，在其他7种/生物型叶甲类害虫中均无扩增产物。说明我们所筛选的来自玉米根萤叶甲线粒体dna的特异性ss-coipcr扩增引物的特异性强。

462bp片段的序列：

实施实例2：引物dvvzce1/dvvzcf1对玉米根萤叶甲卵、幼虫及成虫残体的扩增效果

1)玉米根萤叶甲模板dna的制备

将玉米根萤叶甲单粒卵、2龄幼虫(腹部1/3，美国种群)和成虫残体(包括触角(1对)、头部、胸部(1/2)、腹部(雌性：美国种群1/4，匈牙利种群1/3；雄性：匈牙利种群1/3)、前足(1对)、后足(1对))分别置于1.5ml的离心管中,加入液氮后以研磨棒充分研磨(其中卵和幼虫加20μl直接研磨)，然后以150μl缓冲液(50mmtris-hcl、lmmedta、1％sds、20mmnacl,ph8.0)分2次清洗研磨棒，混匀，加入5μl蛋白酶k(20mg/ml)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴8min，加入220μl氯仿/异戊醇(v:v＝24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、14000r/min离心10min，取上清液约350μl移入另一离心管，加入800μl预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、14000r/min离心10min，小心弃去上清液。加入300μl预冷的75％乙醇洗涤，4℃、14000r/min离心10min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥30min后以40μl超纯水复溶(其中卵、触角及前足以30μl超纯水复溶)，充分溶解后于-40℃保存备用。

2)检验玉米根萤叶甲的特异性引物的合成

primerdvvzce1：5′-gtacgagcagaattaggaagg-3′

primerdvvzcf1：5′-aattacgacagctcaaacaaatagg-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3)pcr扩增反应

反应体系为25μl，其中10×pcrbuffer2.5μl、dntp(10mm)0.5μl、taq聚合酶(5u/μl)0.3μl、上游引物和下游引物(10pm)各0.5μl、模板dna2.0μl、超纯水18.7μl。

4)pcr扩增程序

95℃预变性5min；35个循环：94℃30sec、53℃30sec、72℃40sec；最后72℃延伸7min。

5)pcr产物的鉴定

取5μlpcr产物用含有goldview的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶进行电泳分离，然后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

实施结果

利用引物dvvzce1/dvvzcf1以玉米根萤叶甲的卵、幼虫以及成虫残体dna为模板进行pcr扩增。玉米根萤叶甲的成虫(雌性和雄性)扩增出了462bp的目的条带(见附图2的1和10泳道)；同时玉米根萤叶甲的幼虫，成虫头部、胸部、腹部，卵，以及成虫的前足、后足、触角等也扩增出了462bp的目的条带(见附图2的2、3、4、5、6、7、8、9泳道)，说明本发明的玉米根萤叶甲的种特异性ss-coipcr扩增引物的准确性高。

实施实例3：引物dvvzce1/dvvzcf1对玉米根萤叶甲最低检测阈值的测定

1)玉米根萤叶甲模板dna的制备

将单头玉米根萤叶甲雌性成虫(腹部1/3)置于1.5ml的离心管中,加入液氮后以研磨棒充分研磨，然后以150μl缓冲液(50mmtris-hcl、lmmedta、1％sds、20mmnacl,ph8.0)分2次清洗研磨棒，混匀，加入5μl蛋白酶k(20mg/ml)，充分混匀后于60℃水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴8min，加入220μl氯仿/异戊醇(v:v＝24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、14000r/min离心10min，取上清液约350μl移入另一离心管，加入800μl预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、14000r/min离心10min，小心弃去上清液。加入300μl预冷的75％乙醇洗涤，4℃、14000r/min离心10min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥30min后以40μl超纯水复溶。然后将原模板溶液以2倍进行递减梯度稀释至1/1966080头，取2μl作为pcr扩增的模板，直接加到pcr反应体系中。

2)检验玉米根萤叶甲的特异性引物的合成

primerdvvzce1：5′-gtacgagcagaattaggaagg-3′

primerdvvzcf1：5′-aattacgacagctcaaacaaatagg-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3)pcr扩增反应

反应体系为25μl，其中10×pcrbuffer2.5μl、dntp(10mm)0.5μl、taq聚合酶(5u/μl)0.3μl、上游引物和下游引物(10pm)各0.5μl、模板dna2.0μl、超纯水18.7μl。

4)pcr扩增程序

95℃预变性5min；35个循环：94℃30sec、53℃30sec、72℃40sec；最后72℃延伸7min。

5)pcr产物的鉴定

取5μlpcr产物用含有goldview的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶进行电泳分离，然后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。

实施结果

利用引物primerdvvzce1/dvvzcf1做最低检测阈值的测定，以不同稀释倍数的玉米根萤叶甲线粒体dna为模板进行pcr扩增，能检测到的最低模板dna浓度为102.73pg/μl，相当于1/122880头雌性成虫(见附图3)。