一种基于脂质体的对界面快速修饰亲和素的方法与流程

本发明涉及一种以脂质体作为介质，快速对界面进行亲和素修饰的方法。本发明属于纳米界面材料领域。

背景技术：

以单个酶分子为研究对象的单分子酶学领域是科学研究的热点和前沿。通常情况下，单分子酶学研究采取某种方法将单分子酶进行固定，并利用单分子荧光显微镜实时记录酶在催化过程中产生的荧光信号的强度变化，从而重构出单个酶分子催化过程中的独特的动态过程。单分子酶学以微观的视角，揭示了隐藏在整体平均水平下，单个酶分子与底物作用时的动态波动，加深了人们对不同反应体系的理解，因而自诞生以来受到生物学领域的广泛关注。

在单分子酶学研究中，需要对所研究对象进行长期观察得到足够丰富的催化信息，因而酶在界面上的固定十分重要。通常情况下，最简便的方法是采用将界面进行亲和素修饰（streptavidin）后，将生物素化的酶分子进行固定。如将带有生物素的牛血清蛋白（biotin-BSA）或聚乙二醇（biotin-PEG）与界面进行孵育后，固定亲和素（avidin），进而固定生物素化的酶分子。以上方法已在单分子研究中进行广泛的应用，然而，该方法费时繁琐，并且由于BSA及PEG易于团聚，在修饰过程中容易出现修饰不均匀、界面封闭不完全的现象。同时在用生物素化聚乙二醇进行修饰时，需提前对玻璃进行硅烷化修饰，易造成玻璃表面的杂质团聚，影响对单分子荧光的观测。因而需要开发一种简便、均匀并且背景干净的界面修饰方法。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提出一种基于脂质体的对界面快速修饰亲和素的方法，以脂质体作为介质，在玻片表面进行亲和素修饰的方法。该方法具有快速、简便、修饰均匀且界面干净平整的特点。在本发明的技术方案中，以1，2-二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）为主，加入生物素化的磷脂酰乙醇胺，合成带有生物素的脂质体，以此脂质体孵育玻片，并随后再孵育亲和素，即得到修饰好亲和素的玻片。

一种基于脂质体的对界面快速修饰亲和素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将一定量的磷脂与生物素化的磷脂酰乙醇混合，加入氯仿搅拌均匀后超声，通入流通的氮气吹干，并真空干燥除去残余的有机溶剂；随后加入中性溶液促使磷脂膜重新水化，利用挤压器配以不同尺寸孔径的膜挤压多次后可形成尺寸不等的脂质体；

（2）玻片分别用洗剂、超纯水、丙酮、氢氧化钠溶液和超纯水清洗干净后，放入1%氢氟酸溶液中浸泡数十秒后，用纯水洗净，氮气吹干；玻片放于干净的器皿中，滴加一定量合成的脂质体，以高于相变温度孵育若干分钟后，用超纯水洗净过量的脂质体；随后，加入亲和素孵育若干分钟后，用超纯水或溶液洗去过量的亲和素，即可得到表面修饰有亲和素的玻璃界面。

所用的磷脂为1，2-二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二亚油酰磷脂酰胆碱（DLPC）、二花生酰基磷脂酰胆碱（DAPC）磷脂酰胆碱中的一种或其组合。

合成的脂质体粒径大小为50~200 nm。

所用的亲和素为链霉亲和素。

磷脂与生物素化的磷脂酰乙醇的比例在80:1-120:1。

根据所修饰的玻璃尺寸，一般滴加合成的脂质体的体积在50-300微升。

脂质体高于相变温度与玻片孵育5-10 min，孵育期间脂质体不能干燥。

该方法通过控制条件可以制备不同尺寸的带有生物素的脂质体，在孵育亲和素后，可得到修饰有亲和素的界面。该方法修饰步骤简便、快速，修饰均匀、封闭完全，并且由于修饰过程中不引入硅烷化等试剂，背景干扰较小。所制备的界面能满足单分子酶学研究的要求。

本发明的特点在于：本发明以脂质体作为介质在玻璃界面修饰亲和素，所用材料生物相容性好，且仅在界面表面只铺一层脂质体，界面修饰均匀，封闭完全。本发明修饰方法简便，操作简单，节省时间，背景干净，降低了背景信号对靶标单分子荧光的干扰。

附图说明

图1为实施例1所制备的脂质体的粒径图。

图2为实施例1所制备的脂质体的原子力显微镜成像图。

图3为实施例1所制备的亲和素玻璃界面的荧光显微镜成像图。

图4为实施例1所制备的亲和素修饰的界面孵育生物素标记Cy5荧光分子后的荧光显微镜成像图。

图5为实施例2所制备的脂质体的粒径图。

图6为实施例2图4 实施案例2所制备的亲和素修饰的界面孵育标记绿色荧光及生物素纳米小球后的荧光显微镜成像图。

图7为实施例3所制备的脂质体的粒径图。

图8为实施例1所制备的亲和素修饰的界面孵育atto-488荧光及生物素标记的DNA后的荧光显微镜成像图。

具体实施方式

通过以下具体的实施案例对本发明的技术作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

实施例1：

将 DOPC与生物素化的磷脂酰乙醇以100:1的比例溶解于5 mL氯仿中，混合均匀后，加入流动的氮气吹干，随后真空干燥3 hr除去残余的有机溶剂。在所得的磷脂中1 mL加入PBS（pH=7.4）使单层磷脂水化，终浓度达到 5 mg/mL。采用带有50 nm孔径滤膜的挤压器挤压20次，即可得到带有生物素的脂质体。玻片分别用洗剂、超纯水超声10分钟，随后丙酮、氢氧化钠溶液超声30分钟后，超纯水冲洗干净后，放入1%氢氟酸溶液中浸泡约30秒后，用超纯水洗净，氮气吹干待用。玻璃表面贴上围栏，将100 μL所制备的脂质体加入围栏里，随后在45℃孵育10分钟。随后，采用PBS置换20次，洗净过量的脂质体。在围栏中加入0.2 mg/mL亲和素孵育10分钟后，用PBS置换20次，洗去过量的亲和素，即可得到表面修饰有亲和素的玻璃界面。将100 pM生物素化的荧光分子Cy5与修饰了亲和素的玻璃孵育10分钟后，采用PBS置换20次洗去溶液中游离的荧光分子，利用荧光显微镜观测。图1为所制备的脂质体的粒径分布图，由图可见，脂质体粒径大概为75 nm。同时图2表明脂质体在界面上可形成平整均匀的膜。由图3可见，561 nm激光照射下，单纯只修饰了亲和素的玻璃界面背景非常干净。同时由图4可见，亲和素玻璃界面可以观测到界面修饰的cy3荧光分子，因而可以被利用进行对单分子酶或底物的固定并进行单分子研究。

实施例2：

将 DOPC与生物素化的磷脂酰乙醇胺以100:1的比例溶解于5 mL氯仿中，混合均匀后，加入流动的氮气吹干，随后真空干燥3 hr除去残余的有机溶剂。在所得的磷脂中加入 1 mL PBS（pH=7.4）使单层磷脂水化，终浓度达到 5 mg/mL。采用带有100 nm孔径滤膜的挤压器挤压20次，即可得到带有生物素的脂质体。玻片分别用洗剂、超纯水超声10分钟，随后丙酮、氢氧化钠溶液超声30分钟后，超纯水冲洗干净后，放入1%氢氟酸溶液中浸泡约30秒后，用超纯水洗净，氮气吹干待用。玻璃表面贴上围栏，将100 μL所制备的脂质体加入围栏里，随后在45℃孵育10分钟。随后，采用PBS置换20次，洗净过量的脂质体。在围栏中加入0.2 mg/mL亲和素孵育10分钟后，用PBS置换20次，洗去过量的亲和素，即可得到表面修饰有亲和素的玻璃界面。将稀释10⁶倍生物素标记的绿色荧光小球与修饰了亲和素的玻璃孵育3分钟后，采用PBS置换20次洗去溶液中游离的荧光小球，利用荧光显微镜观测。图5为实施案例2所制备的脂质体的粒径分布图，由图可见，脂质体粒径大概为100 nm。同时由图6可见，亲和素玻璃界面可以进一步结合生物素修饰的绿色荧光小球，因而可以被利用进行对单分子酶或底物的固定并进行单分子研究。

实施例3：

将 DOPC与生物素化的磷脂酰乙醇胺以100:1的比例溶解于5 mL氯仿中，混合均匀后，加入流动的氮气吹干，随后真空干燥3 hr除去残余的有机溶剂。在所得的磷脂中加入PBS（pH=7.4）使单层磷脂水化，终浓度达到 5 mg/mL。采用带有200 nm孔径滤膜的挤压器挤压20次，即可得到带有生物素的脂质体。玻片分别用洗剂、超纯水超声10分钟，随后丙酮、氢氧化钠溶液超声30分钟后，超纯水冲洗干净后，放入1%氢氟酸溶液中浸泡约30秒后，用超纯水洗净，氮气吹干待用。玻璃表面贴上围栏，将100 μL所制备的脂质体加入围栏里，随后在45℃孵育10分钟。随后，采用PBS置换20次，洗净过量的脂质体。在围栏中加入0.2 mg/mL亲和素孵育10分钟后，用PBS置换20次，洗去过量的亲和素，即可得到表面修饰有亲和素的玻璃界面。将10 pM 同时标记atto-488荧光分子与生物素的DNA与修饰了亲和素的玻璃孵育10分钟后，采用PBS置换20次洗去溶液中游离的荧光分子，利用荧光显微镜观测。图7为实施案例3所制备的脂质体的粒径分布图，由图可见，脂质体粒径大概为200 nm。由图8可见，亲和素玻璃界面可以进一步结合生物素及atto-488修饰的DNA，因而可以被利用进行对单分子酶或底物的固定并进行单分子研究。