在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌。
背景技术：
：淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉占淀粉含量的15％-25％，由线性的葡萄糖以α-1，4糖苷键构成；支链淀粉占75％-85％，由若干个寡糖链以α-1，6糖苷键结合在主链上形成分支结构。由于淀粉结构的特殊性，需要多种酶协同作用才能把高分子的淀粉降解为寡糖、二糖和单糖。普鲁兰酶因其能专一性地水解支链淀粉的α-1,6糖苷键的性质决定了其在增强淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量和开发新产品方面有着巨大的价值，在淀粉加工相关行业有着重要的用途和良好的市场前景。目前限制普鲁兰酶产业化应用的主要问题是普鲁兰酶生产菌的发酵活力低，生产成本高。将普鲁兰酶进行异源表达是提高普鲁兰酶发酵酶活的有效方法之一。相对于大肠和毕赤酵母表达系统，枯草芽孢杆菌具有以下优点：枯草芽孢杆菌是食品级的表达系统、具有较强的分泌蛋白质的能力、良好的发酵基础和生产技术等。目前许多研究人员尝试用枯草芽孢杆菌表达普鲁兰酶，但表达酶活都比较低。通过分析发现以下几个因素影响了普鲁兰酶的表达：(1)枯草芽孢杆菌自身会分泌大量的蛋白酶，这些蛋白酶会分解表达的普鲁兰酶；(2)没有找到合适的启动子和信号肽；(3)表达质粒随着传代次数的增加，容易丢失。为了提高普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌的表达，必须解决好以上所提到的问题。本专利以枯草芽孢杆菌为出发菌，通过基因敲除技术缺失了枯草芽孢碱性蛋白酶基因和中性蛋白酶基因得到枯草芽孢突变菌株Bs-vtr。其次以Bs-vtr为宿主，组合优化了普鲁兰酶的表达元件启动子和信号肽，最终得到一系列高效表达普鲁兰酶的枯草芽孢菌种，为普鲁兰酶的工业化应用奠定基础。技术实现要素：本发明的目的是减少枯草蛋白酶对重组普鲁兰酶的影响，通过敲除了枯草碱性蛋白酶基因和中性蛋白酶基因，得到了枯草突变菌株，然后导入包含优化的启动子、信号肽和普鲁兰酶基因的重组载体，高效表达普鲁兰酶。根据本发明的枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法包括步骤：构建碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌种；构建包含启动子、信号肽和普鲁兰酶基因的表达载体；将上述构建的表达载体转入碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌种，培养获得普鲁兰酶，其中，所述启动子为选自：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子，和/或来源于苏云金芽孢杆菌的启动子中的一种或多种，所述信号肽为选自：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶信号肽，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，和/或地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽中的一种或多种。根据本发明的具体实施方式的在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法，其特中，所述启动子为枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子，所述信号肽为枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽。根据本发明的另一在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法包括步骤：构建碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌种；构建包含启动子、信号肽和普鲁兰酶基因的表达载体；将上述构建的表达载体转入碱性蛋白酶和中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌种，培养获得普鲁兰酶，其中，所述启动子为选自核苷酸序列如SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16和/或SEQIDNO.17所示杂合启动子中的一种或多种，所述信号肽为选自：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶信号肽，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，和/或地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽中的一种或多种。根据本发明的能够高效表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌的蛋白酶和中性蛋白酶缺失，并且包普鲁兰酶基因、以及适于普鲁兰酶基因表达的启动子和信号肽，其中，所述启动子为选自：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子，和/或来源于苏云金芽孢杆菌的启动子中的一种或多种，所述信号肽为选自：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶信号肽，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，和/或地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽中的一种或多种。根据本发明的另一能够高效表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌的蛋白酶和中性蛋白酶缺失，并且包普鲁兰酶基因、以及适于普鲁兰酶基因表达的启动子和信号肽，其中，所述启动子为选自核苷酸序列如SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16和/或SEQIDNO.17所示杂合启动子中的一种或多种，所述信号肽为选自：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶信号肽，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，和/或地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽中的一种或多种。根据本发明的具体实施方式，首先敲除了枯草碱性蛋白酶基因和中性蛋白酶基因，得到了枯草突变菌株Bs-vtr。以枯草突变菌株Bs-vtr为宿主菌，以脱支芽孢杆菌(Bacillusderamificans)普鲁兰酶Bdp为报告基因，普鲁兰酶Bdp基因序列如SEQIDNO.1所示，以表达元件启动子P43+信号肽SacB组合为对照，分别组合优化启动子和信号肽。所用的启动子包括：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶启动子P地，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子P碱，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子P中，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子P淀，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子P解，来源于苏云金芽孢杆菌的启动子P苏。启动子的序列如SEQIDNO.2至SEQIDNO.7所示。所用的信号肽包括：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶信号肽S地，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽S碱，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽S中，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽S淀，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽S解，地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽S几。信号肽的序列如SEQIDNO.8至SEQIDNO.13所示。得到一系列高效表达普鲁兰酶的启动子和信号肽的组合。由表1可知这些组合的相对表达酶活是对照组合(启动子P43+信号肽SacB)的150％-300％。以P地，P碱，P中，P淀，P解和P苏这6种启动子为模板构建杂合启动子，进一步提高普鲁兰酶的表达活性。通过实验最终得到一系列杂合强启动子，由表2可知这些杂合强启动子的相对表达酶活是对照组合(启动子P43+信号肽SacB)的400％-700％。杂合强启动子的序列如SEQIDNO.14至SEQIDNO.17所示。本发明通过基因敲除技术得到枯草突变菌株Bs-vtr。再以Bs-vtr为宿主菌，分别组合优化了表达普鲁兰酶的启动子和信号肽，最终得到了一系列能高效表达普鲁兰酶的启动子和信号肽，为普鲁兰酶的工业化应用奠定基础。附图说明图1显示敲除整合载体Puc-Ats的结构示意图。图2显示表达载体Puc-vtr的结构示意图。具体实施方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：1、菌株与载体大肠杆菌菌株Topl0、枯草芽胞杆菌10033、地衣芽胞杆菌10037、解淀粉芽胞杆菌10079、苏云金芽胞杆菌20557购自中国工业微生物菌种保藏管理中心、敲除载体Puc-Ats和表达载体Puc-vtr示意图如图1和图2所示。2、酶与试剂盒高保真Q5酶，购自NEB公司，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。3、培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-Cl为LB培养基加100ug/mL氯霉素。产酶培养基实施例1、构建枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶缺失菌种将枯草芽胞杆菌10033接入LB培养基，37℃培养24h后，提取基因组DNA。用相应引物，分别扩增碱性蛋白酶的上下游同源臂，将扩增好的同源臂用重叠PCR进行融合扩增，最后将扩增产物用限制性内切酶BamHI和XbaI酶切，纯化回收后连入载体Puc-Ats，转至大肠杆菌top10，提取质粒得到碱性蛋白酶敲除载体Puc-Ats-AprE。采用电转化的方法将敲除载体Puc-Ats-AprE转入枯草芽胞杆菌10033，转化子用四环素抗性平板筛选。将在抗性平板上长出的转化子，在45℃下进行高温诱导，使载体Puc-Ats-AprE的复制子失活，从而促使载体Puc-Ats-AprE和枯草芽孢杆菌10033进行同源重组。用相应引物分别进行5端同源臂和3端同源臂PCR扩增，确定同源臂单交换所发生的位置。将确定好同源臂单交换所发生位置的转化子，进行无抗传代培养，连续传代10次进行点板实验，将在抗性板上不长，在无抗性板上长得转化子初步确定为碱性蛋白酶缺失。提取初步确定碱性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌的基因组，用相应引物进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，最终确定碱性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌，命名为Bs-1。实施例2、构建枯草芽孢杆菌中性蛋白酶缺失菌种以实施例1构建的Bs-1为出发菌，按照上述相同的方法，将中性蛋白酶基因进行敲除。用相应引物进行5端和3端同源臂扩增，构建中性蛋白酶敲除载体Puc-Ats-NprE。通过电转化方法将Puc-Ats-NprE转入Bs-1，经过45℃高温诱导后，得到单交换的枯草芽孢杆菌。再经过无抗传代，得到双交换的枯草芽孢杆菌。经过PCR测序，最终得到中性蛋白酶基因缺失的枯草芽孢杆菌命名为Bs-vtr。实施例3、启动子和信号肽组合优化表达普鲁兰酶Bdp1、启动子及信号肽克隆分别将枯草芽胞杆菌10033、地衣芽胞杆菌10037、解淀粉芽胞杆菌10079、苏云金芽胞杆菌20557接入LB培养基进行扩大培养。离心收集扩大培养的菌体，提取相应芽孢杆菌的基因组DNA。用相应引物分别扩增相应的启动子和信号肽。得到的启动子包括：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶启动子P地，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子P碱，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子P中，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子P淀，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子P解，来源于苏云金芽孢杆菌的启动子P苏。启动子的序列如SEQIDNO.2至SEQIDNO.7所示。得到的信号肽包括：地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶信号肽S地，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽S碱，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽S中，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽S淀，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽S解，地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽S几。信号肽的序列如SEQIDNO.8至SEQIDNO.13所示。2、启动子和信号肽组合采用重叠PCR的方法将不同的启动子、不同的信号肽和普鲁兰酶Bdp融合至一起后连接到表达载体Puc-vtr得到相应的普鲁兰酶表达载体。将构建好的表达载体，通过电转化的方法转入宿主菌Bs-vtr。将转化子接入产酶培养基，培养24h后进行普鲁兰酶活性测定。普鲁兰酶活性测定参照国标GB1886.174-2016进行。根据酶活测定结果，得到有效的启动子和信号肽组合。不同启动子和信号肽组合表达普鲁兰酶的相对酶活如表1所示。由表1可知，相对于P43+SacB的组合，所有优化组合的普鲁兰酶相对酶活均有一定的提高。其中以P碱+S淀的效果最好，相对酶活性为300％，其次为P淀+S中，相对酶活性为210％。表1启动子+信号肽普鲁兰酶相对表达活性(％)P43+SacB100P碱+S淀300P碱+S地225P碱+S中178P淀+S中210P淀+S几198P淀+S碱168P地+S解190P地+S几180P中+S地160P中+S淀189P淀+S碱175P淀+S地180P苏+S地169P苏+S碱186实施例4、杂合启动子构建为了进一步筛选表达普鲁兰酶的强启动子，以P地，P碱，P中，P淀，P解和P苏为模板分别进行组合。将组合好的杂合启动子分别和不同的信号肽S地，S碱，S中，S淀，S解和S几进行组合，经过筛选得到四个高表达普鲁兰酶的杂合强启动子，分别命名为P1，P2，P3，P4，其中P1由P地，P碱和P解构成；其中P2由P地，P解和P苏构成；P3由P地，P中和P苏构成；P4由P碱，P解和P中构成。这四个杂合启动子的序列如SEQIDNO.14至SEQIDNO.17所示。这四个杂合启动子和不同信号肽S地，S碱，S中，S淀，S解和S几组合的表达普鲁兰酶活性如表2所示。表2启动子+信号肽普鲁兰酶相对表达活性(％)P43+SacB100P1+S淀400P1+S地620P1+S中580P1+S解450P1+S几620P2+S碱480P2+S解450P2+S几470P2+S地490P2+S淀430P3+S碱560P3+S地550P3+S几630P3+S解650P3+S淀590P4+S几600P4+S碱580P4+S解610P4+S淀570P4+S地620实施例5、普鲁兰酶整合型枯草芽孢杆菌的构建以枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶为目标整合位点，分别将实施例3和4所得到的启动子和信号肽组合、普鲁兰酶基因序列以及作为同源臂的部分中温α-淀粉酶基因序列克隆连接到敲除整合载体Puc-Ats，得到相应的敲除整合载体。在根据实施例1所描述的方法进行普鲁兰酶整合型枯草芽孢杆菌的构建，得到相应的普鲁兰酶整合型枯草芽孢杆菌。<110>广东溢多利生物科技股份有限公司<120>在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌<160>17<210>1<211>2493<212>DNA<213>人工<400>1gaaaaagatgctgaggatgcagctaaacccgctgtaagcaacgcttatttagatgcttca60aaccaggtgctggttaaacttagccagccgttaactcttggggaaggcgcaagcggcttt120acggttcatgacgacacagcaaataaggatattccagtgacatctgtgaaggatgcaagt180cttggtcaagatgtaaccgctgttttggcaggtaccttccaacatatttttggaggttcc240gattgggcacctgataatcacagtactttattaaaaaaggtgactaacaatctctatcaa300ttctcaggagatcttcctgaaggaaactaccaatataaagtggctttaaatgatagctgg360aataatccgagttacccatctgacaacattaatttaacagtccctgccggcggtgcacac420gtcactttttcgtatattccgtccactcatgcagtctatgacacaattaataatcctaat480gcggatttacaagtagaaagcggggttaaaacggatctcgtgacggttactctaggggaa540gatccagatgtgagccatactctgtccattcaaacagatggctatcaggcaaagcaggtg600atacctcgtaatgtgcttaattcatcacagtactactattcaggagatgatcttgggaat660acctatacacagaaagcaacaacctttaaagtctgggcaccaacttctactcaagtaaat720gttcttctttatgacagtgcaacgggttctgtaacaaaaatcgtacctatgacggcatcg780ggccatggtgtgtgggaagcaacggttaatcaaaaccttgaaaattggtattacatgtat840gaggtaacaggccaaggctctacccgaacggctgttgatccttatgcaactgcgattgca900ccaaatggaacgagaggcatgattgtggacctggctaaaacagatcctgctggctggaac960agtgataaacatattacgccaaagaatatagaagatgaggtcatctatgaaatggatgtc1020cgtgacttttccattgaccctaattcgggtatgaaaaataaagggaagtatttggctctt1080acagaaaaaggaacaaagggccctgacaacgtaaagacggggatagattccttaaaacaa1140cttgggattactcatgttcagcttatgcctgttttcgcatctaacagtgtcgatgaaact1200gatccaacccaagataattggggttatgaccctcgcaactatgatgttcctgaagggcag1260tatgctacaaatgcgaatggtaatgctcgtataaaagagtttaaggaaatggttctttca1320ctccatcgtgaacacattggggttaacatggatgttgtctataatcatacctttgccacg1380caaatctctgacttcgataaaattgtaccagaatattattaccgtacggatgatgcaggt1440aattataccaacggatcaggtactggaaatgaaattgcagccgaaaggccaatggttcaa1500aaatttattattgattcccttaagtattgggtcaatgagtatcatattgacggcttccgt1560tttgacttaatggcgctgcttggaaaagacacgatgtccaaagctgcctcggagcttcat1620gctattaatccaggaattgcactttacggtgagccatggacgggtggaacctctgcactg1680ccagatgatcagcttctgacaaaaggagctcaaaaaggcatgggagtagcggtgtttaat1740gacaatttacgaaacgcgttggacggcaatgtctttgattcttccgctcaaggttttgcg1800acaggtgcaacaggcttaactgatgcaattaagaatggcgttgaggggagtattaatgac1860tttacctcttcaccaggtgagacaattaactatgtcacaagtcatgataactacaccctt1920tgggacaaaatagccctaagcaatcctaatgattccgaagcggatcggattaaaatggat1980gaactcgcacaagcagttgttatgacctcacaaggcgttccattcatgcaaggcggggaa2040gaaatgcttcgtacaaaaggcggcaacgacaatagttataatgcaggcgatgcggtcaat2100gagtttgattggagcaggaaagctcaatatccagatgttttcaactattatagcgggcta2160atccaccttcgtcttgatcacccagccttccgcatgacgacagctaatgaaatcaatagc2220cacctccaattcctaaatagtccagagaacacagtggcctatgaattaactgatcatgtt2280aataaagacaaatggggaaatatcattgttgtttataacccaaataaaactgtagcaacc2340atcaatttgccgagcgggaaatgggcaatcaatgctacgagcggtaaggtaggagaatcc2400acccttggtcaagcagagggaagtgtccaagtaccaggtatatctatgatgatccttcat2460caagaggtaagcccagaccacggtaaaaagtaa2493<210>2<211>607<212>DNA<213>人工<400>2ccttctttgtgcttggaagcagagcccaatattatcccgaaacgataaaacggatgctga60aggaaggaaacgaagtcggcaaccattcctgggaccatccgttattgacaaggctgtcaa120acgaaaaagcgtatcaggagattaacgacacgcaagaaatgatcgaaaaaatcagcggac180acctgcctgtacacttgcgtcctccatacggcgggatcaatgattccgtccgctcgcttt240ccaatctgaaggtttcattgtgggatgttgatccggaagattggaagtacaaaaataagc300aaaagattgtcaatcatgtcatgagccatgcgggagacggaaaaatcgtcttaatgcacg360atatttatgcaacgtccgcagatgctgctgaagagattattaaaaagctgaaagcaaaag420gctatcaattggtaactgtatctcagcttgaagaagtgaagaagcagagaggctattgaa480taaatgagtagaaagcgccatatcggcgcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatg540gtatttgttaaaaattcggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaaggggag600gagaatc607<210>3<211>191<212>DNA<213>人工<400>3gttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatat60acctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatcta120ttacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaacttaagcaaaagga180gagggacgcgt191<210>4<211>361<212>DNA<213>人工<400>4cctttacttcttattaaggcctcattcggttagacagcggacttttcaaaaagtttcaag60atgaaacaaaaatatctcatcttccccttgatatgtaaaaaacataactcttgaatgaac120caccacatgacacttgactcatcttgatattattcaacaaaaacaaacacaggacaatac180tatcaattttgtctagttatgtacatgacacttgactcatcttgatattattcaacaaaa240acaaacacaggacaatactatcaattttgtctagttatgttagtttttgttgagtattcc300agaatgctagtttaatataacaatataaagttttcagtattttcaaaaagggggatttat360t361<210>5<211>380<212>DNA<213>人工<400>5ggctgaaaatgattcttctttttatcgtctgcggcggcgttctgtttctgcttcggtatg60tgattgtgaagctggcttacagaagagcggtaaaagaagaaataaaaaagaaatcatctt120gaaaaatagatggtttctttttttgtttggaaagcgagggaagcgttcacagtttcgggc180agctttttttataggaacattgatttgtattcactctgccaagttgttttgatagagtga240ttgtgataattttaaatgta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