基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法

专利名称：基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，具体是一种基于革兰氏阳性安全 微生物的透明质酸的异源合成方法。
背景技术：
透明质酸(Hyaluronic Acid,以下简称HA)为一种线性不分支高分子多糖，以 UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GIcUA)以及UDP-N-乙酰葡萄糖氨(UDP-N_GlcNAc)两种前体经透 明质酸合成酶(HA synthases,HAS)催化合成，其平均分子量可高达到数百万道尔顿。它作 为一种多功能基质，广泛分布于人体组织器官，以其独特的分子结构和理化性质在机体的 正常生理活动中发挥非常重要的作用，如润滑关节、维持皮肤良好的弹性、调节血管壁的通 透性、刺激调节免疫系统、调节蛋白质以及水电解质扩散及运转与促进创伤愈合等，其与机 体的生理与病理的关系非常密切。HA已经广泛用于制备关节疾病治疗的药物(Mazieres， et al 2007)、药物输送载体(Fuente，et al 2008 ；Bechara, et al 2008)、皮肤填充剂 (Romagnoli, et al 2008 ；Tezel and Fredrickson, 2008)(Leonelli, et al 2008)等医药领域方面。目前有两种HA的生产方法，一种是从鸡冠等动物组织里提取，另一种是采用链球 菌C群中的一些减毒菌株(兽疫链球菌或马疫链球菌等)进行发酵，从发酵液中提取。从 鸡冠中提取的HA虽然早已批准用于上述医药领域，然而，从中提取的HA结合有大量的糖蛋 白以及糖脂，使得其分离纯化非常困难，得率非常低(每百克鸡冠仅能提取0. 4克的纯品)。 而且，鸡冠来源的透明质酸易受到种间病毒因子以及其它致病因子的污染。由于从动物组 织中提取HA的以上不足，人们逐渐把目光转向微生物发酵来制备HA。目前研究最多的就 是采用兽疫链球菌或类马疫链球菌来发酵生产HA。但由于上述链球菌属于条件致病菌，对 生产人员的健康以及环境存在潜在的危害，越来越多的研究表明该类链球菌亦能产生一定 fi的内(endotoxin)以&胃个生(virulence factors) (Leonard, et al 1998 ； Steiner and Malke,2002 ；Hashikawa, et al 2004 ；Lindsay, et al 2009)，使得从发酵液 中提取的HA存在包括内毒素在内的毒性因子污染的可能性。目前医药领域使用的HA仍然 采用从鸡冠等组织中提取，其提取工艺复杂与原料的来源非常有限使产品价格非常昂贵。 因此研究一种提取方法简单、原料易得、生产安全以及无毒素因子的新型的透明质酸的制 备方法显得非常必要。经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN1636052A，
公开日2005_7_6， 记载了一种“在重组宿主细胞中产生透明质酸的方法”，中国专利文献号CN101426925A，
公开日2009-5-6，记载了一种“在芽孢杆菌细胞中生产透明质酸的方法”，以及美国专利 文献号 US2002/0160489,
公开日
2002-10-31，记载 了一种"Str印tococcus equisimilis hyaluronan synthase gene andexpression thereof in Bacillus subtilis (才古草芽f包杆 菌的str印tococcus equisimilis透明质酸合成酶基因和其表达式)”，该技术利用枯草芽 孢杆菌作为宿主，将来源于Str印tococcusequisimilis透明质酸合成酶基因及其调控序列整合到枯草芽孢杆菌宿主基因组中并实现透明质酸的合成。上述现有技术的共性在于描述了采用枯草芽孢杆菌作为宿主，将合成透明质酸的 相关基因与组成型淀粉酶基因的启动子构成一个人工操纵子，所有的基因均利用该组成型 淀粉酶基因的启动子来启动转录，透明质酸的合成与宿主细胞的增殖是同步进行。上述技 术虽然能够实现透明质酸在枯草芽孢杆菌中的异源合成，但是存在显而易见的问题是随 着透明质酸的合成，发酵培养基的粘度也逐渐上升，溶氧量也迅速下降，细胞获取氧的能力 也迅速下降，细胞的生物量也增加缓慢或停止增加，由此而导致细胞合成透明质酸的能力 迅速下降。

发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于革兰氏阳性安全微生物的透 明质酸的异源合成方法，通过将宿主细胞的生长与透明质酸的合成分开进行大大提高了宿 主细胞合成透明质酸的能力，不但实现透明质酸在安全的革兰氏阳性微生物中的合成，而 且其合成即可以是组成型的，也可以是被诱导的。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤第一步、从革兰氏阳性安全微生物宿主中分离与透明质酸前体(即UDP-葡萄 糖醛酸与UDP-N-乙酰-葡萄糖氨)的合成相关的基因，这些基因包括UDP-葡萄糖脱 氢酶基因(UDP-glucose dehydrogenase gene)，即 SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 33、SEQID No. 34 ；UTP-葡萄糖-1-磷酸转移酶基因(UTP-glucose-1-phosphate Uridyltransferasegene)，即 SEQ ID No. 35、SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 37 ；葡萄糖 _6_ 磷 酸变位酶基因(Phosphoglucomutase gene),即 SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 39 ；葡萄 糖-6-磷酸异构酶基因(Phosphoglucoisomerase gene)，即SEQ ID No. 40 ；氨基转移酶 (Aminotransferase)，即SEQ ID No. 41、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基 因(N-Acetyl-glucosamine-l-phosphate uridyltransferase gene),艮口 SEQ ID No. 42、 SEQ IDNo.43。所述的革兰氏阳性安全微生物宿主是指以下菌中的任一种Clostridium butyricum( 丁酸梭菌或酪酸梭菌)、Bacillus Iicheniformis (地衣芽孢杆菌)、 Bacillus amyloliquefaciens (角军淀粉芽孢杆菌)、Bacillus cereus (有益或无毒赌 样芽孢杆菌)、Bacillus brevis (短芽孢杆菌)、Bacillus pumilus (短小芽孢杆菌)、 Brevibacillus brevis (短短芽孢杆菌)>Baci 1 lusstearothermophiIus (嗜热月旨肪芽孢杆 菌)、Bacillus megaterium(巨大芽孢杆菌)、Bacillusnatto (纳豆芽孢杆菌)、Bacillus subtilis (枯草芽孢杆菌)、Geobacillus stearothermophilus (嗜热脂肪地芽孢杆菌)、 Bacillus coagulans (^ifelf lif)、Bacillus lentus (lif)、Bactroides amylophi Ius (嗜淀粉拟杆菌)。第二步、按照步骤一所述的革兰氏阳性安全微生物宿主的密码子偏好性对SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 48 以及 SEQ ID No. 49 进 行碱基替换进行密码子优化，分别得到SEQ ID No. 1到SEQ ID No. 27共27种不同的序列， 这些密码子优化的序列在革兰氏阳性安全微生物宿主中能更好地表达；所述的含有SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 47 以及SEQ ID No. 48基因的微生物依次分别为兽疫链球菌(Sti^ptococcus zoo印idemicus)、 类马疫链球菌(Streptococcus equisimilis)、绿草履虫小球藻病毒1 (Paramecium bursaria Chlorella virusl)、化脓链球菌(Streptococcus pygenes)以及乳房链球菌 (Streptococcus uberis)。所述绿草履虫小球藻是一对共生系统，小球藻在绿草履虫中生长繁殖，同时又能 提供绿草履虫所需要的营养。在小球藻中存在一种病毒，该病毒基因组中含有透明质酸合 成酶基因，该基因的表达能在小球藻中合成透明质酸。所述的进行碱基替换是指按照宿主基因组的密码子偏好性进行密码子优化，将 来自其它非宿主菌的与透明质酸合成相关的基因按照宿主菌的基因在翻译成蛋白质时所 采用的密码子偏好性进行碱基替换，但不改变碱基编码的氨基酸的种类，使来自其它非宿 主菌的与透明质酸合成相关的基因能够在宿主菌中高效的表达。第三步、将来自SEQ ID No. 1到SEQ ID No. 27中的任一种基因以及SEQ ID No. 31 到SEQID No. 43基因的一种以上的基因与组成型启动子或者可诱导启动子组成一个基因表 达盒。所述的组成型启动子是指宿主菌在培养的任何时期均具有转录活性的启动子。所述的可诱导启动子是指在宿主菌培养的特定时期才具有转录活性的启动子， 具体包括化学诱导启动子和物理诱导启动子。所述的化学诱导启动子包括=Bacillus megaterium(巨大芽孢杆菌)的果聚蔗糖 _ (Ievansucrase)―因的启云力〒(Pbm-sacB) > Bacillus megaterium(巨^di包木干胃)的 木糖异构酶基因的启动子(Pbm-xylA)、Bacillus subtilis (枯草芽孢杆菌)的果聚蔗糖 酶(Ievansucrase)基因的启动子(Pbs-sacB)、Bacillus subtilis (枯草芽孢杆菌)的木 糖异构酶基因的启动子(Pbs-xylA)、Eschelichia coli (大肠杆菌)的阿拉伯糖利用操纵 子的启动子(Para)、Eschelichia coli (大肠杆菌)的乳糖利用操纵子的启动子(Plac)、 Eschelichiacoli (大肠杆菌)、优选Bacillus megaterium(巨大芽孢杆菌)的果聚蔴糖 酶(Ievansucrase)基因的启动子(Pbm-sacB)、Bacillus subtilis (枯草芽孢杆菌)的 果聚蔴糖酶(Ievansucrase)基因的启动子(Pbs-sacB)与Bacillus megaterium(巨大芽 孢杆菌)的木糖异构酶基因的启动子(Pbm-xylA)。最优选巨大芽孢杆菌的的果聚蔗糖酶 (Ievansucrase)基因的启动子(Pbm-sacB)。所述的化学诱导启动子的转录通过以下方式实现所述的果聚蔗糖酶(Ievansucrase)基因的启动子只有加入蔗糖后才可能起始其 下游基因的转录，蔗糖的质量百分比浓度为0.5%到10%，优选2%到6% (质量体积百分 比)。所述的的木糖异构酶基因的启动子只有加入木糖后才可能起始其下游基因的转 录，木糖的质量百分比浓度为0. 5%到8%，优选2% -6% (质量体积百分比)。所述的阿拉伯糖利用操纵子的启动子只有加入阿拉伯糖后才可能起始其下游基 因的转录，阿拉伯糖的质量百分比浓度为0. 5%到8%，优选2% -6% (质量体积百分比)。所述的乳糖利用操纵子的启动子只有加入乳糖后才可能起始其下游基因的转录， 乳糖的质量百分比浓度为0. 5%到8%，优选2% -6% (质量体积百分比)。所述的物理诱导的启动子包括来源于Bacillus subtilis (枯草芽孢杆菌)的groESL基因的热诱导启动子、来源于Bacillus subtilis (枯草芽孢杆菌)的dnaK基因的 热诱导启动子、来源于Bacillus Iicheniformis (地衣芽孢杆菌)的groE基因的热诱导启 动子。第四步、采用电转化的方法、制备原生质体的方法或制备感受态细胞的方法将基 因表达盒转化革兰氏阳性微生物宿主菌，用选择标记筛选，得到能分泌透明质酸的革兰氏 阳性基因工程安全宿主菌；所述的选择标记是指用来有效筛选含有透明质酸合成相关基因的核酸构建体的 宿主细胞的基因，比如红霉素抗性基因，氯霉素抗性基因、D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因，核 糖醇脱氢酶基因，壮观霉素抗性基因。第五步、对革兰氏阳性基因工程安全宿主菌进行发酵培养，在培养阶段加入诱导 透明质酸合成的诱导剂以提高透明质酸的合成水平，发酵结束后即从培养基中分离纯化得 到基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸。所述的诱导透明质酸合成的诱导剂是指蔗糖、木糖、阿拉伯糖或乳糖。所述的发酵培养是指配取葡萄糖5-20克/升、酵母浸粉0. 5-5克/升、七水硫 酸镁0. 3-3克/升、磷酸二氢钾3-8克/升、磷酸氢二钠2-8克/升、硫酸铵2-8克/升、柠 檬酸钠2-5克/升、七水硫酸亚铁1-20毫克/升、一水硫酸锰1-20毫克/升、无水硫酸铜 0. 2-10毫克/升、氯化锌0. 2-10毫克/升，用柠檬酸或氢氧化钠调节酸碱度至6. 5-7. 5。发 酵温度为28-37度，优选30-37度，最优选为33-35度，搅拌转速为300-600转/分钟。所述的透明质酸是由D-葡萄糖醛酸(GlcUA)与N-乙酰基葡萄糖氨(GlcNAc)以 双糖单元交替连接而成的直链大分子酸性粘多糖，其分子量为五万到五百万道尔顿。为了增强透明质酸在革兰氏阳性宿主菌细胞的合成能力，本发明通过将与透明质 酸合成相关的基因(SEQ ID NO. 1到27 ；SEQ ID No. 31到43)进行组合，构成不同的基因表 达盒，然后转化到宿主细胞的染色体中。所述的基因表达盒除了含有SEQ ID No. 31到43中 的一种或一种以上的基因外，含必须含有密码子优化的透明质酸合成酶基因，在组成型启 动子或者诱导性启动子的控制下进行转录并表达翻译成有活性的酶蛋白，这些酶蛋白能增 强革兰氏阳性宿主细胞合成透明质酸前体以及合成透明质酸的能力。比如可以将UDP-葡 萄糖脱氢酶基因(UDP-glucose dehydrogenase gene)、UTP-葡萄糖磷酸转移酶基因 (UTP-glucose-l-phosphate Uridyltransferase gene)以及透明质酸合成酶基因三种基 因组合在一起，基因加入核糖体结合位点，用组成型或者诱导性启动子控制这三种基因的 表达。还可以将UDP-葡萄糖脱氢酶基因(UDP-glucose dehydrogenase gene)、UTP-葡 萄糖-1-磷酸转移酶基因(UTP-glucose-l-phosphate uridyltransferase gene)、葡萄 糖-6-磷酸变位酶基因(Phosphoglucomutase gene)、N-乙酰基磷酸-葡糖氨-尿嘧 P 基转移BS基因(N-Acetyl-glucosamine-l-phosphate uridyltransferase gene)以及透 明质酸合成酶基因五种基因组合在一起，基因加入加入核糖体结合位点，用组成型或者诱 导性启动子启动这五种基因的转录，构成一个人工操纵子。还可以将上述与透明质酸合成 的所有的相关的基因组合在一起，构成一个基因簇(gene cluster) 0在优选方案中，本发明将UDP-葡萄糖脱氢酶基因(UDP-glucose dehydrogenase gene)，即 SEQ ID No. 31-34,UTP-葡萄糖-1-磷酸转移酶基因(UTP-glucose-1-phosphate Uridyltransferase gene)，即 SEQ ID No. 35-37、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移 BS 基因(N-Acetyl-glucosamine-l-phosphate uridyl transferase gene),即 SEQ ID No. 43，以及优化的透明质酸合成酶基因(SEQ ID No. 1-27中的任一种)组合构成一个基因 表达盒，采用蔗糖诱导性的果聚蔗糖酶基因的启动子来启动这四种基因的转录。上述所采用的透明质酸合成酶基因均按照革兰氏阳性宿主菌的密码子偏好性进 行优化。为了进一步增强可诱导启动子的转录活性，本发明还通过在可诱导启动子上游或 下游引入增强子(enhancer)。增强子的存在能够进一步增强可诱导启动子的转录活性。所 述增强子，在本发明中指任何能够增强与之相连的启动子转录活性的核酸序列。为了更有效地得到产透明质酸的革兰氏阳性基因工程菌，在构建含与合成透明 质酸前体以及透明质酸合成酶基因的表达载体时，在表达载体中可以引入以下选择标 记D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因(D-arabitol dehydrogenase gene)、核糖醇脱氢酶基因 (ribitol dehydrogenasegene)、红霄素抗j"生基因(erythromycin resistance gene, erm) 、 氯霉素抗性基因(cat)、卡那霉素抗性基因(km)。由于D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因是安全的 选择标记，本发明优选使用该基因作为选择标记。但并不说明本发明不使用其它选择标记。 可以使用任何来源的D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因，该基因编码产物D-阿拉伯糖醇脱氢酶可 以在NAD(H)的存在下将D-阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖或者D-核酮糖。还可以使用任何 来源的核糖醇脱氢酶基因，该基因编码产物核糖醇脱氢酶可以在NAD(H)存在下将核糖醇 转变为D-核酮糖。本发明所述的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、有 益或无毒蜡样芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜淀粉拟杆菌、嗜 热脂肪地芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、嗜淀粉拟杆菌、短小芽孢杆菌的获取来 源为中国普通微生物保藏管理中心，所述的兽疫链球菌、类马疫链球菌、化脓链球菌以及乳 房链球菌的保藏信息、获取来源为德国DSMZ保存中心。为了得到较稳定的能合成透明质酸的基因工程革兰氏阳性宿主菌，本发明将合成 透明质酸的相关酶的基因连接到整合型表达质粒载体或者附加型表达质粒载体中。采用基因工程安全微生物宿主发酵制备的透明质酸由于其生物安全性非常好，不 存在任何内毒素与任何治病因子，因此即可以应用于食品领域、化妆品领域以及药品领域。 在食品领域可以制成口服液、胶囊等；在化妆品领域可以制成各种保水护肤品(润肤膏、润 肤露等)；在药品领域可以制成关节润滑注射液，促进伤口愈合的胶布；还可以用来进行修 饰衍生化制成透明质酸衍生物。


图1为含来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸 合成酶基因、木糖诱导的启动子的芽孢杆菌整合表达载体；图中lacA，与，IacA分别表示beta-galactosidase基因的5，与3，端同源整合臂；erm 表示红霉素抗性基因；szhas表示来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合 成酶基因；
PxylA表示来自巨大芽孢杆菌的木糖诱导启动子；bla表示氨苄青霉素抗性基因；ori表示在大肠杆菌中复制起始DNA序列。图2为含来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸 合成酶基因、蔗糖诱导的启动子的芽孢杆菌整合表达载体；图中PsacB表示来自枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的诱导启动子。图3为含来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸 合成酶基因、乳糖诱导的启动子的芽孢杆菌附加型表达载体；图中szhasA 来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合成 酶基因；Amp 氨苄青霉素抗性基因；ori-Bs 芽孢杆菌的质粒的自主复制起始点序列；ori-Ec 大肠杆菌的质粒的自主复制起始点序列；cat:氯霉素抗性基因。图4为含来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸 合成酶基因、枯草芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子的附加型芽孢杆菌表达载体；图中PsacB 来自枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的启动子序列；图中其余符号同图3 所示。图5为含来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸 合成酶基因、巨大芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子的整合型芽孢杆菌表达载体；图中IacA，与，IacA分别表示beta-galactosidase基因的5，与3，端同源整合臂；erm表示红霉素抗性基因；has表示来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合成 酶基因；PbmsacB表示来自巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的诱导启动子；bla表示氨苄青霉素抗性基因；ori表示在大肠杆菌中复制起始DNA序列。图6为含来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸合成酶 基因、巨大芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子的整合型芽孢杆菌表达载体；图中cvhas表示来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合成酶基因。图7为含来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸合成酶 基因、枯草芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子的整合型芽孢杆菌表达载体；图中
rep 可以在芽孢杆菌中自主复制的复制起始点片段；0RF2 未知功能的开放阅读框架；bla 氨苄抗性基因；cat 氯霉素抗性基因；cvhas 来自PBCV的透明质酸合成酶基因，按照枯草芽孢杆菌密码子优化；PsacB 来自枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的启动子；0RF3 未知功能的开放阅读框架。图8为含来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸合成酶 基因、巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因、巨大芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子的整合 型芽孢杆菌表达载体；图中cvhas表示来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合成酶 基因；PbmsacB表示来自巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的诱导启动子；Pamy表示来自枯草芽孢杆菌的α -淀粉酶基因启动子；tuaD表示来自巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因。图9为含来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸合成酶 基因、巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因、巨大芽孢杆菌的N-乙酰基-1-磷酸-葡 糖氨-尿嘧啶基转移酶基因、巨大芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子的整合型芽孢杆菌表达载 体；图中gcaD表示来自巨大芽孢杆菌的N-乙酰基磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基 因。图10为含来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸合成酶 基因、巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因、巨大芽孢杆菌的N-乙酰基-1-磷酸-葡糖 氨-尿嘧啶基转移酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基转移酶基因、巨大芽孢杆菌的蔗 糖诱导的启动子的整合型芽孢杆菌表达载体；图中gtaB表示UTP-葡萄糖磷酸尿嘧啶基转移酶基因；图中其余符号同图9所示。图11为含来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸合成酶 基因、巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因、巨大芽孢杆菌的N-乙酰基-1-磷酸-葡糖 氨-尿嘧啶基转移酶基因、枯草芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子及其调控元件的整合型芽孢 杆菌表达载体；图中P43表示枯草芽孢杆菌的P43基因启动子；cvhas表示来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合成酶 基因；degQ与degU表示来自枯草芽孢杆菌的调控蛋白基因；PbssacB表示来自枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的诱导启动子；Pamy表示来自枯草芽孢杆菌的α -淀粉酶基因启动子；
tuaD表示来自巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因；gtaB表示来自巨大芽孢杆菌UTP-葡萄糖磷酸尿嘧啶基转移酶基因；gcaD表示来自巨大芽孢杆菌的N-乙酰基磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基 因。图12为含来自化脓链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸 合成酶基因、巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因、巨大芽孢杆菌的N-乙酰基-1-磷 酸_葡糖氨_尿嘧啶基转移酶基因、枯草芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子及其调控元件的整 合型芽孢杆菌表达载体；图中pyhas表示来自化脓链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合 成酶基因。图13为含来自乳房链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸 合成酶基因、巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因、巨大芽孢杆菌的N-乙酰基-1-磷 酸_葡糖氨_尿嘧啶基转移酶基因、枯草芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子及其调控元件的整 合型芽孢杆菌表达载体；图中puhas表示来自化脓链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合 成酶基因。图14为含来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸 合成酶基因、地衣芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基转移 酶基因、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因、枯草芽孢杆菌的蔗糖诱导的 启动子及其调控元件的整合型芽孢杆菌表达载体；图中szhas表示来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合 成酶基因；degQ与degU表示来自枯草芽孢杆菌的调控蛋白基因；PbssacB表示来自枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的诱导启动子；tuaD表示来自地衣芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因；gtaB表示来自地衣芽孢杆菌UTP-葡萄糖磷酸尿嘧啶基转移酶基因；gcaD表示来自地衣芽孢杆菌的N-乙酰基磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基 因。图15为含来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸合成酶 基因、巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因、枯草芽孢杆菌的alpha-淀粉酶基因启动 子、弱氧化醋酸杆菌的D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因以及枯草芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子 的整合型芽孢杆菌表达载体；IacA，与，IacA分别表示beta-galactosidase基因的5，与3，端同源整合臂；aArDH ；表示来自弱氧化醋酸杆菌的D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因；cvhas表示来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合成酶 基因；PbmsacB表示来自巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的诱导启动子；
bla表示氨苄青霉素抗性基因；ori表示在大肠杆菌中复制起始DNA序列；Pamy表示来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子；tuaD表示来自巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因。图16为含来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的的透明质酸 合成酶基因、地衣芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基转移 酶基因、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因、克莱伯肺炎球菌的D-阿拉伯 糖醇脱氢酶基因以及枯草芽孢杆菌的蔗糖诱导的启动子及其调控元件的整合型芽孢杆菌 表达载体；图中IacA，与，IacA分别表示beta-galactosidase基因的5，与3，端同源整合臂；DalD表示来自克莱伯肺炎球菌的D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因；P43表示枯草芽孢杆 菌的P43基因启动子；szhas表示来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的透明质酸合 成酶基因；degQ与degU表示来自枯草芽孢杆菌的调控蛋白基因；PbssacB表示来自枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的诱导启动子；bla表示氨苄青霉素抗性基因；ori表示在大肠杆菌中复制起始DNA序列；Pamy表示来自巨大芽孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子；tuaD表示来自地衣芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因；gtaB表示来自地衣芽孢杆菌UTP-葡萄糖磷酸尿嘧啶基转移酶基因；gcaD表示来自地衣芽孢杆菌的N-乙酰基磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基 因。图17为实施例3步骤(I)PCR验证结果示意图。图18为实施例3步骤(2) PCR验证结果示意图。图19为实施例3步骤(7) PCR验证结果示意图。图20为实施例7示意图。图21为实施例8示意图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例1 与合成透明质酸前体相关的基因以及启动子序列的克隆或者合成(1)兽疫链球菌透明质酸合成酶基因的克隆采用文献描述的提取细菌总DNA的方法(Cheng H and Jiang N, 2006, 28 =55-59, Biotechnol. Letters)来提取兽疫链球菌总DNA。设计一对引物，以提取的兽疫链球菌总 DNA为模板进行PCR反应，具体反应条件为94度预变性5分钟，再按照94度30秒、56度40 秒、72度60秒共30个循环，最后延伸10分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下5，-CTTCTAGAATGAGAACATTAAAAAACCTCATA-3，(5，端带有 XbaI 酶切位点，TCTAGA)
5，-ATCCGCGGTTATAATAATTTTTTACGTGTTCC-3，(5，端带有 SacII 酶切位点，CCGCGG)按照上面的方法扩增出的兽疫链球菌的透明质酸合成酶基因大小为1254bp，即 SEQ IDNo. 44。(2)化脓链球菌透明质酸合成酶基因的克隆采用文献描述的提取细菌总DNA的方法(Cheng H and Jiang N，2006，28 =55-59, Biotechnol. Letters)来提取化脓链球菌总DNA。设计一对引物，以提取的化脓链球菌总 DNA为模板进行PCR反应，具体反应条件为94度预变性5分钟，再按照94度30秒、55度40 秒、72度70秒共32个循环，最后延伸10分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下5，-CTTCTAGAATGCTTATTTTTAAAAAAACTTTTA-3，(5，端带有 XbaI 酶切位点，TCTAGA)5，-ATCCGCGGTTATTTAAAAATAGTGACCTTTTTAC-3，(5，端带有 SacII 酶切位点， CCGCGG)按照上面的方法扩增出的化脓链球菌的透明质酸合成酶基因大小为1260bp，即 SEQ IDNo. 47。(3)乳房链球菌透明质酸合成酶基因的克隆采用文献描述的提取细菌总DNA的方法(Cheng H and Jiang N, 2006, 28 =55-59, Biotechnol. Letters)来提取乳房链球菌总DNA。设计一对引物，以提取的乳房链球菌总 DNA为模板进行PCR反应，具体反应条件为94度预变性5分钟，再按照94度30秒、55度40 秒、72度70秒共32个循环，最后延伸10分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下5，-CTTCTAGAATGGAAAAACTAAAAAATCTCATTAC-3，(5，端带有 XbaI 酶切位点， TCTAGA)5，-ATCCGCGGTTATTTACTTGTCTTTTTACGAGTTCC-3，(5，端带有 SacII 酶切位点， CCGCGG)按照上面的方法扩增出的乳房链球菌的透明质酸合成酶基因大小为1254bp，即 SEQ IDNo. 48。(4)绿草履虫小球藻病毒透明质酸合成酶基因的优化与合成按照GenBank公开报道的绿草履虫小球藻属病毒(Paramecium bursaria Chlorella virusl, PBCV1)的基因序列(SEQ ID No. 46)，该基因编码框大小为1707碱基 (从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束)。按照本发明采用的革兰氏阳性宿主 菌基因组的密码子偏好性进行优化，优化的方法是采用在线分子生物学软件OptimumGene Codon Optimization Analysis、Gene Designer、Codon Optimizer 或Optimizer，分析后对 不同软件给出的结果进行人工手动修正，使CAI数值达到0.80以上。然后委托专门的基因 合成部门进行全基因合成，得到密码子优化的绿草履虫小球藻病毒透明质酸合成酶基因。 优化后的绿草履虫小球藻病毒透明质酸合成酶基因的序列为SEQ ID No. 15-21。(5)巨大芽孢杆菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因与UTP-葡萄糖磷酸转移酶基因 的克隆。采用文献描述的提取细菌总DNA的方法(Cheng H and Jiang N, 2006, 28 =55-59, Biotechnol. Letters)来提取巨大芽孢杆菌总DNA。设计一对引物，以提取的总DNA为模板 进行PCR反应，具体反应条件为94度预变性5分钟，再按照94度30秒、58度40秒、72度 100秒共35个循环，最后延伸10分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下
5，-ATGGATCCGGTACCAGGAGGAAAAGTAAATGAAAATTC-3，(5，端带有 BamHI 位点 GGATCC 与 KpnI 位点 GGTACC)5，-ATCTCGAGTTATAAAGTAGAAACTTTAGAATCACC-3，(5，端带有 XhoI 酶切位点 CTCGAG)扩增出的含UDP-葡萄糖脱氢酶基因与UTP-葡萄糖-1-磷酸转移酶基因两种基因 的DNA的大小为2. 4kb。其DNA序列为SEQ ID No :28。(6)巨大芽孢杆菌N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因的克隆。采用文献描述的提取细菌总DNA的方法(Cheng H and Jiang N, 2006, 28 =55-59, Biotechnol. Letters)来提取巨大芽孢杆菌总DNA。设计一对引物，以提取的总DNA为模板 进行PCR反应，具体反应条件为94度预变性5分钟，再按照94度30秒、58度40秒、72度 100秒共35个循环，最后延伸10分钟的程序进行。设计的一对引物序列如下5，-ATCTCGAGTAGGAGGCCTGTTATGTCAAAAAGATATGCAGTC-3，(5，端带有 XhoI 酶切位 点CTCGAG以及核糖体结合位点AGGAGG)5，-ATGAGCTCTTAGGATTTTTTATTAATATCAAGC-3，(5，端带有 SacI 酶切位点 GAGCTC)扩增出的N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因大小为1380bp。其 DNA 序列为 SEQ ID No :29。(7)巨大芽孢杆菌alpha-淀粉酶基因启动子序列的克隆。以巨大芽孢杆菌总DNA为模板，设计一对引物进行PCR扩增，PCR反应条件为94 度预变性5分钟，再按照94度30秒、58度40秒、72度30秒共35个循环，最后延伸10分 钟。得到大小约为390bp的alpha-淀粉酶基因启动子序列。设计的引物序列为5，-CTTCTAGACATCGTTTCATCCCCTTTTTTTTGCAA-3，(5，端带有 XbaI 酶切位点 TCTAGA)5，-CTGGATCCTTGCAGATAGTAAATAAAATTCAA-3，(5，端带有 BamHI 酶切位点 GGATCC)得到的巨大芽孢杆菌alpha-淀粉酶基因启动子序列为SEQ ID No :30。(8)枯草芽孢杆菌果聚蔗糖酶基因启动子序列的克隆。设计以下一对引物5’ -AAGCGAAAACATACCACCTATCAGATCCTTTTTAACCCATCACATATACCTG-3’5，-CTTCTAGACATATAAAACACCTCCTTTTTTATGTACTGTGTTAGCGG-3，(5，端带有 XbaI 酶 切位点TCTAGA)以上述一对引物，以枯草芽孢杆菌总DNA为模板进行PCR，得到约450bp的果聚蔗 糖酶基因启动子DNA片段。PCR反应的条件为94度预变性5分钟，再按照94度30秒、56 度30秒、72度30秒共35个循环，最后延伸10分钟。(9)巨大芽孢杆菌果聚蔗糖酶基因启动子序列的克隆。设计以下一对引物5’ -AAGCGAAAACATACCACCTATCACTGATTCCAGCCGTGAAGGAAAAG-3’5，-CTTCTAGA ATGTTTTCTCCTTTTGTGTTAGTAAAG-3，(5，端带有 XbaI 酶切位点 TCTAGA)以上述一对引物，以枯草芽孢杆菌总DNA为模板进行PCR，得到约630bp的果聚蔗 糖酶基因启动子DNA片段。PCR反应的条件为94度预变性5分钟，再按照94度30秒、56度30秒、72度30秒共35个循环，最后延伸10分钟。(10)枯草芽孢杆菌P43基因启动子的克隆。设计以下一对引物5’ -CAATTGTTTTACTTCTTCAAGTTTCTTTTCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATG-3’5’ -CAGGTATATGTGATGGGTTAAAAAGGATCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTT-3’以上述一对引物，以枯草芽孢杆菌总DNA为模板进行PCR，得到约300bp的果聚蔗 糖酶基因启动子DNA片段。PCR反应的条件为94度预变性5分钟，再按照94度30秒、56 度30秒、72度30秒共35个循环，最后延伸10分钟。(11)枯草芽孢杆菌degQ序列的克隆。设计以下一对引物5，ATGGATCC lAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGC[ TCACGCAATTTTCATTGCATAATTGTATTTAT CG 3'其中5’端下划线表示BamHI识别序列(GGATCC)，带框碱基表示大肠杆菌trpA终 止子的互补链序列(AAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGC)。5， CATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGGAAAAGAAACTTGAAG AAGTAAAACAATTG-3’以上述一对引物，以枯草芽孢杆菌总DNA为模板进行PCR，得到约200bp的degQ的 DNA片段。PCR反应的条件为94度预变性5分钟，再按照94度30秒、56度30秒、72度20 秒共35个循环，最后延伸10分钟。实施例2 含合成透明质酸相关的基因以及启动子序列的表达载体的构建(1)含有来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的的透明质酸合成酶基 因的整合表达载体的构建。来自兽疫链球菌的透明质酸合成酶基因按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优 化后，用BamHI与SacII双酶切后，将双酶切的透明质酸合成酶基因胶回收，连接到用BamHI 与SacII双酶切的整合型表达质粒载体pAXOl中，构成含有按照枯草芽孢杆菌密码子偏好 性优化的兽疫链球菌透明质酸合成酶基因的新的整合型表达载体pAX-szhasl。载体图谱如

1。(2)含有来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的的透明质酸合成酶基 因以及枯草芽孢杆菌果聚蔗糖酶基因启动子的整合表达载体的构建。来自兽疫链球菌的透明质酸合成酶基因按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优 化后，用BamHI与SacII双酶切后，将双酶切的透明质酸合成酶基因胶回收，连接到用BamHI 与SacII双酶切的整合型表达质粒载体pAXOl中，构成含有按照枯草芽孢杆菌密码子偏好 性优化的兽疫链球菌透明质酸合成酶基因的新的整合型表达载体pAX-szhasl (图谱如图 1)，然后用SpeI与XhoI双酶切pAX-szhasl，胶回收得到载体片段DNA。将来自枯草芽孢杆 菌果聚蔗糖酶基因启动子用SpeI与XhoI双酶切，与SpeI与XhoI双酶切的载体pAX-szhasl 连接，得到新的整合表达载体pAX-SZhaS2，该载体含有优化的透明质酸合成酶基因以及可 诱导的蔗糖酶基因的启动子。载体pAX-SZhaS2的图谱如图2。(3)含有来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的的透明质酸合成酶基 因以及枯草芽孢杆菌果聚蔗糖酶基因启动子的附加型表达载体的构建。来自兽疫链球菌的透明质酸合成酶基因按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优
15化后，用KpnI与SacI双酶切后，将双酶切的透明质酸合成酶基因胶回收，连接到用KpnI与 SacI双酶切的整合型表达质粒载体PNW33N中，构成含有按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性 优化的兽疫链球菌透明质酸合成酶基因的新的附加型表达载体pNW-szhasl (图谱如图3)， 再用BamHI与KpnI双酶切此载体，同时用BamHI与KpnI双酶切来自枯草芽孢杆菌果聚蔗 糖酶基因启动子，二者进行连接，构成含有枯草芽孢杆菌果聚蔗糖酶基因启动子以及按照 枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的兽疫链球菌透明质酸合成酶基因的新的附加型表达载 体pNW-szhas2 (图谱如图4)。(4)含有来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的的透明质酸合成酶基 因以及巨大芽孢杆菌果聚蔗糖酶基因启动子的整合型表达载体的构建。将来自兽疫链球菌的透明质酸合成酶基因按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行 优化后，用SpeI与BamHI双酶切后，将双酶切的透明质酸合成酶基因胶回收，连接到用SpeI 与BamHI双酶切的整合型表达质粒载体pAXOl中，构成载体pAX-hasl，再用BamHI与SacII 双酶切pAX-hasl，与用BamHI与SacII双酶切的巨大芽孢杆菌果聚蔗糖酶基因启动子DNA 进行连接构成整合型表达载体pAX-has2(图谱如图5)。该整合型表达载体含有巨大芽孢杆 菌果聚蔗糖酶基因启动子以及来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的的透明 质酸合成酶基因。(5)含有来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因的整 合型表达载体的构建。将来自PBCV的透明质酸合成酶基因按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优化 后，用SpeI与SacII双酶切后，将双酶切的透明质酸合成酶基因胶回收，连接到用SpeI与 SacII双酶切的整合型表达质粒载体pAXOl中，构成含有按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性 优化的兽疫链球菌透明质酸合成酶基因的新的整合型表达载体pAX-cvhasl，然后用SpeI 与XhoI双酶切pAX-cvhasl，胶回收得到载体片段DNA。将来自巨大芽孢杆菌果聚蔗糖酶基 因启动子用SpeI与XhoI双酶切，与SpeI与XhoI双酶切的载体pAX-cvhasl连接，得到新 的整合表达载体pAX-cvhas2，该载体含有优化的来自PBCV的透明质酸合成酶基因以及巨 大芽孢杆菌的可诱导蔗糖酶基因的启动子。载体pAX-CVhaS2的图谱如图6。(6)含有来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因以及 枯草芽孢杆菌果聚蔗糖酶基因启动子的附加型表达载体的构建。将来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因用SpeI与 SacI双酶切，胶回收酶切1.7kb的DNA片段。用SpeI与SacI双酶切载体pHCMC04，二者 进行连接得到新的含透明质酸合成酶基因的载体，再用BamHI与SpeI双酶切此载体，与用 BamHI与SpeI双酶切的枯草芽孢杆菌果聚蔗糖酶基因启动子进行连接，构成新的附加型表 达质粒载体pHC-cvhas2 (图谱如图7)。(7)含有来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因以及 来自巨大芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因以及巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因启动 子的整合型表达载体的构建。将构建的pAX-CVhaS2表达载体(如图6)用XhoI与SacI双酶切得到大片段线性 载体片段，胶回收。将来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子序列定向克隆到克隆质 粒载体 pBlueScriptSK(-)的 XhoI 与 BamHI 位点，构成载体 pBS_Amy，再用 BamHI 与 SacI双酶切此载体，将来自巨大芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因定向克隆到用BamHI与 SacI双酶切此载体中，构成新的载体pBS-AG。再用XhoI与SacI双酶切pBS_AG，回收大小 为1. 9kb的DNA片段，与XhoI与SacI双酶切的pAX-CVhaS2表达载体连接，构成新的芽孢 杆菌整合型表达载体PAX-AGH2。该载体中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因是利用α-淀粉酶 基因启动子控制进行组成型转录，而透明质酸合成酶基因则在可诱导启动子PsacB控制下 转录。可以实现透明质酸的诱导合成。该载体的图谱如图8。(8)含有来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因以 及来自巨大芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因以及巨大芽孢杆菌的N-乙酰基-1-磷 酸_葡糖氨_尿嘧啶基转移酶基因以及巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因启动子的整合型表 达载体的构建。将来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子序列定向克隆到克隆载体 pBlueScriptSK(-)的 XhoI 与 HindIII 位点，构成载体 pBS_Amy2，再用 HindIII 与 BamHI 双酶切此载体，把来自巨大芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因定向克隆到此用HindIII 与BamHI双酶切此载体中，构成新载体pBS_AU2，再用BamHI与SacI双酶切pBS_AU2，把巨 大芽孢杆菌的N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因定向克隆到此载体中， 再用XhoI与SacI双酶切此载体，回收3. 3kb的DNA片段，连接到用XhoI与SacI双酶切 的pAX-CVhaS2载体中，构成新的芽孢杆菌整合表达载体pAX-CVhaS3。此载体的透明质酸 合成酶基因用果聚蔗糖酶基因的启动子诱导转录，而6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因与N-乙酰 基-ι-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基转移酶基因用组成型启动子控制转录，因此透明质酸的合 成受蔗糖的诱导。载体pAX-cvhas3的图谱如图9。(9)含有来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因、6-磷 酸葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基转移酶基因、N-乙酰基-1-磷酸-葡 糖氨-尿嘧啶基转移酶基因以及巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因启动子的整合型表达载 体的构建。将来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子序列定向克隆到克隆载体 pBlueScriptSK(-)的 XhoI 与 HindIII 位点，构成载体 pBS_Amy2，用 HindIII 与 BamHI 双酶切该载体，将枯草芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因定向克隆到此载体中，构成 PBS-AU3，用BamHI与SpeI双酶切pBS_AU3，将UTP-葡萄糖-1-磷酸转移酶基因定向克隆到 此载体中，构成PBS-AUTl载体，再用SpeI与SacI双酶切此载体，将N-乙酰基-1-磷酸-葡 糖氨_尿嘧啶基转移酶基因定向克隆到此载体中，构成pBS-AUTG载体，再用XhoI与SacI 双酶切此载体，回收4. 3kb的DNA片段，与用XhoI与SacI双酶切的pAX-CVhaS2载体连接， 构成新的整合型表达载体pAX-CVhaS4。该载体的透明质酸合成酶基因在巨大芽孢杆菌的 果聚蔗糖酶基因启动子控制下转录，进行诱导表达。而6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡 萄糖-1-磷酸转移酶基因、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因则在枯草芽 孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子控制下进行组成型转录。因此透明质酸的合成受蔗糖的诱 导。整合型表达载体pAX-cvhas4的图谱如图10。(10)含有来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因以 及来自巨大芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因以及巨大芽孢杆菌的N-乙酰基-1-磷 酸_葡糖氨_尿嘧啶基转移酶基因以及枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因启动子及其调控序列的整合型表达载体的构建。将载体pAX-CVhaS3中的果聚蔗糖酶基因的启动子用含有增强元件的果聚蔗糖酶 基因启动子代替。将载体pAX-CvhaS3用SpeI与XhoI双酶切，胶回收大片段DNA。将实施例 1克隆的P43基因启动子、degQ基因以及degU基因按照S0E(spicing overlap extension PCR)技术组合在一起(参考 Heckman and Pease, 2007, Vol 2 (4), Nature Protocols)，其 中degQ与degU在p43基因启动子的控制下进行强启动转录。得到P43-degQ-degU的表达 盒，将该表达盒定向克隆到SpeI与XhoI双酶切的pAX-CVhaS3载体中，构成新的芽孢杆菌 表达载体pAX-CVhaS5。此载体的果聚蔗糖酶基因启动子受degQ与degU的增强，因此其下 游的透明质酸合成酶基因转录更强烈。载体pAX-cvhas5的图谱如图11。(11)含有来自化脓链球菌并按照巨大芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶 基因以及来自巨大芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因以及巨大芽孢杆菌的N-乙酰 基-ι-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基转移酶基因以及巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因启动子及 其调控序列的整合型表达载体的构建。将载体pAX-CVhaS5中来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成 酶基因替换成来自化脓链球菌并按照巨大芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因即 可，构成新的整合表达载体pAX-sphasl。图谱如图12。(12)含有来自乳房链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶 基因以及来自巨大芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因以及巨大芽孢杆菌的N-乙酰 基-ι-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基转移酶基因以及巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因启动子及 其调控序列的整合型表达载体的构建。将整合表达载体pAX-sphasl中的来自化脓链球菌并按照巨大芽孢杆菌密码子优 化的透明质酸合成酶基因替换成来自乳房链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明 质酸合成酶基因，构成新的整合表达载体pAX-suhasl。图谱如图13。(13)含有来自兽疫链球菌并按照地衣芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基 因、以及来自地衣芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基转 移酶基因、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因以及枯草芽孢杆菌的果聚蔗 糖酶基因启动子及其调控元件的整合型表达载体的构建。将来自巨大芽孢杆菌的α-淀粉酶基因启动子序列定向克隆到克隆载体 pBlueScriptSK(-)的 XhoI 与 HindIII 位点，构成载体 pBS_Amy3，用 HindIII 与 BamHI 双酶切该载体，将地衣芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因定向克隆到此载体中，构成 PBS-AU4，用BamHI与SpeI双酶切pBS_AU4，将UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基转移酶基因 定向克隆到此载体中，构成PBS-AUT2载体，再用SpeI与SacI双酶切此载体，将N-乙酰 基-1-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基转移酶基因定向克隆到此载体中，构成PBS-AUTG2载体， 再用XhoI与SacI双酶切此载体，回收4. 3kb的DNA片段，与用XhoI与SacI双酶切的 pAX-szhas2载体连接，构成新的整合型表达载体pAX-SZhaS3。再用BamHI与SacII双酶 切pAX-SZhaS3，用按照地衣芽孢杆菌密码子偏好性优化的兽疫链球菌的透明质酸合成酶基 因替换按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化的兽疫链球菌透明质酸合成酶基因，构成新的 载体pAX-SZhaS5。该载体的透明质酸合成酶基因在枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因启动 子控制下转录，进行诱导表达。而6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸转移酶基因、N-乙酰基1-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基转移酶基因则在巨大芽孢杆菌的α -淀粉酶 基因启动子控制下进行组成型转录。因此透明质酸的合成受蔗糖的诱导。整合型表达载体 pAX-szhas5的图谱如图14。(14)含有来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的串联的透明质酸合 成酶基因、以及来自地衣芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸转移 酶基因、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因以及巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖 酶基因启动子的整合型表达载体的构建。将巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因启动子定向克隆到pBlueScript SK(-)的 BamHI与XbaI位点，然后再将来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸 合成酶基因定向克隆到XbaI与NotI位点，再将同一拷贝的来自兽疫链球菌并按照枯草芽 孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因定向克隆到NotI与SacII位点。两份基因添加 有核糖体结合位点序列AGGAGGTG。这样，即有2份同样的透明质酸合成酶基因在同一启动 子的控制下进行转录。用BamHI与SacII切下并回收PsacB-szhas-szhas表达盒，连接到 用BamHI与SacII双酶切pAX_szhas5载体中，替换pAX_szhas5中的PsacB-szhas表达盒， 构成新的载体pAX-szhas6。与pAX-SZhaS5相比，pAX-szhas6增加了一份透明质酸合成酶 基因。(15)含有来自PBCV并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的透明质酸合成酶基因、来 自弱氧化醋酸杆菌的D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因、来自巨大芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢 酶基因以及巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因启动子的整合型表达载体的构建。在表达载体pAX-AGH2的基础上，用来自弱氧化醋酸杆菌的D-阿拉伯糖醇脱氢酶 基因取代红霉素抗性基因。用SnaBI与SacII双酶切pAX_AGH2，将D-阿拉伯糖醇脱氢酶基 因定向克隆到此双酶切的载体中，得到载体PAX-AGH3，其图谱如图15。(16)含有来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码子优化的的透明质酸合成酶 基因、以及来自地衣芽孢杆菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸转移酶基 因、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基转移酶基因以及枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基 因启动子与其调控序列以及D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因的整合型表达载体的构建。在表达载体pAX-SZhaS5的基础上，用来自兽疫链球菌并按照枯草芽孢杆菌密码 子优化的的透明质酸合成酶基因代替pAX-SZhaS5中的按照地衣芽孢杆菌密码子优化的透 明质酸合成酶基因，再用SacII与SnaBI双酶切，将来自克莱伯肺炎球菌的D-阿拉伯糖醇 脱氢酶基因定向克隆到SacII与SnaBI位点。构成新的载体pAX-SZhaS6。此载体转化宿 主细胞后不需采用红霉素抗性筛选标记，而是采用安全的D-阿拉伯糖醇脱氢酶代谢标记。 pAX-szhas6的图谱如图16。实施例3 将实施例2构建的表达载体转化到不同的革兰氏阳性细胞宿主中本项实施例描述几种将实施例2构建的表达载体转化到革兰氏阳性细胞宿主中 从而获得能够合成透明质酸的宿主细胞的方法。在本实施例中列出以枯草芽孢杆菌细胞、 地衣芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、短短芽孢杆菌细胞作为合成透明质酸的宿主，但并 不说明本发明不使用其它未列出的革兰氏阳性宿主细胞。(1)将构建的整合型表达载体载体pAX-CVhaS2转化到枯草芽孢杆菌细胞中。按照以下方法制备枯草芽孢杆菌的感受态将枯草芽孢杆菌在LB平板上划线得
19到单菌落，再将单菌落接种到3毫升液体LB培养基中在37度振荡培养5小时，取出500微 升接种到10毫升SPI液体培养基中，在37度振荡培养5小时到对数生长期。再从此含菌 体的SPI培养基中吸出200微升到2毫升SPII液体培养基中在37度150转/分钟培养90 分钟，再加入20微升lOmmol/L的EGTA，在37度150转/分钟培养10分钟，再分装成200 微升一管，加入1微克的质粒载体pAX-CVhaS2，在37度振荡培养90分钟，将菌液全部涂布 在含有4微克/毫升红霉素的LB平板上，在37度培养48小时，得到65个单菌落。挑取5 株菌提取总DNA，用下面一对引物进行扩增cvhasA基因。得到大小为1. 7kb的DNA条带，与 来自PBCV的透明质酸合成酶基因的实际大小一致，PCR验证结果如图17所示。图17中的泳道1、2、3、5与6为用抗红霉素的单菌落的总DNA做PCR后得到的大 小为1. 7kb的DNA。泳道4为对照菌(不抗红霉素的单菌落)总DNA做PCR后的情况，没有DNA带出 现。M为500bp间隔大小的DNA分子量对照。自下而上依次为500bp，IOOObp, 1500bp, 2000bp (最亮的一条带)，2500bp, 3000bp 等。所用的一对引物为5' -CT TCT AGA ATG GGA AAA AAC ATC ATC ATC ATG G-3'5' -CT CCGCGG TTA TAC AGA CTG GGC GTT CGT TGT AGC-3'扩增条件为94度变性40秒，58度退火40秒，72度延伸90秒，共35个循环。溶液的配制方法为SPI溶液SP盐溶液中加入1 %体积的50%葡萄糖与1 %体积的100倍的CAFE溶 液；其中SP盐溶液成分为0. 2%硫酸铵，1. 4%磷酸氢二钾(带3个结晶水)，0. 6%磷酸二 氢钾，0. 02%七水硫酸镁，0. 柠檬酸钠。100倍的CAFE溶液成分为2%水解酪氨酸，10% 酵母浸粉。SPII溶液SPI溶液中加入1 %体积的50mmol/L的氯化钙溶液与1 %体积的 250mmol/L的氯化镁溶液。(2)将载体pHC-CVhaS2转化到短短芽孢杆菌中。按照公开的文献(周海燕等，浙江大学学报(农业与生命科学版)，34(4) 389-394,2008)描述的方法将附加型质粒pHC-CVhaS2转化到短短芽孢杆菌中。然后涂布在 含有10微克/毫升氯霉素与50微克/毫升氨苄青霉素的营养肉汁琼脂筛选平板上，在37 度培养24-36小时。对长出的抗性菌落提取质粒作为模板，用上述(1)描述的一对引物在 同样条件下进行PCR扩增，得到大小为1. 7kb的特异DNA条带，与来自PBCV的透明质酸合 成酶基因实际大小一致，PCR验证结果如图18所示。图18中的泳道2、3、4、5与6为用抗氯霉素与氨苄青霉素的单菌落的总DNA做PCR 后得到的大小为1. 7kb的DNA0泳道1为对照菌(不抗氯霉素与氨苄青霉素的单菌落)总DNA做PCR后的情况， 没有DNA带出现。M为500bp间隔大小的DNA分子量对照。自下而上依次为500bp，1000bp, 1500bp, 2000bp (最亮的一条带)，2500bp, 3000bp 等。
表明载体pHC-CVhaS2转化到短短芽孢杆菌中。(3)将载体pAX-CVhaS5转化到地衣芽孢杆菌细胞中。按照公开的文献(莫静燕等，生物技术，19 (5) ；75-77，2009)描述的方法将整合型 质粒载体pAX-CVhaS5转化到地衣芽孢杆菌细胞中。然后涂布在含有4微克/毫升红霉素 与50微克/毫升氨苄青霉素的LB筛选平板上，在37度培养24-36小时。对长出的抗性菌 落提取总DNA作为模板，用上述⑴描述的一对引物在同样条件下进行PCR扩增，得到大小 为1. 7kb的特异DNA条带，与来自PBCV的透明质酸合成酶基因实际大小一致。表明载体 pAX-cvhas5转化到地衣芽孢杆菌细胞中。(4)将附加型表达载体pNW_szhas2转化到凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) 中。按照公开的文献(Moro A et al, Biotechnology Techniques, 1995，Vol9 (8)， PP. 589-590)描述的方法培养凝结芽孢杆菌，然后在含有菌的培养基中加入质粒 pNW-SZhaS2，在1500V电压、25 μ F电容以及200欧姆电阻的条件下进行电穿孔转化(所用 仪器为Bio-Rad Gene Pulser)。吸出菌液加入丰富培养基混勻，涂布在含有15 μ g/ml氯霉 素的丰富培养基中在37°C培养2天。将长得的菌落提取质粒，再转化到大肠杆菌DH5 α中， 在含有50μ g/ml的丰富培养基中培养提取质粒，用下面的一对引物为进行PCR，得到1. 2kb 的 DNA。5’ -CTTTCTAGAATGCGTACACTGAAAAATCTTATTACGG-3’5’ -ATCCGCGG TTACAATAATTTTTTGCGCGTTCCCC-3’表明载体pNW-SZhaS2转化到凝结芽孢杆菌基因组中。(5)将附加型表达载体pNW-szhasl转化到纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)中。按照公开的文献(Moro A et al, Biotechnology Techniques, 1995，Vol9 (8)， PP. 589-590)描述的方法培养纳豆芽孢杆菌，然后在含有菌的培养基中加入质粒 pNW-szhasl，在1200V电压、25 μ F电容以及200欧姆电阻的条件下进行电穿孔转化(所用 仪器为Bio-Rad Gene Pulser)。吸出菌液加入丰富培养基混勻，涂布在含有15 μ g/ml氯霉 素的丰富培养基中在37°C培养2天。将长得的菌落提取质粒，再转化到大肠杆菌DH5 α中， 在含有50μ g/ml的丰富培养基中培养提取质粒，用下面的一对引物为进行PCR，得到1. 2kb 的 DNA。5’ -CTTTCTAGAATGCGTACACTGAAAAATCTTATTACGG-3’5’ -ATCCGCGG TTACAATAATTTTTTGCGCGTTCCCC-3’结果证明表达载体pNW-szhasl转化到纳豆芽孢杆菌基因组中。(6)将整合型表达载体pAX-szhase转化嗜热脂肪芽孢杆菌。按照公开的文献(Moro A et al, Biotechnology Techniques, 1995，Vol9 (8)， PP. 589-590)描述的方法培养嗜热脂肪芽孢杆菌，然后在含有菌的培养基中加入质粒 pAX-SZhaS6，在1500V电压、25 μ F电容以及200欧姆电阻的条件下进行电穿孔转化(所用 仪器为Bio-Rad GenePulser)。吸出菌液加入丰富培养基混勻，涂布在含有4 μ g/ml红霉 素的丰富培养基中在37°C培养2天。将长得的菌落提取总DNA，用下面的一对引物为进行 PCR，得至Ij 1. 2kb 的 DNA05’ -CTTTCTAGAATGCGTACACTGAAAAATCTTATTACGG-3’
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5’ -ATCCGCGG TTACAATAATTTTTTGCGCGTTCCCC-3’结果证明表达载体pAX-szhase已经转化到嗜热脂肪芽孢杆菌基因组中。(7)将载体pAX-SZhaS5转化到巨大芽孢杆菌中。按照公开的文献(张新建等，云南植物研究，29 (6) =666-670, 2007)描述的方法将 整合型质粒载体pAX-SZhaS5转化到巨大芽孢杆菌细胞中。然后涂布在含有4微克/毫升红 霉素与50微克/毫升氨苄青霉素的LB筛选平板上，在37度培养24-36小时。对长出的抗 性菌落提取总DNA作为模板，用以下一对引物进行PCR扩增，得到大小为1.2kb的特异DNA 条带，与来自兽疫链球菌的透明质酸合成酶基因实际大小一致，PCR验证结果如图19所示。图19中的泳道1、2、3、4、5与6为用抗红霉素的单菌落的总DNA做PCR后得到的 大小为1. 2kb的DNA0M为500bp间隔大小的DNA分子量对照。自下而上依次为500bp，IOOObp, 1500bp, 2000bp (最亮的一条带)，2500bp, 3000bp 等。所用的一对引物为5’ -CTTTCTAGAATGCGTACACTGAAAAATCTTATTACGG-3’5’ -ATCCGCGG TTACAATAATTTTTTGCGCGTTCCCC-3’PCR扩增的条件为94度变性40秒，58度退火40秒，72度延伸60秒，共35个循环。证明载体pAX-SZhaS5已经转化到巨大芽孢杆菌基因组中。实施例4 基因工程革兰氏阳性菌产透明质酸的乳糖诱导发酵试验用质粒载体pNW-szhasl转化纳豆芽孢杆菌细胞后得到抗氯霉素的单菌落，经验 证后抗性菌落含有透明质酸合成酶基因，挑取一株菌进行摇瓶发酵试验。先将菌株接种在2 毫升LB培养基中(添加15微克/微升的氯霉素)培养过夜，再将1毫升菌液接种到含有100 毫升基本培养基的500毫升摇瓶中(成分为KH2P04 7. Og/L, Na2HP04 5. Og/L, (NH4) 2S04 5. 0g/L，柠檬酸三钠 2. 5g/L，MgS04. 7H20 2. 5g/L，CaC12. 2H20 0. 25g/L，葡萄糖 10g/L，5 毫 升微量元素母液；微量元素母液成分为柠檬酸50g/L，FeS04. 7H20 10g/L, MnS04. H20 5g/ L，CuS04. 5H20 lg/L，ZnC12 2g/L)。在37度、pH值7. 0、200转/分钟条件下先培养一段时 间直至葡萄糖基本消耗完全，再加入终浓度为乳糖作为诱导剂诱导36小时，发酵结束 后，离心取上清加入3倍体积的无水乙醇有白色絮状沉淀产生。说明乳糖能诱导透明质酸的合成。实施例5 基因工程革兰氏阳性菌产透明质酸的木糖诱导发酵试验用质粒载体pAX-szhasl转化解淀粉芽孢杆菌细胞后得到抗红霉素的单菌落，经 验证后抗性菌落含有透明质酸合成酶基因，挑取一株菌进行摇瓶发酵试验。先将菌株接种 在2毫升LB培养基中(添加4微克/微升的红霉素)培养过夜，再将1毫升菌液接种到 含有100毫升基本培养基的500毫升摇瓶中(成分为KH2P04 7. 0g/L, Na2HP04 5. 0g/L, (NH4) 2S04 5. 0g/L，柠檬酸三钠 2. 5g/L，MgS04. 7H20 2. 5g/L, CaC12. 2H20 0.25g/L，葡萄 糖10g/L，5毫升微量元素母液；微量元素母液成分为柠檬酸50g/L，FeS04. 7H20 10g/L, MnS04. H20 5g/L, CuS04. 5H20 lg/L, ZnC12 2g/L)。在 37 度、pH 值 7. 0,200 转 / 分钟条件 下先培养一段时间直至葡萄糖基本消耗完全，再加入终浓度为0. 5%木糖作为诱导剂诱导 48小时，发酵结束后，离心取上清加入3倍体积的无水乙醇有白色絮状沉淀产生。
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说明木糖能够诱导透明质酸的合成。实施例6 基因工程革兰氏阳性菌产透明质酸的蔗糖诱导发酵试验用质粒载体pAX-CVhaS5转化地衣芽孢杆菌细胞后得到抗红霉素的单菌落，经验 证后抗性菌落含有透明质酸合成酶基因，挑取一株菌进行摇瓶发酵试验。先将菌株接种在2 毫升LB培养基中(添加4微克/微升的红霉素)培养过夜，再将1毫升菌液接种到含有100 毫升基本培养基的500毫升摇瓶中(成分为KH2P04 7. Og/L, Na2HP04 5. Og/L, (NH4) 2S04 5. Og/L，柠檬酸三钠 2. 5g/L，MgS04. 7H20 2. 5g/L，CaC12. 2H20 0. 25g/L，葡萄糖 5g/L，5 毫 升微量元素母液；微量元素母液成分为柠檬酸50g/L，FeS04. 7H20 10g/L, MnS04. H20 5g/ L，CuS04. 5H20 lg/L，ZnC12 2g/L)。在37度、pH值7. 0、200转/分钟条件下先培养一段时 间直至葡萄糖基本消耗完全，再加入终浓度为2%蔗糖作为诱导剂诱导透明质酸的合成，继 续培养直至发酵结束。发酵结束后，发酵液变得较为粘稠，离心取上清加入3倍体积的无水 乙醇有白色絮状沉淀产生。说明蔗糖能够诱导透明质酸的合成。实施例7 基因工程革兰氏阳性菌产透明质酸的发酵罐发酵试验用整合表达载体pAX-szhase转化枯草芽孢杆菌细胞后得到抗红霉素的菌落，经 验证后抗性菌落含有透明质酸合成酶基因，挑取一株菌进行发酵罐发酵试验。先将菌株接 种在4毫升LB培养基中(添加4微克/微升的红霉素)培养过夜得到一级试管种子，再将 1毫升菌液接种到含有100毫升基本培养基的500毫升摇瓶中培养得到二级摇瓶种子，共培 养400毫升的二级种子。将400毫升摇瓶种子全部接入含3. 0升的发酵罐中，在37度、pH 值7. 0,600转/分钟条件下先培养一段时间直至葡萄糖基本消耗完全，将搅拌转速降低到 400转/分钟，再补加蔗糖使终浓度达到2. 5%，同时补加酵母浸粉作为氮源，继续培养直至 发酵结束。发酵结束后，发酵液变得较为粘稠，取10毫升发酵液，离心取上清加入3倍体积 的无水乙醇有白色絮状沉淀产生，所产生的白色絮状沉淀如图20，将此白色絮状沉淀保存 在无水乙醇中。基本培养基成分为KH2P047. Og/L, Na2HP04 5. 0g/L, (NH4)2S04 5. 0g/L，柠檬酸三 钠 2. 5g/L，MgS04. 7H20 2. 5g/L，CaCl2. 2H20 0. 25g/L，葡萄糖 5g/L，5 毫升微量元素母液； 微量元素母液成分为柠檬酸 50g/L, FeS04. 7H20 10g/L, MnS04. H20 5g/L，CuS04. 5H201g/L, ZnCl2 2g/L。蔗糖补液瓶的浓度为50% (质量体积百分比)，酵母浸粉补液瓶的浓度为20% (质量体积百分比)。实施例8发酵液中透明质酸的精制取实施例7得到发酵液800mL，边搅拌边加入氯苯，共加入200毫升，以5000rpm离 心lOmin，去除菌体沉淀，在上清液中加人10g氯化钠充分溶解，再向其中加入3倍体积的 95%的乙醇，混勻并搅拌，静置30分钟，以3000rpm离心lOmin，得到白色沉淀物即为HA提 取物。将浓度为4. 2g/L的NaHC03水溶液450mL和浓度为5. 3g/L的Na2 C03水溶液50mL 加入上述提取物中，再加入20mg的胰蛋白酶(每mg蛋白质加100个活力单位的酶量)，在 35°C、120rpm下搅拌水解2h。再加入氯化钠到上述溶液中至浓度达到10g/L并搅拌使之完 全溶解，然后加入3倍体积的95%乙醇，静置凝聚沉淀lh，以3000rpm离心得到透明质酸的沉淀。
将得到的该沉淀加到含NaCl浓度为10g/L、Na2HP04浓度为0. 2g/L、NaH2 P04浓 度为0. 06g/L的500mL水溶液中，搅拌溶解，向其中加入3倍体积的95%乙醇，混勻搅拌， 3000rpm离心回收得到透明质酸沉淀，并用30mL 80%的乙醇洗涤，干燥得到固体透明质 酸。将上述得到的固体HA溶于Na2HP04浓度为0. lg/L、NaH2P04浓度为0. 05g/L, NaCl浓 度为10g/L的400mL水溶液中，搅拌溶解，然后向溶液中加入用酸预处理过的5g活性炭并 以80rpm，50°C搅拌lh，然后经0. 22m的滤膜抽滤，得到澄清的滤液。将该滤液经35000Da 透析袋用1000mL去离子水在4°C透析过夜。在透析袋中加入3倍体积的95%乙醇，混勻搅 拌得到絮状的透明质酸，离心得到沉淀，用20mL丙酮洗涤沉淀。固体HA经冷冻、真空干燥 研磨得到白色粉末状透明质酸精制品。所使用的药品均为医用级的药品，在空气净化级别为1万的洁净环境中操作。采用该方法能够从发酵液中制备符合化妆品级别以及医药外用的透明质酸纯品。实施例9 基因工程革兰氏阳性菌发酵制备的透明质酸的红外检测鉴定将实施例8得到的白色透明质酸进行溴化钾压片，再进行红外光谱检测分析，得 到红外吸收特征性光谱图，与标准透明质酸的红外吸收特征性光谱图进行比较，结果可以 看出，基因工程产生的白色絮状沉淀即为透明质酸。基因工程革兰氏阳性菌分泌产生的白 色絮状沉淀的红外吸收光谱图如图21。由图21可以看出，在3400CHT1附近有强烈的0_H伸缩振动，表明该物质具有多羟 基结构，而透明质酸属于含有多羟基的粘多糖。在1620、1043与1542CHT1处有较强的吸收， 表明含有C = 0、C-N伸缩振动与N-H弯曲振动，表明该物质含有乙酰氨基的结构，而透明质 酸含有乙酰氨基。在1427cm—1处有0 = C-0伸缩振动吸收带，表明存在葡萄糖醛酸上解离 的羧基与羟基结构。在U^jOO-SSOcnT1处无吸收带，表明该物质不含硫酸化的基团。该 物质的红外吸收峰与透明质酸标准特征吸收峰完全吻合，表明基因工程革兰氏阳性菌产生 的白色絮状沉淀为透明质酸粘多糖。该方法能够证明基因工程革兰氏阳性菌产生的白色絮状沉淀即为透明质酸。实施例10 含基因工程革兰氏阳性安全微生物产生的透明质酸的润肤露的制备 按照下面的配方制得含透明质酸的润肤露(单位均为质量体积百分比)
权利要求
一种基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其特征在于包括以下步骤第一步、从革兰氏阳性安全微生物宿主中分离与透明质酸前体，即UDP 葡萄糖醛酸以及UDP N 乙酰 葡萄糖氨的合成相关的基因，包括UDP 葡萄糖脱氢酶基因，即SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34；UTP 葡萄糖 1 磷酸转移酶基因，即SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37；葡萄糖 6 磷酸变位酶基因，即SEQ ID No.38、SEQ ID No.39；葡萄糖 6 磷酸异构酶基因，即SEQ ID No.40；氨基转移酶，即SEQ ID No.41以及N 乙酰基 1 磷酸 葡糖氨 尿嘧啶基转移酶基因，即SEQ ID No.42和SEQ ID No.43；第二步、按照步骤一所述的革兰氏阳性安全微生物宿主的密码子偏好性对SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48进行碱基替换，分别得到SEQ IDNo.1到SEQ ID No.27共27种不同的序列；第三步、将来自SEQ ID No.1到SEQ ID No.27中的任一种基因以及SEQ ID No.31到SEQ IDNo.43基因的一种以上的基因与组成型启动子或者可诱导启动子组成一个基因表达盒；第四步、采用电转化的方法、制备原生质体的方法或制备感受态细胞的方法将基因表达盒转化革兰氏阳性微生物宿主菌，用选择标记筛选，得到能分泌透明质酸的革兰氏阳性基因工程安全宿主菌；第五步、对革兰氏阳性基因工程安全宿主菌进行发酵培养，在培养阶段加入诱导透明质酸合成的诱导剂以提高透明质酸的合成水平，发酵结束后即从培养基中分离纯化得到基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸；所述的透明质酸由D 葡萄糖醛酸与N 乙酰基葡萄糖氨以双糖单元交替连接而成的直链大分子酸性粘多糖，其分子量为五万到五百万道尔顿。
2.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其 特征是，所述的革兰氏阳性安全微生物宿主是指以下菌中的任一种丁酸梭菌或酪酸梭菌、 地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、有益或无毒蜡样芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、短 短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪地 芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌或嗜淀粉拟杆菌。
3.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其 特征是，所述的含有 SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 48基因的微生物依次分别为兽疫链球菌、类马疫链球菌、绿草履虫小球藻病毒1、化脓 链球菌以及乳房链球菌。
4.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其 特征是，所述的进行碱基替换是指按照宿主基因组的密码子偏好性进行密码子优化，将来 自其它非宿主菌的与透明质酸合成相关的基因按照宿主菌的基因在翻译成蛋白质时所采 用的密码子偏好性进行碱基替换。
5.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其 特征是，所述的基因表达盒中包括组成型启动子或化学诱导启动子，其中组成型启动子是指宿主菌在培养的任何时期均具有转录活性的启动子；所述的可诱导启动子是指在宿主菌培养的特定时期才具有转录活性的启动子，具体包括化学诱导 启动子和物理诱导启动子。
6.根据权利要求5所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其 特征是，所述的化学诱导启动子包括巨大芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的启动子、巨大芽孢 杆菌的木糖异构酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌的果聚蔗糖酶基因的启动子、枯草芽孢杆 菌的木糖异构酶基因的启动子、大肠杆菌的阿拉伯糖利用操纵子的启动子、大肠杆菌的乳 糖利用操纵子的启动子、大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其 特征是，所述的化学诱导启动子的转录是指所述的果聚蔗糖酶基因的启动子只有加入蔗糖后才可能起始其下游基因的转录，蔗糖 的浓度为0.5%到10% ；所述的的木糖异构酶基因的启动子只有加入木糖后才可能起始其下游基因的转录，木 糖的质量百分比浓度为0. 5%到8% ；。所述的阿拉伯糖利用操纵子的启动子只有加入阿拉伯糖后才可能起始其下游基因的 转录，阿拉伯糖的质量百分比浓度为0.5%到8% ；所述的乳糖利用操纵子的启动子只有加入乳糖后才可能起始其下游基因的转录，乳糖 的质量百分比浓度为0. 5%到8%。
8.根据权利要求5所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其 特征是，所述的物理诱导的启动子包括来源于枯草芽孢杆菌的groESL基因的热诱导启动 子、来源于枯草芽孢杆菌的dnaK基因的热诱导启动子以及来源于地衣芽孢杆菌的groE基 因的热诱导启动子。
9.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，其 特征是，所述的选择标记是指用来有效筛选含有透明质酸合成相关基因的革兰氏阳性安 全微生物宿主的基因。
10.根据权利要求1所述的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法， 其特征是，所述的发酵培养是指配取葡萄糖5-20克/升、酵母浸粉0. 5-5克/升、七水硫 酸镁0. 3-3克/升、磷酸二氢钾3-8克/升、磷酸氢二钠2-8克/升、硫酸铵2-8克/升、柠 檬酸钠2-5克/升、七水硫酸亚铁1-20毫克/升、一水硫酸锰1-20毫克/升、无水硫酸铜 0. 2-10毫克/升、氯化锌0. 2-10毫克/升，用柠檬酸或氢氧化钠调节酸碱度至6. 5-7. 5 ；发 酵温度为28-37度，搅拌转速为300-600转/分钟。
全文摘要
一种基因工程技术领域的基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸的异源合成方法，通过从革兰氏阳性安全微生物宿主中克隆与透明质酸前体合成相关的基因(序列表中的SEQ ID No.31到SEQ ID No.43)；按照革兰氏阳性安全微生物宿主的基因密码子偏好性重新设计并合成透明质酸合成酶基因(序列表中的SEQ ID No.1到SEQ ID No.27)，并将与透明质酸前体合成相关的基因与优化的透明质酸合成酶基因组成基因表达盒，最后将基因表达盒转化革兰氏阳性微生物宿主菌，得到能分泌透明质酸的革兰氏阳性基因工程安全宿主菌，经发酵培养得到基于革兰氏阳性安全微生物的透明质酸。本发明大大提高了宿主细胞合成透明质酸的能力。
文档编号C12R1/10GK101935679SQ201010117889
公开日2011年1月5日 申请日期2010年3月4日 优先权日2010年3月4日
发明者程海荣, 邓子新 申请人:上海交通大学;淄博科锐控制系统工程有限公司