一种血液病毒RNA保护剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种血液病毒RNA保护剂及其制备方法与应用。

背景技术：

病毒(Virus)由一种核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质(Protein)构成或仅由蛋白质构成(如朊病毒)。病毒体积非常微小，结构及其简单，但具有高度的寄生性，完全依赖宿主细胞的能量和代谢系统。当它接触到宿主细胞时，便脱去蛋白质外套，它的核酸(基因)侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统，按照病毒基因的指令复制新的病毒，最后造成宿主细胞死亡。自然界中DNA病毒很少，基本上都是RNA病毒，如艾滋病病毒，烟草花叶病毒，SARS 病毒，MERS病毒，埃博拉病毒（EBV），西班牙流感病毒，甲型H1N1流感病毒，禽流感病毒等。

人体被RNA病毒感染后，随着病毒的大量繁殖，在人血液中可检测到病毒RNA，故可通过对血液进行对应的相关病毒检测便可确认是否感染了病毒。所以，血液病毒RNA的检测及其在基因诊断等方面的应用对于RNA病毒等的诊断和监测具有十分重要的意义。

但在血液中的病毒RNA含量少，而血液中RNA酶含量多，病毒RNA在没有保护的状态下很容易降解消失，所以研发一种有效可行的延长病毒RNA保存期限的保护剂是很有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种血液病毒RNA保护剂，该保护剂不仅能防止血液凝固，并且可以保护病毒RNA分子，避免其被RNA酶降解，并将基因表达体内变化的改变降至最小。该保护剂的组成成份是：bestain、glycine、EDTA-3K、IDU、AEBSF、核糖核苷复合物、DEPC水溶解液，把血液与血液病毒RNA保护剂以35:2 的比例缓慢充分混匀后，室温放置约半小时即可，室温可保存3天，-20℃至-80℃长期保存。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种血液病毒RNA保护剂，所述保护剂是由bestain、glycine、EDTA-3K、IDU、AEBSF、核糖核苷复合物溶解于DEPC水配制而成，其中各组分在所述DEPC水溶解液中的浓度分别为：bestain（0.05-0.2g/L）、glycine（20-50g/L）、EDTA-3K（30g-70g/L）、IDU（100-400g/L）、AEBSF（0.15-0.4g/L）、核糖核苷复合物（0.4ml-1ml/L）。

作为优选，本发明所述的血液病毒RNA保护剂是由bestain、glycine、EDTA-3K、IDU、AEBSF、核糖核苷复合物按照一定的比例溶解于DEPC水配制而成，其中bestain、glycine、EDTA-3K、IDU、AEBSF、核糖核苷复合物在所述溶液中的浓度分别为0.1g/L、30g/L、50g/L、250g/L、0.235g/L、0.7ml/L。

本发明所述的制备病毒RNA保护剂的方法，具体步骤如下：

1）按配方称（吸）取各组分到容器中；

2）向1）中加入800ml已灭菌的DEPC水，待所有组分溶解后，将溶液pH值调至7.35-7.45，再将溶液转移到1L容量瓶中，定容至1L，得到病毒RNA保护剂。

权利要求1-2任一项所述的血液病毒RNA保护剂在血液病毒RNA保存中的应用，其特征在于，在所述应用中，将采集的血液与病毒RNA保护剂以35:2 的比例缓慢充分混匀后，室温放置约半小时。

根据权利要求4所述的半小时后，其特征在于室温可保存3天，-20℃至-80℃可长期保存。

本发明的优点：

1.血液中的病毒RNA可以在第一时间被保护起来；

2.更好地保证病毒RNA的完整性。

附图说明

图1为感染HIV的全血置于本文所述的血液病毒离RNA保护剂中保存0天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果

图2为感染HIV的全血置于本文所述的血液病毒离RNA保护剂中保存1天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果

图3为感染HIV的全血置于本文所述的血液病毒离RNA保护剂中保存2天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果

图4为感染HIV的全血置于本文所述的血液病毒离RNA保护剂中保存3天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果

图5为感染HIV的全血置于EDTA-Na2采血管中保存0天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果

图6为感染HIV的全血置于EDTA-Na2采血管中保存1天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果

图7为感染HIV的全血置于EDTA-Na2采血管中保存2天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果

图8为感染HIV的全血置于EDTA-Na2采血管中保存3天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果

具体实施方法

以下实施案例仅用于解释本发明，而并非限制本发明。

实施例1：

随机抽取5份感染HIV的人全血样本，分别按5ml/人份分成8人份，其中4人份为1组，分成2组。其中1组置于常规EDTA-Na₂采血管中，另1组置于本发明所述的血液病毒RNA保护剂中，分别常温放置0天、1天、2天、3天后进行核酸提取（Qiagen公司的RNeasy Mini Kit (50) -货号74104试剂盒），以提取的核酸为样本进行人HIV基因的实时荧光PCR检测。

检测结果：

置于常规EDTA-Na₂采血管和本发明所述的血液病毒RNA保护剂中的感染了HIV的全血样本，在常温放置不同时间后，分别进行核酸提取，提取的核酸进行HIV基因的实时荧光PCR检测，其检测结果的Ct值如表1。由表1可知，血液病毒RNA保护剂能够在3天内有效地保护血液中病毒RNA，只有极其轻微的降解；而常规EDTA-Na₂采血管对病毒RNA的稳定性维持时间不到1天且降解情况比较严重。

表1

图1~图8为表1对应的HIV基因的实时荧光PCR检测结果图，其中图1~图4为全血置于本文所述的游离病毒RNA保护剂中保存不同时间后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果图，由图可知，在0~3天的检测时间内，所有检测样本都被正确检出，且稳定性良好，血液中病毒RNA得到了有效的保护；图5~图8为全血置于常规EDTA-Na₂采血管中保存不同时间后进行核酸提取，提取得到的核酸进行HIV基因实时荧光PCR的检测结果图，检测结果显示，常规EDTA-Na₂采血管中的病毒RNA连1天的稳定性都不能维持，降解情况十分严重。