热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用的制作方法
本发明属于生物工程领域，涉及一种热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶(GAD)突变体及其应用。
背景技术：
γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然的功能性非蛋白质氨基酸，广泛存在于动物、植物和微生物中，具有降血压、抗惊厥、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、改善脑细胞、促进激素分泌和保肝利肾等功能,在医药、食品保健、化工、农业等方面具有广泛的应用。目前国内外主要采用化学合成法、微生物发酵法和生物转化酶法制备γ-氨基丁酸。化学法合成GABA的过程中，需要用到强酸或强碱等腐蚀性较强的溶剂，反应条件剧烈，原料毒性大，价格昂贵且存在较多安全隐患等问题；微生物发酵法条件温和、安全、成本较低，但后处理过程复杂且生产周期长；生物转化酶法合成GABA可提高底物转化率和产品纯度,具有节约后处理工序、缩短生产周期及降低环境污染等优点，是未来GABA制备工艺开发的主要方向。
生物转化酶法合成GABA主要利用了能催化L-谷氨酸裂解为GABA和二氧化碳的谷氨酸脱羧酶(GAD，EC4.1.1.15)。该酶广泛存在于原核和真核生物细胞中，是GABA生物合成的限速酶，相关研究报道很多。为解决天然GAD不足的问题，人们克隆了大肠杆菌、乳酸菌、嗜热链球菌等的GAD基因，并在大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌中进行了表达，并有相关专利报道(申请号：201010567447.9，201110289796.3,201210431917.8,201510229161.2，201510198433.7，201510819438.7)。为解决多数GAD最适pH低(3.8-4.5)，pH高于6.0时易失活问题，人们利用基因改造获得了近中性pH稳定性提高的突变体(如大肠杆菌或乳酸菌GAD的C末端455-456位缺失的突变体、植物乳杆菌GAD 89位谷氨酸E突变为精氨酸R或丙氨酸A的突变体(申请号201510819438.7)，并通过用酸调节并维持反应体系pH、用L-谷氨酸取代谷氨酸钠为底物、在反应体系中添加阳离子交换树脂等优化酶转化反应条件与方式等。
良好的热稳定性是理想的生物催化剂应具备的条件之一。细菌中的GAD酶最适反应温度一般在30-50℃之间，在50℃以上极易失活。短乳杆菌GAD酶在55℃下半衰期为30.9min，大肠杆菌GAD酶在50℃半衰期为24min，非常不利于GAD在GABA生物制备中的应用。在保证GAD酶活性基础上，提高GAD的热稳定性是工业生产GABA中需要迫切解决的问题。申请号201110297056.7的专利公开了热稳定性提高的短乳杆菌GAD 311位甘氨酸G突变为脯氨酸P的突变体G311P。申请号201110297904.1的专利公开了热稳定性提高的短乳杆菌GAD 56位甘氨酸G突变为脯氨酸P的突变体G56P。申请号201510952734.4的专利根据嗜热古细菌GAD氨基酸序列比对信息，经定点突变在短乳杆菌对应位点引入脯氨酸P，筛选到55℃下半衰期比野生型延长了14.5min的突变体G364P。随着酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
技术实现要素：
本发明的目的就是提供热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体，并提供其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体，其由大肠杆菌来源的谷氨酸脱羧酶(其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)编码基因进行点饱和突变并筛选得到。
所述谷氨酸脱羧酶突变体氨基酸序列相对于天然的谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的第5-7位的谷氨酰胺Q、缬氨酸V和苏氨酸T分别突变为谷氨酸E、丝氨酸S和缬氨酸V；或，
所述谷氨酸脱羧酶突变体氨基酸序列相对于天然的谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的第5-7位的谷氨酰胺Q、缬氨酸V和苏氨酸T分别突变为酪氨酸Y、精氨酸R和赖氨酸K；或，
所述谷氨酸脱羧酶突变体氨基酸序列相对于天然的谷氨酸脱羧酶氨基酸序列的第5-7位的谷氨酰胺Q、缬氨酸V和苏氨酸T分别突变为天门冬酰胺N、酪氨酸Y和缬氨酸V。
这三种突变体分别表示为Q5E/V6S/T7V、Q5Y/V6R/T7K或Q5N/V6Y/T7V。
本发明的突变体是将大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的近N端部分氨基酸残基进行定点饱和突变，增加其蛋白质分子链间和链内氢键数量得到的。获得的三种谷氨酸脱羧酶突变体的半失活温度为50-54.5℃，比野生型提高了10.2-14.3℃；在45℃下的半衰期由原来的24min提高到126-160min，提高了4.2-5.6倍。
获得的三种谷氨酸脱羧酶突变体在pH6.5时的相对酶活由原来的38％提高到72％-84％，在中性pH范围内的酶活稳定性显著提高。本发明所得的谷氨酸脱羧酶突变体更加适合工业化的生产需求，为高效合成氨基丁酸奠定了基础。
所述谷氨酸脱羧酶突变体Q5E/V6S/T7V、Q5Y/V6R/T7K或Q5N/V6Y/T7V的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
所述的谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示。
含有所述编码基因的载体为质粒或细胞，优选为大肠杆菌的质粒或细胞，也包括乳酸菌、枯草杆菌、酵母、短棒杆菌等的质粒或细胞。
本发明还提供应用大肠杆菌作为基因工程菌产谷氨酸脱羧酶突变体的方法，具体方法为：将37℃，200rpm过夜培养的种子(大肠杆菌)以5％的接种量转入TB培养基，于37℃、200rpm条件下培养至OD600为1时，加入终浓度0.7mM的IPTG诱导表达，得到谷氨酸脱羧酶突变体。
本发明还提供所述的谷氨酸脱羧酶突变体的另一种获得方法，针对由大肠杆菌来源的谷氨酸脱羧酶的氨基酸位点设计引物，以构建成功的含野生菌gad B基因(GenBank No.EF551361.1)的质粒pET28a-gad(PCR扩增目标基因后，采用切、接、转、增、鉴的标准分子生物学流程构建)为模板，通过PCR获得编码突变体的基因及质粒，将扩增基因或质粒转化入大肠杆菌等宿主内表达，得到谷氨酸脱羧酶突变体。
除大肠杆菌外，本发明也构建了突变体基因的枯草杆菌重组质粒，并利用枯草杆菌表达得到了GAD突变体。
本发明提供了所述的谷氨酸脱羧酶突变体在生物合成催化L-谷氨酸或其钠盐生成氨基丁酸中的应用。利用谷氨酸脱羧酶突变体全细胞，在30-50℃，初始pH3.8-5.0下分批次加入总量415g/L的谷氨酸，转化24h后得到265-305g/L的γ-氨基丁酸(GABA)，摩尔转化率为86.0％-99.1％。
与现有技术相比，本发明将来源于大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的编码基因进行定点饱和突变并筛选得到三种谷氨酸脱羧酶突变体。获得的三种谷氨酸脱羧酶突变体的半失活温度为50-54.5℃，比野生型提高了10.2-14.3℃；在45℃下的半衰期由原来的24min提高到126-160min，提高了4.2-5.6倍。获得的三种谷氨酸脱羧酶突变体在pH6.5时的相对酶活由原来的38％提高到72％-84％，在中性pH范围内的酶活稳定性显著提高。本发明所得的谷氨酸脱羧酶突变体更加适合工业化的生产需求，为高效合成氨基丁酸奠定了基础。
附图说明
图1为谷氨酸脱羧酶基因PCR扩增结果。其中，1为PCR扩增gadB基因；M为DNA Mark IV标准分子量。
图2为重组质粒pET28a-GAD B的PCR鉴定结果。其中1-4分别为挑取转化后平板上的单克隆，M为DNA MarkIV标准分子量。
图3为SDS-PAGE分析GAD及其突变体表达情况。其中，M为蛋白分子量标准蛋白，1和2为野生型GAD的诱前与诱后，3和4为GAD突变体1的诱前与诱后，5和6为GAD突变体2的诱前与诱后，7和8为GAD突变体3的诱前与诱后。
图4为Ni柱纯化后的GAD及其突变体。其中1-4分别为野生型GAD、GAD突变体1、GAD突变体2和GAD突变体3。
图5为GAD及其突变体在不同温度下的热稳定性。其中A为野生型GAD、B为GAD突变体1、C为GAD突变体2、D为GAD突变体3。
图6为重组GAD及其突变体转化制备γ-氨基丁酸的结果。其中A为野生型GAD、B为GAD突变体2。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明的以下实施例中使用的培养基和试剂信息如下：
LB液体培养基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％(百分含量均指质量分数)、pH 7.0。
LB固体培养基：蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％、琼脂1.5％(百分含量均指质量分数)、pH 7.0。
磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.2mol/L),pH 7.4。
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：磷酸氢二钠(0.2mol/L)、柠檬酸(0.1mol/L)，pH 4.0。
硼砂-硼酸缓冲液：含硼砂根(0.2mol/L)、硼酸0.2mol/L、硼砂0.05mol/L，pH 9.0。
反应液：0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(L-MSG 1M，PLP 0.1M，pH 4.0)。
本发明的以下实施例中使用的引物均委托上海捷瑞生物工程技术有限公司合成。测序均委托上海美吉基因测序公司完成。质粒DNA的抽提、回收和纯化分别使用细菌质粒提取试剂盒(购自捷瑞公司)和胶回收试剂盒(购自捷瑞公司)完成。限制性内切酶均购自日本Takara公司。PCR扩增使用Taq DNA聚合酶(购自日本Takara公司)完成，反应体系和反应条件参照说明书设置。
本发明的以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
本发明的以下实施例中使用的原料或试剂除特别注明外，均市售可得。除特别注明外，％均代表重量体积(w/v)百分比。
实施例1谷氨酸脱羧酶GAD重组菌的构建
以大肠杆菌E.coli DH5α基因组DNA为模板，利用引物5’-AATTGGATCCATGGATAAGAAGCAAG-3’和5’-AAGGCTCGAGGGTATGTTTAAAGCTG-3’进行PCR扩增gadB基因序列(图1)。图1显示，成功获得约1400bp的目标基因。用限制性内切酶Nco I和Xho I消化处理PCR产物和载体pET28a(+)。酶切产物纯化后，T4连接酶16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌培养、抽提质粒后，以BamH I和Xho I双酶切质粒鉴定gadB是否存在(图2)。图2表明，挑取的2个重组子均有约1400bp大小的gadB目的基因条带和约5300bp的pET28a(+)载体条带，均为阳性克隆。选取其中1#重组子测序，测序结果证实其为正确的重组子pET28-GADB。将1#菌对应的质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得谷氨酸脱羧酶GAD重组表达菌。
实施例2GAD突变体重组菌的构建
以质粒pET28-GADB为模板，利用引物5’-ACCATGGATAAGAAGNNNNNNNNNGATTTAAGGTCGGAAC-3’和5’-NNNNNNNNNCTTCTTATCCATGGTATATCTCCTTC-3’进行反向PCR扩增含gadB基因的全质粒序列，Dpn I消化后，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆菌，于含卡那霉素的LB培养基的96孔深孔板中培养过夜。
实施例3热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶重组菌的筛选
将实施例2中的菌体转接到新的含卡那霉素的LB培养基的96孔深孔板中，37℃培养2-4h至OD600约为0.6时，加入终浓度0.2mM的IPTG，16℃诱导培养过夜。离心去除培养液，加入200ul含20mM溴甲酚绿，10mM谷氨酸钠，0.1mMPLP的10mM pH4.8的乙酸-乙酸钠溶液，45℃保温1h，筛选孔内颜色呈深蓝色的重组菌株，测序分析相应质粒突变位点的核苷酸与氨基酸序列。
实施例4重组GAD酶及其突变体的表达与纯化
将含有pET28a-GADB及其突变体重组质粒的E.coli BL21(DE3)接种到含有50ug/mL卡那霉素的LB培养基，于37℃、180rpm转速的恒温摇床中培养过夜。取培养液以2％的接种量接种到新鲜的含50ug/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃、180rpm的摇床中振荡培养至OD600达0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，16℃、180rpm继续振荡培养14-16h，诱导GAD及其突变体的表达。
4℃、5000×g离心20分钟收集菌体，用磷酸钾缓冲液(50mM，pH7.6)洗涤一次，弃去上清液，并将菌体重悬于1/10培养液体积的磷酸钾缓冲液(50mM，pH7.6)。然后在冰浴中超声破碎细胞(功率200瓦，工作4秒，间歇4秒，循环100次)，4℃，12000×g离心30分钟去除细胞碎片，收集上清粗酶液。用Ni-NTA亲和层析法纯化GAD及其突变体，获得纯酶液。用Sephadex G25柱脱盐并替换成pH3.8、0.1M的柠檬酸缓冲液，Bradford法测定蛋白浓度，SDS-PAGE检测蛋白纯度(图3、图4)。
图3的pET-28a-GAD与其突变体的蛋白诱导表达前后的SDS-PAGE电泳图显示，与诱导前相比(泳道1,3,5,7)，IPTG诱导后的野生型GAD、GAD突变体1、GAD突变体2和突变体3(泳道2,4,6,8)均在诱前、诱后样品均在53kDa左右出现与目标蛋白大小一致的新条带，说明四种重组菌种目标蛋白成功表达。
图4中泳道1～4分别为原始菌、M1、M2、M3经过镍柱亲和层析和G25脱盐柱除盐后的蛋白样品。由图4可见，纯化后的野生型GAD及其3种突变体纯度均达到90％以上，几乎不见目标蛋白带之外的非特异性条带。
实施例5重组野生型GAD酶及其突变体的热稳定性分析
将野生型GAD及其突变体的纯酶在20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下分别保温15min后，立即置于冰浴上5min，测定不同温度下GAD酶残余活力。以20℃保温15min的酶活力为参比，以温度为横坐标X、相对活力为纵坐标y作散点图，并将数据进行非线性拟合，计算半失活温度T1/2(表1)，以考察酶的热稳定性。野生型GAD的半失活温度为40.2℃，突变体的半失活温度分别为48.2、50.4和45.1℃，比野生型GAD提高4.9-10.2℃。
表1 GAD及其突变体的半失活温度。
将野生型GAD及其突变体的纯酶在40℃、50℃和60℃下分别保温2h-12h后，立即置于冰浴上5min，测不同温度下GAD酶残余活力。以不做保温处理的酶活力为参比，以时间为横坐标X、相对活力为纵坐标y作散点折线图，考察酶的热稳定性。野生型GAD在所测试的40℃、50℃和60℃下保温2h的残留酶活力均在50％以下，保温12h后的残留酶活力约为15％；三个GAD突变体40℃保温2h后残留酶活力在85％-95％之间，保温12h后的残留酶活力在35％-70％之间，比野生型GAD酶明显稳定(图5)。
将野生型GAD及其突变体的纯酶在45℃分别保温5-180min后，立即置于冰浴上5min，测定不同处理时间下GAD酶残余活力。45℃下，野生型GAD半衰期为24min，而突变体的半衰期分别为76、90和129min，是野生型GAD的3.1-5.3倍(表2)。
表2 GAD及其突变体在45℃的半衰期
实施例6重组野生型GAD菌及其突变株转化谷氨酸(钠)制备γ-氨基丁酸
在含有10mM PLP的200mM pH4.8的乙酸-乙酸钠溶液中加入重组菌体，使其终浓度为50g/L，并分批次加入总量510g/L的谷氨酸(钠)，30℃反应24h，期间取样并测定γ-氨基丁酸生成量(图6)。由图6a可见，重组野生型GAD菌全细胞催化的反应进行到6h时摩尔转化率为46％；12h时γ-氨基丁酸生成量为313.17g/L；24h后γ-氨基丁酸生成量为464.07g/L，摩尔转化率90％。图6b显示2号重组突变体2号全细胞催化的反应前6～8h的摩尔转化率与重组野生型GAD菌相当；12h时产物γ-氨基丁酸生成量为348.46g/L，较野生型菌高35.29g/L；24h后产物γ-氨基丁酸生成量为492.72g/L，较野生型菌提高28.26g/L，摩尔转化率提高近6个百分点，达95.56％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
<110>华东理工大学
<120>热稳定性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
<160>7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp
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Ser Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys
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Arg Phe Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile
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200 205 210
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215 220 225
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320 325 330
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<210> 2
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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305 310 315
Asn Phe Ser Arg Pro Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu
320 325 330
Phe Leu Arg Leu Gly Arg Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala
335 340 345
Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu
350 355 360
Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile
365 370 375
Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp Gly Glu Asp Pro Gly Tyr
380 385 390
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Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu Ser Asp
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Thr
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Thr
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aacaaaaact ggatcgacaa agaagaatat ccgcaatccg cagccatcga cctacgttgc 300
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accaacacca ttggttcttc cgaggcctgt atgctcggcg ggatggcgat gaaatggcgt 420
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aaagtacaga acgcctctta ccaggttgcc gcttatctgg cggatgaaat cgccaaactg 1080
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aaactgaaag atggtgaaga tccgggatac accctgtatg acctctctga acgtctgcgt 1200
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