一种捕获核基因组内相互作用的DNA片段的方法与流程

本发明涉及分子生物学实验技术领域，更特别地，涉及一种捕获核基因组内相互作用的DNA片段的方法。

背景技术：

高通量染色体构象捕获(High-throughput chromosome conformation capture，Hi-C)技术因可以获得全基因组所有位点间的的互作信息而受到广泛应用，其基本思想为根据染色质的物理空间位置来反应它们的相互作用关系。

目前的Hi-C实验方案主要有稀释Hi-C(DilutionHi-C)、原位Hi-C(in situ Hi-C)、以及核内Hi-C(in nucleus Hi-C)。通常的Hi-C方法一般包括以下步骤：甲醛处理细胞，使细胞中的染色质与其附近蛋白质交联起来，裂解细胞，用SDS灭活细胞的内源性酶，并用Triton X-100淬灭SDS；然后用限制性内切酶酶切染色质产生粘性末端，补平粘性末端，并在补平体系中添加生物素标记的一种核苷三磷酸，从而通过补平给酶切的末端加上生物素标记，用SDS灭活体系中的酶，防止后续连接反应得到的片段因酶切位点恢复而被内切酶再次切断；然后进行连接反应，使因与蛋白质结合而相互靠近的DNA链的末端连接，连接后使用蛋白酶K解交联；纯化DNA，并去除非连接的DNA末端的生物素，使DNA链片段化，然后用生物素-链霉亲和素作用捕获带有生物素标记的片段，加接头构建成文库，用于后期测序。

但现有的Hi-C方案均存在一定的问题：首先，稀释Hi-C因其大体系需消耗大量试剂(连接体系为原位Hi-C的6倍以上)，并且一般从细胞裂解到连接反应结束都在一个体系中进行，期间不进行纯化，这样导致体系越来越大，造成实验处理比较耗时，并且导致实验重现性差，得到的数据可信度和可重复性不高；其次，为减少噪音，核内Hi-C灭活内源性酶的方法通过使用SDS于37℃孵育60分钟来进行，由于处理时间过长会影响某些类型细胞的细胞核内部结构，造成此类方案的样品适用性较低；再次，核内Hi-C需要先使用内切酶酶切，通过补平添加标记后，再用连接酶将互作片段连接起来，为了防止在连接过程中内切酶再次酶切，所以常常通过加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)灭活内切酶并用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)猝灭SDS以使得后续反应顺利进行，同时增大了反应体系，增加了后续试剂消耗。

因此，需要一种新的捕获核基因组内相互作用的DNA片段的方法，减小反应体系，精简实验步骤，并降低噪音污染。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明提供了一种高通量染色体构象捕获方法，其包括以下步骤：

S1：取样品细胞，交联；

S2：裂解所述样品细胞；

S3：灭活内源性酶；

S4：限制性内切酶酶切基因组，所述限制性内切酶酶切双链DNA后产生带有5’突出的粘性末端，并且所述粘性末端被补平后与另一粘性末端补平后连接不产生所述限制性内切酶的酶切位点；

S5：补平S4中的限制性内切酶酶切产生的粘性末端，并加入标志物；

S6：使因与蛋白结合而相互靠近的DNA片段；

S7：将染色质片段化，捕获带有所述分子标记的片段，构建文库。

由于选取了特殊的限制性内切酶，其酶切位点补平后再连接不会恢复原酶切位点，可直接加入连接体系进行连接，不需要考虑后面的连接过程中内切酶再次切断连接的片段的问题，故而在酶切补平后无需向体系中再次加入SDS来灭活内切酶。精简了实验步骤，减小了反应体系。

进一步地，所述交联之后还使用胰酶进行消化，分散所述样品细胞。以使后续裂解中细胞与裂解液充分接触。

进一步地，S3中通过添加终浓度为0.5％SDS，62℃孵育10分钟来灭活内源性酶；S4与S5之间不灭活内切酶。一般的方法是通过添加0.1-0.3％SDS，65℃孵育10分钟来灭活内源性酶；然后在酶切后通过添加约1.48％SDS，65℃孵育30分钟来灭活内切酶。然而这样导致实验结果噪音很大，顺式互作的比例仅为45％作用。通过对SDS终浓度以及孵育温度和时间的重新设置，本发明大大提高了信噪比。

进一步地，使用SDS灭活内源性酶后，还添加TritonX中和所述SDS。以防止SDS处理过久损坏DNA结构。

进一步地，在裂解所述样品细胞后，离心弃上清，将沉淀用于后续操作，在灭活内源性酶后，离心弃上清，将沉淀用于后续操作。通过该操作可大幅减小反应体系。

进一步地，所述限制性内切酶为BamHI、HindIII、NcoI、ScaI、SpeI、XbaI中的一种或几种组合。

进一步地，所述标志物为生物素。

进一步地，所述生物素缀合于补平时向所述粘性末端添加的一种或多种核苷酸分子上。

附图说明

图1为HindIII酶切基因组后的电泳图；

图2为NheI酶切检验的电泳图；

图3为对文库DNA进行检测得到的2100胶图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

我们首先传代培养人类细胞系A549细胞，使其细胞融合度达到约80％。我们需要进行交联、裂解、酶切、连接、超声、二代建库、以及生物素捕获等一系列实验步骤，以获得高质量的Hi-C文库。具体的实验步骤是：

1)培养的细胞培养物弃培养液，用5mL 1x PBS(磷酸盐缓冲液)洗一遍，吸弃PBS；

2)加入5mL 1x PBS，然后加入5mL 2％多聚甲醛或甲醛(终浓度为1％，也直接加10mL 1x PBS配制的终浓度1％的多聚甲醛或甲醛)，于室温下孵育10分钟，每两分钟晃动一次，或直接放在摇床上缓慢摇晃，使细胞内的DNA与其附近的蛋白质交联；

3)加入1.11mL 2.0M甘氨酸(终浓度0.2M，1x PBS配制)，室温孵育5分钟，适当摇晃，中和多聚甲醛或甲醛；

4)吸弃缓冲液，加入2mL 0.25％胰酶37℃孵育10分钟(期间间隔几分钟摇晃一次)，加入两倍体积含10％胎牛血清的细胞培养基，用细胞刮收集细胞于2个15mL管(交联后的细胞很难消化下来)，轻微吹打分散细胞，过细胞筛(一般直接倾倒即可)，650g室温离心5分钟，弃上清，-80℃冻存交联的细胞待用；

5)取出冻存的交联细胞于冰上融化，将细胞重悬于250μL冷裂解液(Tris-HCl pH8.0 10mM，氯化钠10mM，NP40 0.2％，1X蛋白酶抑制剂(货号Roche-4693116001))中，2500g 4℃离心5分钟，吸弃上清；将沉淀重悬于250μL冷裂解液(Tris-HCl pH8.0 10mM，氯化钠10mM，NP40 0.2％，1X蛋白酶抑制剂(货号Roche-4693116001))中，孵育15分钟；2500g 4℃离心5分钟，弃上清；

6)将沉淀重悬于50μL含0.5％SDS的1×NEBuffer 2中，小心吹打，注意不要产生气泡，62℃孵育10分钟；加入65μL水和25μL TritonX-100，小心吹打，注意不要产生气泡，37℃孵育15分钟(总体系140μL，取10μL用于基因组完整性质控),3000g 2分钟，弃上清；

7)将沉淀重悬于100μL酶切体系中(水80μL，10×NEBuffer2.1 10.0μL，10U/μL HindIII 10.0μL)，混匀，37℃过夜(总体系100μL，取10μl用于基因组酶切效果质控)；

8)补平，向酶切后的体系中添加补平体系，其中一种核苷三磷酸由生物素标记(水11.8μL，10×NEBuffer2 2.0μL，10mM dATP 0.6μL，10mM dGTP 0.6μL，10mM dTTP 0.6μL，5mM biotin-14-dCTP 1.2μL，5U/μL Klenow 3.2μL)，温和地上下吹打混匀，于37℃旋转孵育45分钟；

9)连接，向补平后的体系中添加292μL连接体系(水172μL，10％Triton X-100 40μL，10×T4ligation buffer 40μL，1U/μL T4DNA ligase 40μL)，颠倒混匀，16℃孵育4小时；

10)加入10μL 20mg/mL蛋白酶K 65℃孵育2小时，然后载入10μL 20mg/mL蛋白酶K，65℃孵育过夜(解交联)；

11)将反应混合液冷却到室温，一倍氯仿分离回收上清，加入1/10体积醋酸钠及两倍体积乙醇-20℃沉淀30分钟，两次75％乙醇清洗(弹起沉淀)，吹干，回收产物溶解在50uL EB，通过添加2uL 1mg/mL RNAse在37℃温育30分钟以降解所有的RNA。NanoDrop测定浓度(储存于-20℃)；

12)通过跑胶鉴定酶切、连接的效果。A549细胞系基因组酶切前DNA片段，HindIII酶切后的片段，连接后DNA片段的电泳结果，结果如图1所示，酶切和连接均正常工作；

13)将得到的DNA进行去末端微生物素处理，体系如下：水84.83μL，DNA 2.5μg，10×NEBuffer2.1 10.0μL，10mM dGTP 1.0μL，3U/μL T4DNA Ploymerase 1.67μL，于12℃孵育2小时，然后加入2μL 0.5M EDTA终止反应；

14)取130μL，使用Covaris超声，将DNA片段化为400bp左右(超声程序选择400bp程序)；

15)Ampure Beads纯化回收DNA，回收产物溶解在30ul EB，NanoDrop测定浓度，Illumina试剂盒建库试剂盒(NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina，NEB-E7370S)建库标准步骤补平末端碱基dATP及接头，使用Ampure Beads标准DNA纯化回收步骤回收加接头后的DNA，磁珠(MyOne^TMStreptavidin C1，Thermo Fisher-650-01)，按说明书标准步骤捕获生物素标记片段，Illumina试剂盒建库(100μL，至12循环)，切胶回收400-600bp之间的条带(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen-28706)，用NheI对文库进行酶切，酶切条带相比于未酶切条带明显下移(图2)，说明文库中含大量新形成的NheI酶切位点，即此Hi-C文库大部分为嵌合片段；

16)平末端连接试剂盒(pEASY-Blunt Simple Cloning Kit，全氏金-CB111-01)把文库片段连接至T1载体中，转化感受态，挑取16个单克隆用于测序，测序结果显示，文库的DNA顺式互作、反式互作、不可用片段的比例为11:2:3，符合顺式互作比例大于60％的质控要求；

17)使用2100对文库片段大小进行检测，如图3所示，文库中的片段大小比较集中，适用于进行高通量测序。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。