本发明涉及一种提高重组大肠杆菌胆盐水解酶产量的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术：
胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是降解胆汁的主要组成成份——共轭胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共轭胆酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐水解酶的生理作用体现在两个方面：一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和降低胆固醇水平等；二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。
由于胆盐水解酶通常来源于乳酸菌等微生物中，其生长环境和发酵强度不适合大规模工业化生产。另一方面，目前报道的多数胆盐水解酶表达量低。因此，提供一种提高重组大肠杆菌胆盐水解酶产量的方法对于胆盐水解酶的工业化生产具有重要的意义。
技术实现要素：
为了克服上述问题，本发明的第一个目的是提供一种发酵培养基，含有：葡萄糖14～18g/L，酵母膏18～20g/L，KH2PO46～8g/L，K2HPO42～2.5g/L，FeCl20.8～1g/L，MgCl20.5～0.8g/L，CaCl21～1.5g/L，pH6.5～7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基配方为：葡萄糖15g/L，酵母膏20g/L，KH2PO46.5g/L，K2HPO42.4g/L，FeCl20.85g/L，MgCl20.6g/L，CaCl21.2g/L，pH6.5～7.0。
本发明的第二个目的是提供一种提高重组大肠杆菌胆盐水解酶产量的方法，是将重组大肠杆菌对数期种子以5～8％的接种量转接至权利要求1所述发酵培养基中，200-220rpm，发酵24～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以pET-28a(+)为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达SEQ ID NO.1所示基因。
在本发明的一种实施方式中，所述菌体培养至OD600为0.8～1.0时，加入乳糖诱导。
在本发明的一种实施方式中，所述乳糖浓度为2～2.5g/L。
本发明还提供所述的方法在制备含胆盐水解酶的产品中的应用。
有益效果：本发明的重组大肠杆菌实现了双歧杆菌来源的胆盐水解酶基因的异源表达，该重组菌发酵36h胆盐水解酶活力为114.5U/mL，本发明还通过优化培养基成分及诱导条件，将酶活提高至135.5U/mL，更适用于大规模工业化生产，为工业应用奠定了基础。
具体实施方式
LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0；
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/L K2HPO4。
胆盐水解酶酶活测定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)稀释至90μL，加入10μL结合胆盐(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等体积的15％(w/v)三氯乙酸终止反应，离心后取10μL上清液与190μL茚三酮试剂混合，于100℃反应15min，冷却后于570nm处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成为：0.5mL 1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5柠檬酸盐缓冲液)，1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的柠檬酸缓冲液。
本发明中采用牛磺脱氧结合胆酸(TDCA)评价胆盐水解酶酶活。
实施例1
以双歧杆菌ATCC 27672(购自ATCC)为出发菌株，接种至含0.5％(质量分数)半胱氨酸的MRS培养基中，37℃厌氧培养至对数期，取10μL的菌悬液滴加在灭菌冷却后的载玻片上，用ARTP诱变育种仪(思清源生物科技)进行等离子诱变，将诱变后的菌株接种至TB培养基中，培养24h，检测全细胞酶活。将酶活最高的菌株发酵液离心收集菌体，提取基因组。以Genbank登录号530821.1的bsh基因为模板设计引物，扩增双歧杆菌BH06的bsh基因，凝胶核酸电泳验证并测序，获得如SEQ ID NO.1所示基因。
以质粒pET-28a(+)为载体，构建重组质粒pET-28a(+)-bsh，转化至E.coil JM109的感受态细胞，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，经测序验证，将测序正确的质粒pET-28a(+)-bsh转化至大肠杆菌E.coil BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coil BL21(DE3)pET-28a(+)-bsh。
实施例2
挑取重组菌的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1％，于37℃、200rpm条件下培养至菌体长到OD600为0.8时，加入乳糖诱导，乳糖浓度为2g/L，并将培养温度降到24℃，发酵36h。测定酶活，结果显示，发酵36h胆盐水解酶酶活达114.5U/mL。
实施例3
按如下配方配制培养基：葡萄糖15g/L，酵母膏20g/L，KH2PO46.5g/L，K2HPO42.4g/L，pH6.5～7.0。
按实施例2的方法培养菌体，其区别在于将TB培养基替换为上述发酵培养基。测定发酵36h胆盐水解酶酶活为119.3U/mL。
实施例4
按如下配方配制培养基：葡萄糖15g/L，酵母膏20g/L，KH2PO46.5g/L，K2HPO42.4g/L，FeCl20.85g/L，pH6.5～7.0。
按实施例2的方法培养菌体，其区别在于将TB培养基替换为上述发酵培养基。测定发酵36h胆盐水解酶酶活为125.3U/mL。
实施例5
按如下配方配制培养基：葡萄糖15g/L，酵母膏20g/L，KH2PO46.5g/L，K2HPO42.4g/L，MgCl20.6g/L，pH6.5～7.0。
按实施例2的方法培养菌体，其区别在于将TB培养基替换为上述发酵培养基。测定发酵36h胆盐水解酶酶活为128.6U/mL。
实施例6
按如下配方配制培养基：葡萄糖15g/L，酵母膏20g/L，KH2PO46.5g/L，K2HPO42.4g/L，CaCl21.2g/L，pH6.5～7.0。
按实施例2的方法培养菌体，其区别在于将TB培养基替换为上述发酵培养基。测定发酵36h胆盐水解酶酶活为124.2U/mL。
实施例7
按如下配方配制培养基：葡萄糖15g/L，酵母膏20g/L，KH2PO46.5g/L，K2HPO42.4g/L，FeCl20.85g/L，MgCl20.6g/L，CaCl21.2g/L，pH6.5～7.0。
按实施例2的方法培养菌体，其区别在于将TB培养基替换为上述发酵培养基。测定发酵36h胆盐水解酶酶活为135.6U/mL。
实施例8
按如下配方配制培养基：葡萄糖15g/L，酵母膏20g/L，KH2PO46.5g/L，K2HPO42.4g/L，FeCl20.85g/L，MgCl20.6g/L，CaCl21.2g/L，pH6.5～7.0。
挑取重组菌的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，转接到上述培养基中，接种量为1％，于37℃、200rpm条件下培养至菌体长到OD600为1.0时，加入乳糖诱导，乳糖浓度为2.5g/L，并将培养温度降到24℃，培养36h。测定酶活，结果显示，发酵36h胆盐水解酶酶活为132.1U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 曹书华
<120> 一种提高重组大肠杆菌胆盐水解酶产量的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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gactggtctg aagactacgg tgaaaaaatc gttttcgctc cgcacgacta ccactacgct 120
ccggctttca acgctgaaga caaaaaccac ccggttatcg gtatcggtat catcgttgaa 180
gacaccccgc tgtacttcga ctgcatgaac gacgctggtc tggctgttgc tggtctgaac 240
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