一种基于等温扩增法检测基因突变或SNP的方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及一种基于等温扩增法检测基因突变或snp的方法。

背景技术：

现阶段，随着药物基因组学的发展，人们越来越意识到精准医疗的必要性和重要性。fda已经对某些药物的应用做了基因检测的限制，例如靶向药物吉非替尼在用药前需要对患者的egfr进行检测，当存在如19号外显子缺失，l858r突变等可以用药，当存在t790m突变时不能用药。又如在2015年cfda发布的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中指出，“携带rs1800497a等位基因的患者应用第二代抗精神病药时静坐不能不良反应的发生风险增加，应注意。”目前看来，精准医疗中所涉及的基因检测主要还是以snp或者突变为主，在精准医疗检测当中，snp和/或突变的检测占大多数。

人类ankk1基因位于11号染色体11q23.2，在多巴胺受体d2(dopaminereceptord2，drd2)基因drd2下游9.3kb。ankki包含8个外显子，编码一个与信号转导通路有关的765个氨基酸的蛋白，该蛋白质的结构包括1个丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸激酶结构域和11个锚蛋白重复域，参与蛋白质与蛋白质之间的相互作用。ankki外显子8上的snprs1800497(c.2317g>a，glu713lys)又称drd2taq1a多态性，携带该多态位点t等位基因可使纹状体drd2的密度下降。静坐不能是抗精神病药主要锥体外系副作用之一，携带drd2rs1800497a等位基因的患者在应用第二代抗精神病药治疗时静坐不能不良反应的发生率显著高于该位点gg基因型患者。cpic已将ankk1rs1800497多态性列为1b级药物基因组标记物，指出通过检测该多态性可降低抗精神病药不良反应的发生风险。

环介导的等温扩增(lamp)技术是2000年提出的一种等温扩增技术，其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)的作用下进行等温扩增，仅需15-90分钟即可产生10⁹-10¹⁰数量级的产物。具有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。

分子信标(molecularbeacon)是一种在5’和3’末端自身形成一个7个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生光子，发生荧光共振能量转移，使荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和淬灭分子距离增大，荧光几乎不被淬灭。

技术实现要素：

本发明在普通lamp的基础上，针对突变位点设计lamp引物和带有不同或相同荧光标记的特异性beacon探针，利用探针与模板杂交的有无和/或tm值的差异，通过熔解曲线的形状和/或tm值的差异来区分基因型，以达到检测基因突变或snp的目的。

本发明的目的在于提供一种基于等温扩增法检测基因突变或snp的方法，包括如下步骤：

1)、提取dna或rna或者直接以新鲜血液作为待检测的模板；

2)、对上述待检测的模板直接进行lamp+beacon检测技术，配制lamp体系，加入针对突变位点设计的带有不同或相同荧光标记的特异性beacon探针；

3)、将待检测的模板加入到反应体系中，用荧光定量pcr仪检测模板样本，反应完成后分析熔解曲线线型，通过熔解曲线的形状和/或tm值的不同来区分基因型。

进一步地，步骤2)中特异性beacon探针的数量可以是两条或两条以上。

进一步地，步骤2)中lamp体系可以是一个或多重lamp体系。

更进一步地，步骤2)中多条特异性beacon探针可同时加入到一个lamp体系中，也可分别加入到多重lamp体系中。

进一步地，步骤3)中反应体系中包括lamp引物、特异性beacon探针、dntp、缓冲液、bst聚合酶和ddh2o。

更进一步地，所述lamp引物包括正向外侧引物f3，反向外侧引物b3，正向内侧引物fip和反向内侧引物bip。

进一步地，特异性beacon探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。

优选地，步骤3)中反应体系中还包括有甜菜碱。

本发明具有的优点和积极效果是：

在普通lamp的基础上，针对突变位点设计lamp引物和多条相同或不同荧光标记的特异性beacon探针，lamp引物用于扩增目标区域，探针检测snp位点，利用探针与模板杂交的有无和/或tm值的差异，通过熔解曲线的形状和/或tm值的差异来区分基因型以达到检测的目的。与现有技术相比，该方法步骤简单，特异性高，扩增反应快速、高效，检测精准。

附图说明

图1-图4分别是检测样本1-4的熔解曲线；

图5-图8分别是检测样本1-4用pcr测序分型得到的测序图谱。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

针对ankk1的snprs1800497位点设计lamp引物和两条不同荧光标记的特异性beacon探针，lamp引物和特异性beacon探针的核苷酸序列如下：

正向外侧引物f3：

5’-ggctcctggcttagaacca-3’(seqidno.1)；

反向外侧引物b3：

5’-acctcctagaacatcacgca-3’(seqidno.2)；

正向内侧引物fip：

5’-actggccctccgcagcagagtggccactgacgg-3’(seqidno.3)；

反向内侧引物bip：

5’-ctgtgttgcccttgagggcccacgcccgcaacaag-3’(seqidno.4)；

探针beacon-c：

5’-ctgccactgcctcgaccagcactggcag-3’(seqidno.5)；

探针beacon-t：

5’-ctgccactgccttgaccagcactggcag-3’(seqidno.6)；

探针beacon-c上标记有荧光基团fam和淬灭基团bhq1，探针beacon-t上标记有荧光基团hex和淬灭基团bhq1，如下所示：

beacon-c5’-fam-ctgccactgcctcgaccagcactggcag-bhq1-3’；

beacon-t5’-hex-ctgccactgccttgaccagcactggcag-bhq1-3’。

在实际应用过程中，针对突变位点可以设计两条以上带有不同或相同荧光标记的特异性beacon探针。

采用lamp+beacon检测技术，配制lamp体系，加入特异性beacon探针和甜菜碱(有的反应可以不加)，将待检测的模板加入到反应体系中，则该反应体系中包括f3、b3、fip、bip、特异性beacon探针、dntp、缓冲液、bst聚合酶、甜菜碱和ddh2o，多条特异性beacon探针可以一起加入到一个lamp体系中，也可以分别加入到多重的lamp体系中，选定多条检测通道，在本实例中将beacon-c和beacon-t加入到同一个lamp体系中，模板的加入量优选为5-100ng，反应体系中f3和b3的浓度相同，均为0.4μm，fip和bip的浓度相同，均为1.6μm，beacon-c和beacon-t的浓度相同，均为0.4μm，dntp的浓度为1.4mm，bst聚合酶的浓度为8u，甜菜碱的浓度为1m，缓冲液包括tris-hcl20mm，kcl50mm，(nh4)2so410mm，mgso48mm，tween-200.1％(体积分数)。

具体实施时，抽取4人1ml静脉血以edta抗凝管保存，每管取200ul血液，用全式金或者其它公司的dna提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组dna作为待检测的模板，分别标记为m1、m2、m3和m4，用超微量分光光度计测定浓度。对模板mn(n为组别编号，1-4)采用lamp+beacon检测技术，配制一个lamp体系，加入两条探针beacon-c和beacon-t以及甜菜碱，将20ng模板mn加入到反应体系中，反应体系选为25μl，其内的组分和含量如下表1所示，用荧光定量pcr仪(cfx96)检测样本，选定fam和hex通道，反应条件为：63℃45min，95℃3min；meltcurve：40-70℃，反应完成后分析熔解曲线线型。

表1反应体系的组分和含量

反应按照上述的检测方法进行，反应完成后，得到4个样本m1、m2、m3和m4的熔解曲线如图1-图4所示，分析熔解曲线线型，分析fam60-66℃，hex52-58℃是否有峰，如有峰则含有这个基因型，没有则不含，分析得到4个样本m1、m2、m3、m4的基因型分别为：cc、ct、ct、tt。

为进一步验证本发明的精准性，对上述的4个样本m1、m2、m3和m4进行pcr测序分型，所得测序图谱如图5-图8所示，测序结果与本发明的结果完全一致，证明了本发明的精准性。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

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<110>北京晋祺生物科技有限公司

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