本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高活性木瓜蛋白酶的制备工艺。
背景技术：
宣木瓜，是贴梗海棠的成熟果实，属于蔷薇科木瓜属灌木。是安徽著名的一种食品药品特产，宣木瓜中的微量元素和营养物质的含量很多且种类较多，有“百益之果”的称号。宣木瓜鲜重中含有约1. 1%的粗蛋白，其中还有结构蛋白和生物功能蛋白，如大量蛋白酶类，富含有人体所需的大量必需氨基酸。在应用方面，提取宣木瓜中的蛋白酶并纯化，再生产成为嫩肉粉、饲料添加剂、饼干松化剂、啤酒澄清剂和水解动物蛋白系列等产品。
目前，木瓜中蛋白酶的制备工艺主要有1.盐析沉淀法2.超滤法3.乙醇沉淀法。
盐析沉淀法是通过改变中性无机盐的浓度来改变蛋白质的溶解度，同时给蛋白质表面的水化膜造成破坏而引起蛋白质的沉淀，这种工艺的作用条件比较温和，能较大程度的保留酶的活性，但是沉淀物中会残留较多的盐析溶剂，不利于后续的纯化
超滤法是一种先进的提取技术，是木瓜蛋白酶精制的方向，该工艺存在的问题是，由于木瓜浆液中含有胶质、淀粉类物质较多，搅拌提取工序木瓜酶溶解释放不完全，后续板框滤渣较多，滤液不清；膜分离过滤阶段由于滤膜孔径小，会造成滤膜堵塞，过滤速度慢，影响木瓜蛋白酶的分离，生产过程中要停机对滤膜进行清洗，导致一部分酶的损失，降低了酶活。
乙醇沉淀法是木瓜蛋白酶初步提取纯化的常用方式，乙醇提取木瓜蛋白酶，材料简易，操作方便，分辨率较高，不需要用一些工艺来去除沉淀中的提取剂，只需自然挥发就可以，也可以用真空抽滤，但是乙醇法在提取过程中会降低蛋白酶的酶活。
纤维素酶和果胶酶可在温和的条件下破碎植物细胞的细胞壁，与不加该酶处理的果肉匀浆相比，可显著提高果实的出汁率，使细胞中的成分透过松散的细胞壁溶出。两种酶按一定比例复合相比添加单一的酶可显著提高果实的出汁率，提高木瓜蛋白的提取率。
蛋白酶提取，分离过程中其活性中心含有巯基的键容易发生氧化形成二硫键使酶失活，使制备的蛋白酶活性降低，影响其功能的发挥，L-cys与EDTA可以有效保护蛋白酶防止其被氧化，减少酶活损失，且两者复合添加对酶活保护作用效果更好。
技术实现要素：
为了提高木瓜蛋白酶的提取率，同时显著提高木瓜蛋白酶的活性，本发明提供一种高活性木瓜蛋白酶的制备工艺。
一种高活性木瓜蛋白酶为木瓜蛋白酶的粗制产品，为浅黄色粉末，水溶性良好，酶活达到1.55万U/g。
制备一种高活性木瓜蛋白酶的具体操作步骤如下：
（1）制备宣木瓜浆
将新鲜宣木瓜洗净，去皮、去仔，分割成小块，按质量比1：1加入蒸馏水，榨汁；得到宣木瓜浆；
（2）制备宣木瓜汁
在宣木瓜浆中加入复合酶，搅拌均匀，在温度40～50℃条件下酶解反应1.5～2h，得到酶解宣木瓜汁；所述复合酶由纤维素酶和果胶酶组成，复合酶的加入量为宣木瓜浆质量的0.6～1.2%；
（3）抽滤
将酶解宣木瓜汁抽滤去除滤渣，得新鲜宣木瓜汁；
（4）离心分离
将新鲜宣木瓜汁离心分离，取上清液，温度1～4℃条件下冷藏备用；
（5）制备复合溶液
在上清液中加入浓度75%的乙醇和复合保护剂，用浓度0.1mol/L的氢氧化钠（NaOH）调节pH值为6.0-8.0，静置10～12h，得到复合溶液；
所述复合保护剂由半胱氨酸（L-cys）和乙二胺四乙酸（EDTA）组成；
（6）制备木瓜蛋白酶
将复合溶液离心取沉淀，冷冻干燥至恒重，得到木瓜蛋白酶。
进一步限定的技术方案如下：
步骤（1）中，榨汁时间为3min。
步骤（2）中，纤维素酶的酶活为5万U/g，果胶酶的酶活为10万U/g；复合酶中纤维素酶：果胶酶的质量比为8:1。
步骤（3）中，抽滤过120目双层滤布。
步骤（4）中，离心分离的转速为3500rpm，时间为15min。
步骤（5）中，按1：1的体积比在上清液中加入浓度75%的乙醇；半胱氨酸（L-cys）的添加量为0.06mol/L，乙二胺四乙酸（EDTA）的添加量为0.004mol/L。
步骤（6）中，离心分离的转速为5500rpm，时间为10～15min；冷冻干燥温度为﹣40℃。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1.本发明操作流程简单，能提高蛋白酶的提取率，添加复合酶与酶活保护剂显著提高了木瓜蛋白酶的活性，木瓜蛋白酶的酶活达到1.55万U/g。
2.木瓜蛋白酶在食品工业中可用于酶促反应有效地使蛋白质发生转化，提高食品的营养价值，有利于人体的消化和吸收，以及其他的产业开发，且用途广泛，所提供的工艺能够给宣木瓜的产业化开发提供一种新的途径，从而达到其经济价值。此工艺制得的宣木瓜蛋白酶粗制品与市售精制食品级木瓜蛋白酶的酶活无显著差异，通过应用试验，其能够显著善肉制品的嫩度。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
以下实施例所用原料：纤维素酶的酶活为5万U/g，果胶酶的酶活为10万U/g，半胱氨酸（L-cys），乙二胺四乙酸（EDTA），氢氧化钠（NAOH），均购于市场。
实施例1：
本实施例无添加复合酶和复合酶活保护剂。
制备一种高活性木瓜蛋白酶的具体操作步骤如下：
（1）将新鲜宣木瓜，去皮、去仔，分割成小块，按质量比1:1加入蒸馏水，榨汁打浆3min，得到宣木瓜浆。
（2）采用120目双层滤布，抽滤，去除滤渣，得新鲜宣木瓜汁。
（3）将新鲜宣木瓜汁经离心分离，取上清液，冷藏备用，其中转速为3500rpm，时间为15min。冷藏条件为4℃。
（4）按1:1的体积比在上清液中加入75%的乙醇，静置10h，得到溶液。
（5）将溶液离心取沉淀，冷冻干燥至恒重得木瓜蛋白酶粗品。其中离心转速为5500rpm，离心时间为15min。
所得木瓜蛋白酶粗品为浅黄色粉末，水溶性良好，酶活为0.2万U/g。
实施例2：
本实施例添加复合酶，无添加复合酶活保护剂。
制备一种高活性木瓜蛋白酶的具体操作步骤如下：
（1）将新鲜宣木瓜，去皮、去仔，分割成小块，按质量比1:1加入蒸馏水，榨汁打浆3min，得到宣木瓜浆。
（2）在宣木瓜浆中加入复合酶，复合酶的加入量为宣木瓜浆质量的0.9%；复合酶由纤维素酶和果胶酶按质量比8:1组成，搅拌均匀，在50℃下酶解反应1.5h。
（3）采用120目双层滤布，抽滤，去除滤渣，得新鲜宣木瓜汁。
（4）将所得新鲜宣木瓜汁在转速为3500rpm条件下离心分离15min，取上清液，4℃冷藏备用。
（5）按1:1的体积比在上清液中加入75%的乙醇，静置10h，得到复合溶液。
（6） 将复合溶液在转速为5500rpm条件下离心分离15min，取沉淀，冷冻干燥至恒重得木瓜蛋白酶粗品。所得木瓜蛋白酶粗品浅黄色粉末，水溶性良好，酶活达到0.60万U/g。
实施例3：
本实施例无添加复合酶，添加复合酶活保护剂
制备一种高活性木瓜蛋白酶的具体操作步骤如下：
（1）将新鲜宣木瓜，去皮、去仔，分割成小块，按质量比1:1加入蒸馏水，榨汁打浆3min，得宣木瓜浆。
（2）采用120目双层滤布，抽滤，去除滤渣，得新鲜宣木瓜汁。
（3）将所得新鲜宣木瓜汁在转速为3500rpm条件下离心分离15min，取上清液，4℃冷藏备用。
（4）在上清液中加入浓度75%的乙醇和复合酶活保护剂，用0.1mol/L的氢氧化钠（NaOH）调节pH值为7.0，静置10h，得复合溶液。其中乙醇和上清液的质量比为1:1，乙二胺四乙酸（EDTA）的添加量为0.004mol/L，半胱氨酸（L-cys）的添加量为0.06mol/L。
（5）将复合溶液在转速5500rpm条件下离心分离15min，取沉淀，冷冻干燥至恒重，得木瓜蛋白酶粗品。所得木瓜蛋白酶粗品为浅黄色粉末，水溶性良好，酶活达到0.65万U/g。
实施例4：
本实施例添加复合酶与复合酶活保护剂。
制备一种高活性木瓜蛋白酶的具体操作步骤如下：
（1）将新鲜宣木瓜，去皮、去仔，分割成小块，按质量比1:1加入蒸馏水，榨汁打浆3min，得到宣木瓜浆。
（2）在宣木瓜浆中加入复合酶，复合酶的加入量为宣木瓜浆质量的0.9%，搅拌均匀，在50℃下酶解反应1.5h。复合酶由纤维素酶和果胶酶按质量比8:1组成。
（3）采用120目双层滤布，抽滤，去除滤渣，得新鲜宣木瓜汁。
（4）将所得新鲜宣木瓜汁在转速3500rpm条件下离心分离15min，取上清液，4℃冷藏备用。
（5） 在上清液中加入浓度75%的乙醇和复合酶活保护剂，用0.1mol/L的氢氧化钠（NaOH）调节pH值为7.0，静置10h，得复合溶液。其中乙醇和上清液的质量比为1:1，乙二胺四乙酸（EDTA）的添加量为0.004mol/L，半胱氨酸（L-cys）的添加量为0.06mol/L。
（6）将复合溶液在转速为5500rpm条件下离心分离15min，取沉淀，冷冻干燥至恒重，得木瓜蛋白酶粗品。所得木瓜蛋白酶粗品为浅黄色粉末，水溶性良好，酶活达到1.55万U/g。
通过以上四个实例，测量所得宣木瓜蛋白酶粗制品的酶活，结果如表1：
通过表1可以看出，未添加复合酶与复合酶活保护剂，所得蛋白酶粗制品酶活为0.25万U/g，添加复合酶后酶活提高至0.60万U/g，添加复合酶活保护剂之后酶活提高至0.65万U/g，而在制备过程中添加复合酶与复合酶活保护剂，其酶活可提高至1.55万U/g。测得市售食品级木瓜蛋白酶酶活为1.60万，因此制备过程中添加复合酶与复合酶活保护剂所得蛋白酶粗制品酶活与市售食品级木瓜蛋白酶无显著（p﹥0.05）差异。
通过对实例4所得木瓜蛋白酶粗制品对肉制品的应用试验，以剪切力为衡量指标，将肉制品经木瓜蛋白酶粗制品与市售木瓜蛋白酶处理，与未经处理的肉制品相比，剪切力显著减小，经木瓜蛋白酶粗制品与市售食品级木瓜蛋白酶处理的肉制品则无显著差异。
本发明提供了一种高活性木瓜蛋白酶的制备工艺，需要着重被保护的为添加复合酶与复合酶活保护剂的方法，对于本领域的技术人员来说，可根据以上的技术方案及构思，做出相应的改变及变形，而所有的这些改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围之内。