一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法与流程

本发明属于功能性纤维领域，具体涉及一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法。

背景技术：

利用含有功能性基团的高聚物为基体，通过混纺技术，合成具有特定表面性质的功能性高分子材料用以固定脂肪酶一直是酶固定领域的研究重点。表面富含羧基的PMA-AA纳米纤维虽然具有较大的比表面积，但该基体在接枝反应过程中，形态结构不稳定，甚至于完全失去纳米纤维形态，此外该纳米纤维呈现疏水性能。

静电纺丝技术制备纳米纤维，当前此类酶固定载体一方面以普通聚合物为基体，此类基体生物相容性差，难以为酶提供温和的微环境。另一方面以吸附或者共价键的方式接枝壳聚糖等生物相容性材料对纳米纤维表面进行改性；此类方法步骤繁琐，由于较大的空间位阻，接枝率低；物理吸附的改性材料容易脱落。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法，以PMA-AA纳米纤维为基体，通过静电纺丝技术混纺透明质酸钠。对混纺后得到的纤维进行酸化，得到混纺有透明质酸的纳米纤维，形态稳定，孔隙率高，比表面积大，表面含有大量的羧基。将其作为脂肪酶的固定化载体进行固定化酶，形态稳定，有较高的稳定性和活性。

本发明提供的一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法，包括以下步骤：

1)将PMA-PAA溶液与透明质酸钠溶液混合，震荡混匀后，即得到纺丝前驱体溶液；

2)取纺丝前驱体溶液，采用静电纺丝技术进行纺丝，得到纳米纤维膜；

3)室温下，将纳米纤维膜冲洗后，浸泡于盐酸溶液中，再冲洗去除表面盐酸，吹干后置于EDC/NHS溶液中反应活化，再冲洗，吹干后置于酶溶液中，震荡反应后，即得透明质酸混纺纳米纤维固定酶。

进一步的，步骤1)中，所述PMA-PAA溶液的制备方法为：

将2mL丙烯酸和14mL丙烯酸甲酯溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.2～0.3g偶氮二异丙腈，充氮气10～12min后，放到60～80℃恒温水浴锅加热，反应15～24小时，即可得到黏稠、透明、均一的PMA-PAA溶液。

步骤1)中，所述透明质酸钠溶液的制备方法为：

将DMF溶液和蒸馏水混合后，将透明质酸钠固体加入其中，溶解得到透明质酸钠溶液；其中，DMF溶液、蒸馏水和透明质酸钠固体的用量比为：3ml:3ml：8～48mg。

步骤(1)中透明质酸钠溶液与PMA-PAA溶液的体积比为(0.5-3):5。

步骤2)中所述静电纺丝技术进行纺丝具体为：纺丝在室温条件下进行，湿度30％～40％，溶液注射速度为0.3～0.5mL/h，电压为16～18kV，喷丝口与接收屏距离为12～18cm，针头直径为5.5mm针头接入正极，铝箔接入负极。纺丝液在电场中产生稳定细流，细流经过分裂与拉伸，最终收集到接收铝箔上，接收时间24～26小时。所纺出纤维直径在200-500nm。

步骤3)中所述盐酸溶液浓度为0.01mol/L；纳米纤维膜与盐酸溶液的体积比为：1:5g/mL；浸泡时间为1h；

步骤3)中所述EDC/NHS溶液中EDC和NHS的摩尔比为1:2；优选的，EDC和浓度0.1M，NHS的浓度0.2M。

步骤3)中纳米纤维膜在EDC/NHS溶液中活化时间为0.6-1.5h；

进一步的，步骤3)中，所述酶溶液酶浓度在4～10mg/mL；优选的为南极假丝酵母酶溶液；所述震荡反应是指25℃水浴中振荡反应18-24小时；

步骤3)具体为：

取步骤2)制备的纳米纤维膜，用蒸馏水和磷酸盐缓冲溶液分别冲洗后，将纳米纤维膜放入0.01mol/L的盐酸溶液浸泡1h，取出后用磷酸盐缓冲溶液反复冲洗，以除去表面粘附的盐酸，将酸化的膜分别浸入磷酸盐缓冲溶液和超纯水中超声1分钟，取出吹干保存备用，然后，在25℃水浴条件下，将纳米纤维膜放入EDC/NHS溶液中反应活化1h，活化的膜用磷酸盐缓冲溶液和超纯水冲洗，以除去表面粘附的活化剂，吹干后，将表面活化的纳米纤维膜浸入配制好的南极假丝酵母酶溶液中，酶浓度在4～10mg/mL，于25℃水浴中振荡反应20小时后将膜取出，用磷酸盐缓冲溶液和超纯水冲洗，以除去表面附着的酶液，晾干备用。

所述磷酸盐缓冲溶液浓度为0.05M，pH为7.0。

酶载量测定：

首先将100mL 95％乙醇、200mL88％磷酸和350mg考马斯亮蓝混合，配置Bradford储存液，在棕色瓶中4℃保存。然后将蒸馏水、88％磷酸、95％乙醇、和Bradford储存液按425：15：30：30的体积混合，用滤纸过滤，将工作液在棕色瓶中4℃保存。每次使用前需要再过滤。移取0.3mL牛血清蛋白(BSA)溶液和3.0mLBradford工作液于干燥洁净的小离心管中，充分混合，于25℃水浴振荡下密闭显色10min。同时取0.3mLPBS(0.o5M，pH7.0)和3.0mLBradford工作液混合，于25℃水浴振荡下显色10min，作为空白。用紫外分光光度计于710nm处检测蛋白溶液的吸光度。将样品溶液的吸光度值与脂肪酶标准曲线比较，确定其蛋白浓度。依据下面公式计算酶载量。

式中，Ae：载酶量(mg/g)，C₀：固定化前酶液中蛋白质浓度(mg/mL)配制1mg/mL浓度的CALB脂肪酶液。C：固定化后酶液中蛋白质浓度(mg/mL)，V：固定化酶所用酶溶液的体积(mL)，取15mL。C_W：洗涤固定化酶后PBS缓冲液中的酶液浓度(mg/mL)，V_W：所用PBS缓冲液的体积(mL)，取4mL。W：纳米纤维膜的质量。

酶活测定：

取一定浓度橄榄油于圆底烧瓶中，加入40-60mg的固定化酶膜材料，搅拌10min，立即加入8mL甲苯，继续搅拌10min，终止反应，将萃取生成的脂肪酸取4ml溶液转移至离心试管中，离心取上层有机相加入1mL显色剂，产生的脂肪酸与Cu生成绿色络合物。离心取上层含有脂肪铜的甲苯溶液，用分光光度计在710nm处测其吸光度，以甲苯为标准液，4组离心液为待测液，每组测三次，取其平均值，即得该待测液的吸光度，一分钟释放1μM的脂肪酶为1单位酶活。

本发明是基于静电纺丝技术制备混纺PMA-AA@透明质酸纳米纤维，从而使其具有生物相容性好，保水性能好，固定位点多等特征，提高固定酶的各类性能。传统酶固定所用的静电纺纳米纤维固定位点少、生物相容性差。而透明质酸的混纺可有效提高载体的生物相容性和保水性。研究还发现：透明质酸钠浓度为0.5mg/L时，酶载量最高，达143mg/g；此外，相比于游离酶，该固定化酶对于pH、温度、时间耐受性有显著增加。

与现有技术相比，本发明利用静电纺丝技术，使用生物相容性好且具有特殊保水性的透明质酸改性纳米纤维，并将此功能性纳米纤维应用于酶的固定，操作相对简便且能制备特定的固定化酶技术，在上述实验技术的操作下，本发明具有如下效果：

(1)本发明所述的混纺PMA-AA@透明质酸纳米纤维形态稳定、孔隙率高、比表面积大，并含有大量的羧基。

(2)本发明所述的PMA-AA@透明质酸纳米纤维可应用于酶固定领域，显著提高酶的固载量和活性，具有显著的功能性。

附图说明

图1混纺PMA-AA@透明质酸钠纳米纤维SEM形貌图；

图2混纺PMA-AA@透明质酸钠纳米纤维固定酶SEM形貌图；

图3是固定化酶和游离酶的在不同pH下的对比图；

图4是固定化酶和游离酶的在不同温度下的对比图；

图5是固定化酶和游离酶储存不同时间的对比图；

图6为反应过程示意图。

具体实施方式

实施例1

一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)透明质酸溶液的配置

用量取1.5mLDMF溶液和1.5mL蒸馏水加入试管中，用电子天平称取4mg透明质酸钠固体加入其中溶解得到透明质酸钠溶液。

(2)PMA-AA二元共聚体的配置

将2mL丙烯酸和14mL丙烯酸甲酯溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.2～0.3g偶氮二异丙腈，充氮气10～12min后，放到60～80℃恒温水浴锅加热，反应15～24小时，即可得到黏稠、透明、均一的PMA-PAA溶液。(3)纺丝前驱体的配置

量取5mLPMA-PAA溶液加入3mL透明质酸钠溶液，充分振荡后即得到纺丝前驱体溶液。

(4)静电纺丝法制备含透明质酸的纳米纤维膜

采用静电纺丝装置进行复合电纺纤维的制备。纺丝在室温条件下进行，湿度30％，溶液注射速度为0.3mL/h，电压为18kV，喷丝口与接收屏距离为18cm，针头直径为5.5mm针头接入正极，铝箔接入负极。纺丝液在电场中产生稳定细流，细流经过分裂与拉伸，最终收集到接收铝箔上，接收时间24小时。

(5)酶的固定化

取60mg混纺的纳米纤维膜，分别用蒸馏水和磷酸盐缓冲溶液分别冲洗后，将纳米纤维膜放入0.01mol/L的盐酸溶液浸泡1h，取出后用磷酸盐缓冲溶液反复冲洗，以除去表面粘附的盐酸，将酸化的膜分别浸入磷酸盐缓冲溶液和超纯水中超声1分钟，取出吹干，然后将纳米纤维膜放入含有0.1M EDC和0.2M NHS混合溶液中，在25℃水浴中浸泡1h后取出。活化的膜用磷酸盐缓冲溶液和超纯水冲洗，以除去表面粘附的活化剂，吹干备用。将表面活化的纳米纤维膜浸入6mg/mL酶溶液中，于25℃水浴中振荡反应20小时后将膜取出。用大量PBS和超纯水冲洗，晾干备用。

(6)酶载量测定。首先将100mL95％乙醇、200mL88％磷酸和350mg考马斯亮蓝混合，配置Bradford储存液，在棕色瓶中4℃保存。然后将蒸馏水、88％磷酸、95％乙醇、和Bradford储存液按425:15:30:30的体积混合，用滤纸过滤，将工作液在棕色瓶中4℃保存。每次使用前需要再过滤。移取0.3mL蛋白溶液和3.0mLBradford工作液于干燥洁净的小离心管中，充分混合，于25℃水浴振荡下密闭显色10min。同时取0.3mLPBS(0.o5M，pH7.0)和3.0mLBradford工作液混合，于25℃水浴振荡下显色10min，作为空白。用紫外分光光度计于710nm处检测蛋白溶液的吸光度。将样品溶液的吸光度值与脂肪酶标准曲线比较，确定其蛋白浓度。酶载量高达143mg/g。

实施例2

一种透明质酸混纺纳米纤维固定酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)透明质酸溶液的配置

用量取1.5mLDMF溶液，1.5mL蒸馏水加入试管中，用电子天平称取4mg透明质酸钠固体加入其中溶解得到透明质酸钠溶液。

(2)PMA-AA二元共聚体的配置

将2mL丙烯酸和14mL丙烯酸甲酯溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.2～0.3g偶氮二异丙腈，充氮气10～12min后，放到60～80℃恒温水浴锅加热，反应15～24小时，即可得到黏稠、透明、均一的PMA-PAA溶液。

(3)纺丝前驱体的配置

量取5mLPMA-PAA溶液加入0.5mL透明质酸钠溶液，充分振荡后即得到纺丝前驱体溶液。

(4)静电纺丝法制备含透明质酸的纳米纤维膜

采用静电纺丝装置进行复合电纺纤维的制备。纺丝在室温条件下进行，湿度30％左右，溶液注射速度为0.3mL/h，电压为18kV，喷丝口与接收屏距离为18cm，针头直径为5.5mm针头接入正极，铝箔接入负极。纺丝液在电场中产生稳定细流，细流经过分裂与拉伸，最终收集到接收铝箔上。接收时间24小时。

(5)酶的固定化

取60mg混纺的纳米纤维膜，分别用蒸馏水和磷酸盐缓冲溶液分别冲洗后，将纳米纤维膜放入0.01mol/L的盐酸溶液浸泡1h，取出后用磷酸盐缓冲溶液反复冲洗，以除去表面粘附的盐酸，将酸化的膜分别浸入磷酸盐缓冲溶液和超纯水中超声1分钟，取出吹干，然后将纳米纤维膜放入含有0.1M EDC和0.2M NHS混合溶液中，在25℃水浴中浸泡1h后取出。活化的纳米纤维膜用大量PBS和超纯水冲洗，吹干备用。将表面活化的纳米纤维膜浸入6mg/mL酶溶液中，于25℃水浴中振荡反应20小时后将膜取出。用大量PBS和超纯水冲洗，晾干备用。

(6)酶载量测定：

首先将100mL95％乙醇、200mL88％磷酸和350mg考马斯亮蓝混合，配置Bradford储存液，在棕色瓶中4℃保存。然后将蒸馏水、88％磷酸、95％乙醇、和Bradford储存液按425:15:30:30的体积混合，用滤纸过滤，将工作液在棕色瓶中4℃保存。每次使用前需要再过滤。移取0.3mL蛋白溶液和3.0mLBradford工作液于干燥洁净的小离心管中，充分混合，于25℃水浴振荡下密闭显色10min。同时取0.3mLPBS(0.05M，pH7.0)和3.0mLBradford工作液混合，于25℃水浴振荡下显色10min，作为空白。用紫外分光光度计于710nm处检测蛋白溶液的吸光度。将样品溶液的吸光度值与脂肪酶标准曲线比较，确定其蛋白浓度，酶载量62mg/g。