本发明属于生化分离技术领域，涉及一种木瓜蛋白酶的分离提纯方法，尤其涉及一种改性聚乙二醇-酒石酸钠双水相萃取分离提纯木瓜蛋白酶的方法。
背景技术：
木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜未成熟果实的乳汁中，它是由212个氨基酸组成的蛋白质单链，具有耐高温、活性强、稳定性好，蛋白质水解能力强等特征，还具有凝乳、解脂和溶菌活力，是能作用于各类蛋白质的纯天然产物。对pH变化和金属离子及去垢剂不敏感，其用途很多，目前已广泛的应用于食品、化工、轻纺工业、医药卫生等各个行业。在肉类加工中，木瓜蛋白酶是最好的肉类嫩化剂，这是因为木瓜蛋白酶与其他蛋白酶相比，其热稳定性较高。将木瓜蛋白酶用于对冷冻贮存过程中啤酒处理，能水解啤酒内蛋白质，部分水解一些已形成的复合物，产生更多的多肽或氨基酸，保证啤酒在冷冻过程中的高清澈度，同时改善啤酒口感及原有多肽和氨基酸的组成和比例，有效地改良啤酒品质。因此，研究、探讨、寻求最佳提取工艺对木瓜蛋白酶的开发、制备和应用具有极其重要的意义。提取木瓜蛋白酶的传统方法有：超滤法、盐析法、有机溶剂法、絮凝法、亲和层析法等。
双水相萃取技术近年来愈来愈得到研究者的青睐，其相对传统的分离纯化技术具有提纯效率高、设备常规、操作简便，适于大规模生产等优点，且不存在有机溶剂的残留问题，易于放大和连续操作，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。双水相萃取是利用组分在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离的萃取技术。双水相萃取中使用的双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的盐溶液和高分子溶液组成。然而现有的双水相萃取技术需要在体系分相后辅以离心等操作，从而加速系统分相，并向体系中加入中性盐KCl增加目标产物的分配系数和收率增加了操作难度和经济成本。因此，开发一种步骤简单，设备常规，分离效果好，分离效率高的双水相萃取分离葛根素的方法是目前亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明提供了一种改性聚乙二醇-酒石酸钠双水相萃取分离提纯木瓜蛋白酶的方法，所用设备常规，操作简便，分离效率高，适合工业化生产。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：
一种高效分离提纯木瓜蛋白酶的方法，包括如下步骤：
(1)粗提液制备：将木瓜乳汁加入水中浸泡4-6小时后，于-20℃下冷冻3-8小时后，再于25℃融化，如此反复冻融3～4次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液即为含木瓜蛋白酶的粗提液。
(2)双水相萃取：向步骤(1)所得含木瓜蛋白酶的粗提液中加入改性聚乙二醇和酒石酸钠，震荡混合后，静置15-30分钟，收集上相，所述改性聚乙二醇为辛酸部分酯化聚乙二醇。双水相萃取体系由互不相溶的改性聚乙二醇和酒石酸钠构成，利用木瓜蛋白酶在改性聚乙二醇和酒石酸钠中的选择性分配，使其与粗提液中其他杂质分离，从而达到分离纯化的目的。双水相体系中两相的极性差为分相速度的重要影响因素，采用聚乙二醇和酒石酸钠的双水相体系，两相分离速度较慢，且木瓜蛋白酶纯度不高，主要是由于聚乙二醇和酒石酸钠的极性相差不大，对木瓜蛋白酶的选择性分配不高。采用辛酸酯化改性聚乙二醇的部分端羟基，获得改性聚乙二醇，使其在具有水溶性的同时，增大与酒石酸钠的极性差，从而加快分相速度，不用离心即可成功分相，降低了操作难度，增加了纯化效率。
(3)成品制备：将步骤(2)所得上相在截留相对分子质量为10000的透析膜中透析15-20小时后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15～-10℃冷冻干燥8～15小时得木瓜蛋白酶粉末。
作为优选，步骤(1)中所述木瓜乳汁与水的质量比为1:50-70。
作为优选，步骤(2)改性聚乙二醇中的聚乙二醇平均分子量为600、1000或2000。双水相体系中两相的极性差为分相速度的重要影响因素，低分子量的PEG有利于木瓜蛋白酶分配系数的增加，但是双水相系统对木瓜蛋白酶的选择性会降低，同时低分子量的PEG与酒石酸钠的极性差较低，因此导致体系分相困难，分相速度较慢；高分子量的PEG虽与酒石酸钠的极性差较高，体系分相速度快，但随着PEG平均分子量的增大，体系粘度增大，成相物质分子间的自由体积减小，空间位阻作用增强，阻碍木瓜蛋白酶分子进入PEG相。平均分子量为600、1000或2000的PEG所构成的双水相对木瓜蛋白酶的选择性较好，采用辛酸酯化改性PEG的部分端羟基，获得部分支化的PEG，使其在具有水溶性的同时，增大与酒石酸钠的极性差，从而加快分相速度，不用离心即可成功分相，降低了操作难度，增加了纯化效率。
作为优选，步骤(2)中所述改性聚乙二醇质量为双水相体系总质量的20-25％，酒石酸钠质量为双水相体系总质量的10-15％，含木瓜蛋白酶的粗提液的质量为双水相体系总质量的65-68％。不同浓度组成的双水相体系萃取效果不同，改性聚乙二醇浓度过低，分相困难；随着改性聚乙二醇浓度在一定范围内的增加，双水相体系两相差别较大，利于木瓜蛋白酶在上相中富集，其他水溶性杂质在下相中富集，但是随着改性聚乙二醇浓度继续增大，更多的杂质进入上相，使上相中木瓜蛋白酶的纯度降低。随着酒石酸钠浓度在一定范围内的提高，物质在两相中界面张力增大，有利于木瓜蛋白酶在上相富集，杂质在下相富集；当酒石酸钠浓度更大时，上相体积逐渐减小，同时粘度逐渐增大，不利于木瓜蛋白酶在上相的富集。
作为优选，步骤(2)中所述改性聚乙二醇的制备方法为：将辛酸、聚乙二醇和SO42-/ZrO2固体超强酸催化剂混合均匀后，于120～140℃下反应，反应过程中不断除去生成的水，直至反应液呈中性，停止反应，冷却至常温后，过滤，滤液蒸馏去除水分后即得改性聚乙二醇。
更优选，所述辛酸与聚乙二醇的的质量比为1:6～10，所述固体超强酸催化剂的质量为聚乙二醇质量的0.1～0.15％。辛酸与聚乙二醇的摩尔比决定了聚乙二醇的酯化程度，酯化程度过高则改性聚乙二醇的水溶性下降；酯化程度过低则不足以改善双水相体系的分相速度。
本发明的有益效果为：
1、改性聚乙二醇/酒石酸钠双水相体系对木瓜蛋白酶的选择性高，体系分相速度快，不需借助离心机等设备即可快速分相。
2、采用本发明所述方法制得木瓜蛋白酶粉末中木瓜蛋白酶纯度高达94.5％，总收率为86.2％。
3、本发明所采用的分离纯化方法，操作简便，设备常规，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
(1)改性聚乙二醇的制备
将10g辛酸、60g PEG1000和0.1g SO42-/ZrO2固体超强酸催化剂置于旋转蒸发仪中，混合均匀后，于130℃下反应，并减压分水，PH试纸检测反应液呈中性后，停止反应，冷却至常温后，过滤，滤液蒸馏去除水分后即得改性聚乙二醇65.3g。
(2)木瓜蛋白酶粗提液的制备
将10g木瓜乳汁加入500g去离子水中浸泡6小时后，于-20℃下冷冻3小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液得18g含木瓜蛋白酶的粗提液，纯度为51.4％，收率为92.5％。
(3)双水相萃取
取13g含木瓜蛋白酶的粗提液、4g改性聚乙二醇和3g酒石酸钠加入分液漏斗中，震荡混合后，静置10分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为10000的透析膜中透析20小时后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15℃冷冻干燥10小时得12.6g木瓜蛋白酶粉末，其中木瓜蛋白酶的纯度为94.3％，回收率为91.7％，总收率为84.8％。
实施例2
(1)改性聚乙二醇的制备
将10g辛酸、80g PEG6000和0.12g SO42-/ZrO2固体超强酸催化剂置于旋转蒸发仪中，混合均匀后，于140℃下反应，并减压分水，PH试纸检测反应液呈中性后，停止反应，冷却至常温后，过滤，滤液蒸馏去除水分后即得改性聚乙二醇82.9g。
(2)木瓜蛋白酶粗提液的制备
将10g木瓜乳汁加入600g去离子水中浸泡4小时后，于-20℃下冷冻5小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液得17.4g含木瓜蛋白酶的粗提液，纯度为53.8％，收率为93.4％。
(3)双水相萃取
取12.8g含木瓜蛋白酶的粗提液、5g改性聚乙二醇和2.4g酒石酸钠加入分液漏斗中，震荡混合后，静置8分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为10000的透析膜中透析15小时后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15℃冷冻干燥8小时得13.2g木瓜蛋白酶粉末，其中木瓜蛋白酶的纯度为90.9％，回收率为93.8％，总收率为87.6％。
实施例3
(1)改性聚乙二醇的制备
将10g辛酸、100g PEG2000和0.15g SO42-/ZrO2固体超强酸催化剂置于旋转蒸发仪中，混合均匀后，于150℃下反应，并减压分水，PH试纸检测反应液呈中性后，停止反应，冷却至常温后，过滤，滤液蒸馏去除水分后即得改性聚乙二醇104.9g。
(2)木瓜蛋白酶粗提液的制备
将10g木瓜乳汁加入700g去离子水中浸泡5小时后，于-20℃下冷冻8小时，再于25℃融化，如此反复冻融3次破壁，再将所得溶液离心处理后，收集上清液得16.6g含木瓜蛋白酶的粗提液，纯度为55.0％，收率为91.2％。
(3)双水相萃取
取13.6g含木瓜蛋白酶的粗提液、4.4g改性聚乙二醇和2g酒石酸钠加入分液漏斗中，震荡混合后，静置15分钟后分相，收集上相，将上相置于截留相对分子质量为10000的透析膜中透析24小时后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15℃冷冻干燥15小时得13.8g木瓜蛋白酶粉末，其中木瓜蛋白酶的纯度为93.1％，回收率为94.5％，总收率为86.2％。
比较例1
采用与实施例3步骤(2)和(3)相同的操作方法，不同的是采用聚乙二醇替代改性聚乙二醇，在双水相萃取过程中需要静置4-6小时，并辅助以离心体系才能完全分层。
通过对比比较例1和实施例3，可以发现，部分酯化的聚乙二醇能够加快双水相萃取体系的分相速度，提高产品纯度和收率。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。