转基因油菜蜂花粉DNA的提取方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及转基因油菜蜂花粉DNA的提取方法。

背景技术：

油菜(Brassica napus L.)是世界四大油料作物之一，同时也是重要的蜜源作物。油菜花粉是蜜蜂从油菜花蕊内采集花粉粒，并加入特殊的腺体分泌物（花蜜和唾液）混合而成的一种不规则扁圆形状物；其富含蛋白质、多糖、维生素、微量元素、不饱和脂肪酸等，是一种高蛋白低脂肪的营养保健食品。已有研究表明，油菜蜂花粉具有抗疲劳、增强人体免疫功能、保护心脑血管系统、改善内分泌腺分泌功能、保护肝脏等多种功效。

随着转基因技术的成熟，商业化种植的转基因作物在种类和面积上都不断增加，转基因油菜在国外早已大面积商业化种植。我国目前还没有转基因油菜的商业化生产，但有关转基因油菜的遗传转化及其田间试验非常活跃。花粉是有花植物雄蕊中的雄性生殖细胞，它携带着生命的遗传信息，也必然包含转基因成分。油菜花粉是产量最大的一种花粉，除作为保健品直接销售外，还常作为制药原料。因此，对油菜花粉中外源基因的检测工作迫在眉睫，如何一次性获得质量好且足够的转基因油菜蜂花粉DNA，是相关工作开展的前提。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种转基因油菜蜂花粉DNA的提取方法，采用该方法可以分离出纯度高、完整性好的转基因油菜蜂花粉DNA，利于PCR快速检测，操作简单，低毒，耗时短。

本发明的技术解决方案是：将蜂花粉研磨破壁；加入高盐提取缓冲液、SDS和蛋白酶K，混匀，放入65℃水浴1.5-2.5 h；再加入NaCl溶液，混匀，10000 rpm离心20-30 min，取上清液；上清液中加入-20 ℃预冷的异丙醇，-20℃放置1.5~2.5 h；10000 rpm离心5-10 min弃上清，沉淀物用质量浓度75%的乙醇洗涤2~3次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸。

其中，所述的转基因油菜蜂花粉是液氮低温研磨破壁处理的，其条件是：将转基因油菜蜂花粉低温研磨到60-100目，液氮挥发性极强，整个研磨过程需不断添加液氮，使样品浸在样品中。

其中，所述的高盐提取缓冲液中组分包括0.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl、0.02 mol/L EDTA、1%SDS，pH范围7.7-8.3。

其中，该转基因油菜蜂花粉DNA的提取方法包括以下具体操作步骤：

（1）将蜂花粉0.08-0.12 g置于研钵中，加液氮研磨成60-100目粉末状，加入2 ml离心管中；

（2）在离心管中加入400 µL高盐提取缓冲液、40 µL质量浓度20% SDS和8 µL 的20 mg/ml蛋白酶K，充分混匀，放入65℃水浴1.5-2.5 h，期间每隔20 min上下颠倒混匀；

（3）取出离心管，冷却到室温，加入300 µL的 6 mol/L NaCl，以转速2500 rpm涡旋混匀20-30 s，10000 rpm离心20-30 min，取上清液；

（4）在上清液中加入是其2/3体积的-20 ℃预冷的异丙醇，-20℃放置2~3 h；

（5）10000 rpm离心5-10 min弃上清，沉淀物用质量浓度75%的乙醇洗涤2~3次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸；

（6）将油菜蜂花粉核酸溶于50-100 µL无菌水，于0~4℃保存，或于-20 ℃放置长期保存。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、利用物理低温的方法破坏花粉壁，释放花粉内容物，代替裂解液的使用，降低成本。

2、现行方法存在使用大量有毒试剂的问题，比如氯仿、β-巯基乙醇、异戊醇和饱和酚，此类试剂均有毒且发出难闻的气味，给实验操作者带来风险，并且容易污染环境，而本发明方法避免使用大量有毒试剂。

3、本发明从转基因油菜蜂花粉中提取到高质量的适宜于PCR检测的DNA，操作简单，低毒，耗时短，提取率高，利于快速检测，0.1 g油菜蜂花粉提取所得核酸用80 µL无菌水溶解可直接用于普通PCR检测，满足低含量外源基因检测的需要。

附图说明

图1为油菜蜂花粉总DNA电泳条带。

图2为油菜蜂花粉油菜内源PEP基因电泳条带。

图3为转基因油菜蜂花粉外源基因Bar基因电泳条带。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但应理解本发明的保护范围并不受具体实施例的限制。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1：选取普通油菜蜂花粉3份，使用本发明的方法进行下述提取：

（1）将0.08 g蜂花粉加液氮研磨成60目粉末状，加入2 ml离心管中；

（2）在离心管中加入400µL高盐提取缓冲液、40 µL质量浓度 20% SDS、8 µL的 20 mg/ml蛋白酶K，用匀浆机以2500 rpm充分混匀，放入65℃水浴1.5 h，期间每隔20 min上下颠倒混匀；

（3）取出离心管，冷却到室温，加入300 µL 6 mol/L NaCl，以2500 rpm涡旋混匀20 s，10000 rpm离心30 min，取上清液；

（4）在上清液中是其加入2/3体积的-20 ℃预冷的异丙醇，-20℃放置2 h；

（5）10000 rpm离心8 min弃上清，沉淀物用质量浓度75%的乙醇洗涤2次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸；

（6）将油菜蜂花粉核酸溶于50 µL无菌水，于0~4℃保存。

一、用琼脂糖凝胶电泳法检测实施例1提取的油菜蜂花粉总DNA，如图1所示，对3份普通油菜蜂花粉样品均检测到清晰的电泳条带，说明本方法适合油菜蜂花粉总DNA的提取。

二、分光光度计法检测实施例1提取的油菜花蜂花粉总DNA的质量和产量，用Eppendorf Biophotometer蛋白核酸测定仪检测其质量和产量，结果见下表：

由上表可见，本发明方法所提取的DNA中蛋白、多糖、多酚等杂质较少，DNA纯度高，故本发明方法适用于油菜蜂花粉总DNA的提取。

实施例2：选取普通油菜蜂花粉3份，使用本发明方法进行下述提取：

（1）将0.1 g蜂花粉加液氮研磨成80目粉末状，加入2 ml离心管中；

（2）在离心管中加入400 µL高盐提取缓冲液、40 µL 20% SDS、8 µL 20 mg/ml蛋白酶K，用匀浆机以2500 rpm充分混匀，放入65℃水浴2 h，期间每隔20 min上下颠倒混匀；

（3）取出离心管，冷却到室温，加入300 µL 6 mol/L NaCl，以2500 rpm涡旋混匀25 s，10000 rpm离心30 min，取上清液；

（4）在上清液中加入是其2/3体积的-20 ℃预冷的异丙醇。-20℃放置2.5 h；

（5）10000 rpm离心8 min弃上清，沉淀物用质量浓度75%的乙醇洗涤2次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸；

（6）将油菜蜂花粉核酸溶于80 µL无菌水，于0~4℃保存，用于PCR检测。

油菜内源基因PEP基因的PCR检测：扩增片段长248bp，正向引物：GCTAGTGTAGACCAGTTCTTG，反向引物：CACTCTTGTCTCTTGTCCTC；PCR反应体系：0.5 U Taq酶，2.5 µL 10× Buffer，2 µL 25 mmol/L MgCl₂，0.25 µL 10 mmol/L dNTPs，0.5 μL 10 μmol/L Primers，2.5 µL模板DNA；反应体积为25µl；扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

结果检测如下：

一、用琼脂糖凝胶电泳法检测用实施例2提取的油菜蜂花粉总DNA中PCR扩增得到的PEP基因，如图2所示，对3份油菜蜂花粉样品均检测到PEP基因清晰的电泳条带，说明本方法提取的油菜蜂花粉总DNA可以扩增到油菜内源基因PEP基因。

实施例3：选取转基因油菜蜂花粉3份，使用本发明方法进行下述提取：

（1）将0.12 g蜂花粉加液氮研磨成100目粉末状，加入2 ml离心管中；

（2）在离心管中加入400µL高盐提取缓冲液、40 µL 20% SDS、8 µL 20 mg/ml蛋白酶K，用匀浆机以2500 rpm充分混匀，放入65℃水浴2.5 h，期间每隔20 min上下颠倒混匀；

（3）取出离心管，冷却到室温，加入300 µL 6 mol/L NaCl，以2500 rpm涡旋混匀30 s，10000 rpm离心30 min，取上清液；

（4）在上清液中加入是其2/3体积的-20 ℃预冷的异丙醇。-20℃放置3 h；

（5）10000 rpm离心8 min弃上清，沉淀物用质量浓度75%的乙醇洗涤3次，去乙醇自然风干，即得油菜蜂花粉核酸；

（6）将油菜蜂花粉核酸溶于100 µL无菌水，于0~4℃保存，用于PCR检测。

转基因油菜外源基Bar基因的PCR检测：扩增片段长595bp，正向引物：CCTTCGCAAGACCCTTCCTC，反向引物：AAACCCACGTCATGCCAGTT；PCR反应体系：0.5 U Taq酶，2.5 µL 10× Buffer，2 µL 25 mmol/L MgCl₂，0.5 µL 10 mmol/L dNTPs，0.5 μL 10 μmol/L Primers，2.5 µL模板DNA；反应体积为25µL；扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

结果检测如下：

一、用琼脂糖凝胶电泳法检测用实施例3提取的转基因油菜蜂花粉总DNA中PCR扩增得到的Bar基因，如图3所示，对3份转基因油菜蜂花粉样品均检测到Bar基因清晰的电泳条带，说明本方法适提取的油菜蜂花粉总DNA可以扩增到油菜外源基因Bar基因。