水稻质体发育调控基因FLN2及其用途的制作方法

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻FLN2基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因研究对水稻叶绿体发育的影响，可用以解决杂交稻育种过程中杂种的剔除，提高种子的纯度。
背景技术：
：光合作用为水稻的生长提供了物质来源和能量来源，叶绿体是进行光合作用的重要场所，同时也是光合色素的载体，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。高等植物叶绿体的发育需经过一系列复杂的变化过程，需要细胞核基因编码的蛋白和叶绿体编码的蛋白协调参与完成。在黑暗条件中，叶片中非光合作用的前质体发育成黄化质，黄化质体中含有晶格状的原片层，经光照黄化质体不断分化发育形成叶绿体。目前发现的水稻白化突变体通常与叶绿体的发育缺陷相关，进而影响水稻光合作用，造成水稻减产甚至死亡。水稻叶色白化的根本原因是细胞核或细胞质中遗传基因突变，目前已分离出多个与水稻白化相关的基因，目前发现最多的是三角状五肽重复蛋白PPR家族基因，该类基因编码的蛋白质大多数被运输到质体和线粒体中参与调控叶绿体和线粒体中RNA剪接、RNA编辑、翻译以及RNA稳定性的保持，还包括参与叶绿体RNA代谢调控过程的NUS1蛋白以及定位在胞质中鸟甘酸激酶GK。而含有ATP锥体结构域和RNR1结构域的核糖核酸还原酶和类Mi-2蛋白染色质重构因子也已经确定与水稻质体发育有关。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻叶色变异相关的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻叶片颜色进行改造的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻质体发育调控基因FLN2编码的蛋白质，该蛋白质为SEQIDNo：3所示的氨基酸序列(蛋白全长)。作为本发明的水稻质体发育调控基因FLN2编码的蛋白质的改进：所述氨基酸序列还包括在SEQIDNo：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。本发明还同时提供了一种编码上述蛋白质的基因FLN2，该基因FLN2为SEQIDNo：1和2所示的核苷酸序列。即，该基因FLN2具有如SEQIDNo：1所示的cDNA全长序列和SEQIDNo：2所示的gDNA。作为本发明的基因FLN2的改进：所述核苷酸序列还包括在SEQID.No：1和2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。本发明还同时提供了含有上述基因的质粒。本发明还同时提供了含有上述基因的植物表达载体。本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。作为本发明的宿主细胞的改进：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。本发明还同时提供了上述基因的用途：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶片颜色得到改良(影响水稻叶色，包括使转基因植株叶色恢复为正常绿色等)，从而适应生产者的多种需求。本发明能利用该基因研究对水稻叶绿体发育的影响，可用以解决杂交稻育种过程中杂种的剔除，提高种子的纯度。即，由于该基因的发现和应用，人们可以根据自己的需要对叶片颜色进行定向改变，从而达到实际生产方面的要求。本发明还同时提供了一种改良水稻叶片颜色，提高光合效率的方法：包括用具有SEQIDNo：1和2所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。进一步作如下具体说明：本发明的目的是提供一种从水稻白化突变体中克隆的新基因FLN2，具有如SEQIDNo：1所示的cDNA序列和SEQIDNo：2所示的gDNA，也包括与SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本发明中的SEQIDNo：3所示的蛋白质属于磷酸果糖激酶类似蛋白，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQIDNo：1和SEQIDNo：2中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。本发明的另一个目的是提供一种用FLN2基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1300-FLN2,该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶色的方法。具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶色的方法。实现本发明的具体技术步骤如下：一、水稻叶色白化突变体st10的分离和遗传分析：本发明的水稻叶片白化突变体st10来自日本晴(NIP)EMS(EthylMethylSulfonate)诱变产生的突变。该突变体从开始萌发即表现为完全的白化表型(图1A)；3叶期后，新抽的叶片开始部分转绿，分蘖期呈现部分叶片白化的表型(图1B)；抽穗期后90％的叶片均恢复绿色，但穗部为白色(图1C)。st10通过与野生型水稻的正交实验，证明该突变体受隐性单基因控制。二、图位克隆控制水稻白化性状的FLN2基因：1)、FLN2基因的初步定位：为了分离FLN2基因，本发明首先组建了一个定位群体，由st10与籼稻品种培矮64s(Indica)杂交，配成F2定位群体(杂交所得的F1代自交，得F2)，再通过图位克隆的方法，利用STS、SSR等分子标记对FLN2位点进行初步定位，将其初步定位在第3染色体的短臂上，并介于STR20和STR15两STS标记之间，见图2。2)、FLN2基因的精细定位与基因预测：通过对STR20和STR15两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS标记将FLN2精细定位于BAC克隆OJ1519_A12上STR11与STR12标记之间48-kb范围之内(图3B,C)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因。3)、FLN2基因的鉴定和功能分析：为了确定突变基因，我们对48-kb定位区间进行测序，结果表明可能的fructokinase-likeprotein2(FLN2)编码基因第5外显子发生碱基替换，导致FLN2蛋白的第536个氨基酸由色氨酸突变为终止密码子，造成蛋白编码提早终止(图3D,E,F)，由此我们推断白化突变体st10的突变表型可能是由于FLN2基因突变造成的。我们构建了如图4所示的互补载体，用于验证候选基因功能，通过转基因技术，将互补载体转入到突变体st10中，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)，证明本发明正确克隆了FLN2基因，氨基酸序列分析表明FLN2编码pfkB家族中的果糖激酶类似蛋白。此外，由于该基因编码蛋白对叶绿体的发育有影响，我们还构建了如图6所示亚细胞定位载体，通过水稻原生质体转化技术证明FLN2蛋白在细胞中定位于叶绿体。本发明利用水稻白化突变体st10，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了FLN2基因，该基因编码pfkB家族中的果糖激酶类似蛋白，在水稻中影响前质体及叶绿体的发育，但作为糖酵解重要限速酶——果糖激酶的类似蛋白，其在植物叶绿体发育过程中究竟如何发挥作用，FLN2突变后对环境的响应机理如何，还需更多的研究工作去阐明，通过对FLN2基因的功能 解读，丰富了叶绿体发育的分子调控机制，同时为研究水稻前质体、叶绿体的发育及二者的转化机理打下基础。叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。白化突变典型特征是叶绿体发育异常，大部分白化突变体缺乏叶绿素，不能正常进行光合作用，幼苗依靠种子中的胚乳营养生长，当营养耗尽植株就会死亡，植物叶色白化突变产生机制非常复杂，涉及激素调控、核-质基因组互作、质体基因及基因与环境的互作等过程，目前对白化的分子机理研究还仅停留在叶绿素代谢的层面，更为复杂的调控模式还不清楚。本发明获得的白化转绿突变体，是众多白化突变体中较为特殊的一类，苗期表现为白化性状，但在发育后期新生的叶片可以复绿，保证突变体的正常生长。通过图位克隆技术本发明首次在水稻中克隆了相关基因FLN2，该基因编码果糖激酶类似蛋白，属于pfkB家族，在水稻中影响前质体及叶绿体的发育。通过对FLN2基因的功能解读，将为深入研究叶绿体发育机制，阐明植物光合系统作用的分子机理，进而为水稻高光合育种奠定基础。综上所述，本发明利用水稻白化突变体st10，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了FLN2基因，该基因编码pfkb家族中的果糖激酶类似蛋白，在水稻中影响质体、叶绿体的早期发育。通过对FLN2基因的功能解读，进一步明确了FLN2对质体发育的影响，同时为研究前质体向叶绿体转化的分子机制打下基础。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1水稻白化转绿突变体st10与野生型NIP(日本晴)苗期、分蘖期及抽穗期的表型；A：水稻白化转绿突变体st10与野生型NIP苗期全白的表型；B：水稻白化转绿突变体st10与野生型NIP分蘖期复绿的表型；C：水稻白化转绿突变体st10与野生型NIP抽穗期复绿的表型。图2是FLN2基因在水稻第3染色体上的初步定位图。图3是FLN2基因的精细定位及突变位点示意图；A,B:FLN2基因精细定位区间；C,D:候选基因外显子、内含子分布及突变位点示意图；E:FLN2DNA序列突变位点比对；F:FLN2蛋白序列突变位点比对。图4是互补载体pCAMBIA1300-FLN2图谱。图5是功能互补实验T0代转基因水稻植株表型及测序验证；从前至后依次为：st10转空载体转基因株；st10转互补载体p1300-FLN2转基因株；st10转空载体转基因叶片特写；st10转互补载体p1300-FLN2转基因叶片特写；st10转互补载体p1300-FLN2T0代转基因株测序结果。图6是FLN2亚细胞定位载体的构建及原生质体转化结果；图A：以pBI221-GFP为骨架构建的pBI221FLN2亚细胞定位载体；图B：FLN2在细胞中定位于叶绿体中；图B显示了不同观察条件下拍的照片。图7是突变体st10与对照日本晴二叶期高温及低温培养条件下光合色素含量；图A为：24℃培养条件下st10突变体与野生型在叶绿素a，叶绿素b，类胡萝卜素含量等方面差异不大；图B为：32℃培养条件下st10突变体与野生型相比叶绿素a，叶绿素b及类胡萝卜素含量明显减少。图8是突变体和野生型的透射电镜结果；图A为：不同放大倍数下对照NIP及突变体st10前质体的发育情况；突变体的前质体发育受到抑制；图B为：不同放大倍数下对照NIP及突变体st10叶绿体的发育情况，突变体叶绿体发育异常，基粒片层消失。具体实施方式实施例1：1、水稻材料：水稻(OryzasativaL.)突变体st10，原始野生材料为粳稻品种“日本晴”。水稻白化转绿突变体st10来自日本晴EMS(EthylMethylSulfonate)诱变产生的突变(如图1所示)，该突变体是在中国浙江省境内获得。诱变方式为：1％的EMS溶液浸泡诱变；选取苗期白化3叶期后部分复绿的幼苗认定为突变体st10。st10通过与籼稻品种(即，籼稻品种培矮64s)的正交实验，证明该突变体受隐性单基因控制。实验的结果为：在M2代群体中随机选择72个单株进行遗传分析，51株为野生型表型，21株为突变型表型，卡平方检测结果(χ2＝0.63<χ20.05＝3.84)，分离比符合3：1，说明该突变表型由单隐性核基因控制。以籼稻品种培矮64s为母本，st10为父本进行正交所得的F1代植株全部表现为正常表型，F1代自交，得F2代；F2代种子播种四周后，随机选300个单株其中215株表现为野生型表 型，85株表现为突变型表型。卡平方检测结果(χ2＝1.77<χ20.05＝3.84)，正常植株表型和突变体植株表型分离比符合3：1；进一步证明该突变表型受隐性单隐性核基因控制。2、分析和定位群体：纯合的st10突变体和野生型品种籼稻品种培矮64s进行杂交，F1代自交，得到F2群体。并从中选出2885株白化突变个体(隐性个体)作为定位群体。在三叶期每株取0.2克左右的嫩叶，用来提取总DNA。3、SSR和STS标记定位FLN2基因采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于150μl超纯水中，作为DNA样品。每一个PCR反应用2μlDNA样品。FLN2基因的初步定位：在st10与培矮64s组合的F2群体中选取30个隐性个体，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将FLN2初步定位在第3号染色体短臂STR20和STR15两STS标记之间(如图2所示)。PCR反应体系如下：10μl反应体系中包括：DNA模板1μl；10xPCRbuffer1μl；dNTP(2.5mmol/l)1μl；PrimerF(2.5μmol/l)1μl；PrimerR(2.5μmol/l)1μl；TAKARA公司的rTaq聚合酶0.5μl；ddH2O4.5μl。PCR反应条件：94℃下预变性4min；94℃下30s，退火30s(退火温度随不同标记各异，变化范围在48℃-60℃之间)，72℃延伸30s；共40个循环；72℃下延伸10min，15℃保温。反应产物用4％-5％琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后紫外灯下观察。FLN2基因的精细定位：选取st10与培矮64s组合的F2群体中共2885株隐性个体，在初定位的基础上进一步设计SSR和STS标记，最终将FLN2精确定位于精确定位于BAC号为OJ1519_A12上48-kb范围之内，两边的分子标记为STR11与STR12引物序列为：STR11：F：GGAAGTAGCCCTGTCTCAAA，R：CCTTGAACCTGTGCTCCT；STR12：F：GGTTACATCTCCTTTTCGTT，R：CTTTGTTTGCTGCCATCT；备注说明：如图3所示，引物序列见表1。表1、FLN2基因的定位标记序列MarkePrimers(5’to3’)SenseAnti-senseCHL-8GTTTTACCGATGGTTGATGATCGTGGATGCCTTTGGAGSTR6GCGAGTGTCTTCGTTTGTTGACTTGTTCCACTCCACTCTSTR11GGAAGTAGCCCTGTCTCAAACCTTGAACCTGTGCTCCTSTR12GGTTACATCTCCTTTTCGTTCTTTGTTTGCTGCCATCTSTR15GTCGCCCTCTCCTCCGCGTCGTTGTAGTGGCTCTGTSTR16TCTAAAAGTGGATGACAAGGGCCACGGCTAATGTTGTTTSTR17TTTTCGTTAGCATCACTTTGGCACACATTTCAAGATTCAASTR19TCCATTGTCAAAAGGTAGGTATTTGGTGAGTGGGATGSTR20GCCACTTTCAATCTTATGCAAATGTGAACCCGGACTASTR21AGGCAGAGGAAGAAGGAGTTTTTGGTGGACTGGAAGSTR22CTTCTTCCGCCATTGTCTGTTTTGTTTGGCTTGCTGSTR24GGACTAAGGAGCAACAGCCCCCAACAACACCTACCACAT备注说明：CHL8，STR6，STR20，STR15，STR16和STR17是初定位所用的标记，STR19，STR11，STR21，STR12，STR22和STR24是精细定位中所用标记。4、基因预测和比较分析：根据精细定位的结果，在48-kb范围内根据RiceAutomatedAnnotationSystem(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内共有7个候选基因。根据两标记剩余的重组个体数，我们设计了各基因的测序引物，采用PCR方法分别从st10和野生型品种基因组中扩增出候选基因进行测序分析。发现st10突变体在LOC_Os03g40550的第5个外显子处发生1个碱基的替换突变，由G突变为A，使蛋白翻译提前终止。将此用不同的突变单株及群体中突变表型的单株，各重复验证三次，突变位点稳定存在(测序引物序列见表2)。根据BAC克隆OJ1519_A12序列的基因注释信息(NCBI)，预测此基因编码pfkB家族中的果糖激酶，因此我们将该基因命名为果糖激酶类似蛋白编码基因(Fructokinase-likeprotein2)FLN2，该基因全长4534bp，包含5个外显子和4个内含子。该基因FLN2的cDNA序列如SEQIDNo：1所示，gDNA序列如SEQIDNo：2所示。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo：3所示。表2、FLN2基因的测序引物序列实施例2：1.植物转化：以粳稻品种“日本晴”基因组为模板，根据目的基因设计引物F-5’-aaggtaccTGGCCCATATCTTAGCAGCTT-3’和R-5’-cctctagaGTATGGCCAGTTGACCACGA-3’，PCR扩增体系为：50μL的PCR反应体系：模板DNA(0.2μg/μL)2μL；2×PCRbuffer25μL；2mmoldNTP(罗氏)10μL；KODFX(TOYOBO)酶(1U/μL)1μL；10μMPrimerF3μL；10μMPrimerR3μL；ddH2O6μL；PCR扩增条件为：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸8min；共35个循环；68℃下延伸10min，15℃保温。PCR扩增后进行电泳分离，回收得到7354bp的DNA片段，用KpnI和XbaI双酶切目的片段和pCAMBIA1300(p1300)后进行连接，获得了互补载体pCAMBIA1300-FLN2，该克隆覆盖了整个ORF的基因组区域(即包含了SEQIDNo：2所示的核苷酸序列)，还包括ATG上游2029-bp启动子序列和TGA下游1208-bp终止子序列(如图4所示)。这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用突变体成熟种子诱导愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有300mg/L潮霉素的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤(即在抗性培养基上可以重生的愈伤)在含有250mg/L潮霉素预分化培养基上，光照、25℃培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照，25℃条件下培养至分化出苗，一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察发现，与同时期的突变体比较，转基因植株叶色恢复为正常绿色，与转入空载p1300的日本晴表型一致。备注说明：上文中的目的片段是指覆盖了整个ORF的基因组区域(即包含了SEQIDNo：2所示的核苷酸序列)，及ATG上游2029-bp启动子序列和TGA下游1208-bp终止子序列。上文中所涉及的各种培养基的配方可参考TokiS.,HaraN.,OnoK.,OnoderaH.,TagiriA.,OkaS.,TanakaH.(2006)EarlyinfectionofscutellumtissuewithAgrobacteriumallowshigh‐speedtransformationofrice.ThePlantJournal47:969-976。通过上述转基因技术，结果表明：本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)。即，所述转基因水稻的叶片颜色得到改良。2.水稻亚细胞定位载体的构建根据FLN2cDNA(即包含了SEQIDNo：1所示的核苷酸序列)序列设计引物，40550cds-221F:gcggatccATGCACCGAATGGCTTCTCTTC，40550cds-221R:caaagcttCTCCACATATAAAAGCTCACTC，以NIPcDNA为模板进行扩增，用BamHI和HindIII双酶切目的片段和pBI221-GFP载体后进行连接，获得了亚细胞定位载体pBI221FLN2(如图6A所示)。3.水稻原生质体的转化及FLN2绿色荧光融合蛋白的定位观察:(1)生长15天左右的水稻(NIP)幼苗用锋利的刀片在塑料培养皿板上切碎幼苗茎叶，移到200ml洗净的锥形瓶中(一般20ml酶解液每次60株左右；预先将酶解液倒入瓶中，根据瓶底大小合理分配酶解液)，每瓶不宜装太多。放入28℃摇床，60-80rpm,4-6小时。(2)在酶解时间完成之前，配置PEG400040％溶液，置于65°水浴锅中或室温溶解，65°溶解时，中间取出来振荡一次。(3)酶解完成后，先向酶解完成的瓶中加入约15ml左右的W5溶液。用300目(或400目)的钢制滤网将碎叶片过滤掉，用干净的塑料培养皿收集酶解后的原生质体。然后将原生质体缓慢倒入(或用去枪尖的枪头吸取)50ml离心管中，天平称重平衡后，放入水平离心机，150g，5min，充分收集原生质体。离心完成后，缓慢吸走上清。(4)向原生质体沉淀中加入1mlW5溶液，缓慢轻轻倾斜混匀重悬，然后用去枪尖的枪头吸移到2ml离心管中。此时50ml离心管中可能还有少量未重悬的原生质体，可再加入1mlW5溶解，吸移到之前的2ml离心管中，150g，3min，移除上清液。(5)用MMG重悬，具体加多少根据原生质体的量和要转的质粒个数来定，一般最后每个质粒中加入100ul稀释的原生质体(上述步骤3所得)。或者用显微镜稍微观察下产量和酶解后完整个体的数目比例，然后根据原生质体的状态来确定MMG用量。(6)准备转化用质粒10-15ug左右或10ul，于2ml离心管中。即，“p35s::GFP”和“p35s::FLN2::GFP”这两个质粒分别被转入了原生质体。(7)加入100ul的重悬好的原生质体，然后加入PEG40％110ul，混匀。(8)28℃避光静置15min。(9)加入足量(即5倍体积的原生质体)的W5稀释，混匀，然后离心150g，3min，,缓慢移除上清，再用W5洗一次(中间会有损失，但不影响结果)。最后得到的沉淀，用W5重悬(用2ml的管子装满)，轻轻混匀，移到细胞培养板中。用锡箔纸包裹，避光28℃静置培养，14小时。(10)培养时间完成后，将培养板各孔中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸移到2ml管中，然后离心150g，3min，去除上清，保留100ul左右上清液，重悬原生质体。(11)共聚焦显微镜观察拍照。结果显示阳性对照在细胞各个部位均有表达，说明实验的表达系统工作正常，FLN2GFP融合蛋白特异的在叶绿体中表达，其他部位未见表达，说明FLN2是定位于叶绿体中的蛋白(图6B)。图6B中“p35s::GFP”对应的是“p35s::GFP”转入原生质体后拍的照片，即阳性对照；“p35s::FLN2::GFP”对应的是“p35s::FLN2::GFP”转入原生质体后拍的照片，即FLN2的细胞定位结果。备注说明：上文中所涉及的各种溶液的配方可参考Zhangetal.Ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransientgeneexpressionandstudyinglightchloroplast-relatedprocesses.PlantMethods2011,7:30.4.光合色素含量测定：在光照培养箱(Panasonic,MLR-352H-PC)中按照如下条件分高低温暗培养NIP和突变体至二叶期：高温32℃10小时，30℃14小时；低温24℃10小时，20℃14小时；然后转光照，培养条件如下：高温32℃10小时光照，30℃14小时黑暗；高温24℃10小时光照，20℃14小时黑暗；光照强度均为200μmol/m2.s，培养至四叶期，分别取突变体和野生型第四叶去掉主脉，剪成1cm左右的片段，称取0.2g浸泡于10ml80％丙酮，26℃条件下暗培养48小时。取溶液在紫外分光光度计(DU800,BECKMANCOULTER)663nm、645nm和470nm三种波长下测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的光密度值。3次重复，然后根据Amon(1949)的方法计算出各检测叶片中的叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)的含量,按照Wellburn(1994)计算类胡萝卜素(Car)的含量，计算公式如下：chla＝(12.7×OD663－2.69×OD645)×V/Wchlb＝(22.9×OD645－4.68×OD663)×V/Wcar＝(1000×OD470×V/W－3.27×Chla－104×Chlb)/198其中：V为提取液体积(10ml)，W为叶片质量0.2g，OD663、OD645及OD470为在分光 光度仪上读取的光密度值，单位：mg/g。结果显示，低温条件下培养的突变体与NIP相比，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、类胡萝卜素的含量及叶绿素a/b的比值均略有减少，但总体来说变化不大(图7A),；而高温条件下培养的突变体与NIP相比，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b及类胡萝卜素的含量均明显减少，叶绿素a/b的比值却略有增加(图7B)，这些结果说明突变体st10d的白化表型是由于叶绿素和类胡萝卜素缺失引起的，而且与环境温度相关，高温条件会延迟突变体复绿。5.叶绿体透射电镜的制备和观察:(1)样品:前质体取样：30℃12小时，24℃12小时，避光条件下培养突变体和NIP至二叶期，取突变体和对照NIP叶片，切成0.5～1mm3左右的小块；叶绿体取样：30℃12小时，24℃12小时，光照条件下培养突变体和NIP至二叶期，取突变体和对照NIP叶片，切成0.5～1mm3左右的小块；(2)固定：将切好的样品块放入2ml离心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1M磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％锇酸固定2～3小时，直至样品变黑；(3)脱水：先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟，再用乙醇和丙酮(1：1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮室温处理20分钟；(4)渗透：将样品在无水丙酮和包埋剂(3：1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮和包埋剂(1：1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；(5)包埋：将上述步骤中的样品挑的包埋盒内，37℃过夜，45℃处理12小时最后60℃处理24小时，获得包埋样品；(6)切片、拍照：将包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用HitachiH-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。结果显示NIP的前质体发育饱满，排列规则，而st10前质体发育明显受到抑制，数量大幅减少，形状畸形(图8A)；对叶绿体的观察结果显示，野生型叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中基粒片层排列整齐，紧密，而突变体叶片中几乎看不到完整的叶绿体结构，极个别的叶绿体其内部结构紊乱，根本无法辨别基粒片层的排列(图8B)。这些结果表明FLN2基因的突变造成突变体中叶绿体数目的减少和结构的破坏。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。<110>中国水稻研究所<120>水稻质体发育调控基因FLN2及其用途<160>3<210>1<211>1770<212>cDNA<213>水稻（Oryzasativa）<400>1atgcaccgaatggcttctcttcttctccccccgcagtttctttgctccctgccttgtagt60accaactcaatcaggagccatttacattataagccccacttcttgggaaacattatgact120aagcctaaagctaaaatgaggctgctcaaccgaaacgtaagttccatggcaaagaagagc180tctcaagatgtagcagaaggttcaagtgatgatgagagtgacggcgagacatcaaaaacc240aagaaaagagctccgagacgtggaagaaagaaagccaccatacaagcatcagaaggggaa300acacaagaaggtcaagtgagcactgaagaagatgaatcccctgaagggactaagaaaata360aaaaggaggggccgcaagaaagctgcaactactgcaagctcatcggaagagaaggacaaa420gcaaaagaaccaaagaagaggggcagaagaaaagttaagactgtagaggaattgagtgac480aatgaaggggaagatctgggtgaagatctagtgccctccaatgacaggcaggagaaaatt540tcagcaaatgacctagaaagtaaaatagcagcattgctattagaagatactgatgataat600gatattaacaatttaatccctcttgtgtgctgctttgggcctgctaagtactcatttatt660ccttctggaagacctgctaataggctgatagatcatgaaattcatgagggaatgaaagac720atgttctggtctccagatcaatttgtaagggcaccaggaggatcatcatccaatgttgct780cttgctttagcagcttctggtggccgggttgaattcatgggaaaactaggcgatgatgat840tatggtcaaagtacattatatcacttgaacgtcaatggagttcaaactcgggcaattaaa900atggacccttcagcgtttactgccatgtccttgatgaaggtcacaggtaggggtagcttg960aaaatgagctgtgctaaaccttgtgcagaggattgttttgtccaaactgatatcaaccca1020gctgttttaaaagaggctaagatgttttactacaattcttcagctttgcttgagcccacg1080acacgatcatcattgtcgaaagcaattgaggtttccaagaaatttggtggtgtaacattc1140tttgatctcaatcttccactgccattatggtcgtccagtaaggagaccaagtcacttgtc1200aaggaagcatgggaagctgctgatattattgaaatcactaagcaggaacttgagttcttg1260tgtggcattaaaccatctgagaaatttggtacgaaggataatgataaatccaaattcact1320cactacagcccagaagttgttacgaaattgtggcatgaaaatctcaaggtcctttttgtg1380acaaacggcacttctaagattcattattacacaaaagagcatgatggctgggttcgtggc1440acagaagatgcaccaattactcctttcaccggtgacatgtcacaatcaggtgacgccatt1500gttgcagctctgatgaagatgctggcaattaaccctcacctggtcactgacaaggattac1560ttgcatactgcaatgaaacatgctattacatgtggtgtcattgaccagtggttacttgca1620cgagaacgagggttccttcccagagaaagagcagatccaaccagtgaacagtttggagtg1680agattcgtcacagagaaggaataccgtacacttcctgattccatacatacagaggattca1740tcagagagtgagcttttatatgtggagtga1770<210>2<211>4534<212>gDNA<213>水稻（Oryzasativa）<400>2ctgctcagctctgagcttcttcgtttgagggattttcttctcccgggaggcggaagaggc60gtaggcgaggattcttgtaggaatcctctcctctccattgatgcaccgaatggcttctct120tcttctccccccgcagtttctttgctccctgccttgtagtaccaactcaatcaggtatgt180aatgcttcatttttctgtgtaatgcagcttcttcttcttcttcttctggtagtagctgat240atgagtgcgtgtggcgatctctttcggattgtttgagtcgccaccatatggatcctaggt300tagggaagggaaaggagcagcacatggagtggagattgtggcatctttctttggtcccaa360atttccaatagatcttgggtctatgttttgtttcattttttgataacaactatttgattc420ttacaagatgaacaatatgtcatcaaattgtgatgtgtactcgatgaaatatatatatat480accgcttgtacctagccttgtctgaatatgctcccacgtggtatggtagcagcttcatat540ttgaatcgtgtgataacattagttctatcttacattcacttattctttattttttaacac600atcactacttacattatggtttaaattccaacagttattagtgacttgcttccgatgtgt660aatgtgcaggagccatttacattataagccccacttcttgggaaacattatgactaagcc720taaagctaaaatgaggctgctcaaccgaaacgtaagttccatggcaaagaagagctctca780agatgtagcagaaggttcaagtgatgatgagagtgacggcgagacatcaaaaaccaagaa840aagagctccgagacgtggaagaaagaaagccaccatacaagcatcagaaggggaaacaca900agaaggtcaagtgagcactgaagaagatgaatcccctgaagggactaagaaaataaaaag960gaggggccgcaagaaaggtacatcttgcttgcatattttcagtagagtacttccttcaat1020aacttaagaaaaaaattatcgtaaacccttagcaagtcatgacttctctcctatgttgca1080gctgcaactactgcaagctcatcggaagagaaggacaaagcaaaagaaccaaagaagagg1140ggcagaagaaaagttaagactgtagaggaattgagtgacaatgaaggggaagatctgggt1200gaagatctagtgccctccaatgacaggcaggagaaaatttcagcaaatgacctagaaagt1260aaaatagcagcattgctattagaagatactgatgataatgatattaacaatttaatccct1320cttgtgtgctgctttgggcctgctaagtactcatttattccttctggaagacctgctaat1380aggctgatagatcatgaaattcatgagggaatgaaagacatgttctggtctccagatcaa1440tttgtaagggcaccaggaggatcatcatccaatgttgctcttgctttagcagcttctggt1500ggccgggttgaattcatgggaaaactaggcgatgatgattatggtcaaagtacattatat1560cacttgaacgtcaatggagttcaaactcgggcaattaaaatggacccttcagcgtttact1620gccatgtccttgatgaaggtcacaggtaggggtagcttgaaaatgagctgtgctaaacct1680tgtgcagaggattgttttgtccaaactgatatcaacccagctgttttaaaagaggtaaag1740acgagtacatcaaacaatattttgattacaccttatcctctacaatattatctattacta1800catggtttaatgataaactgtatgcacacttgattggtcttgagaaaagtttgtttgtgc1860catgcacattgtggcaacaataaattgtttaaatgttcacatggtaaagttattttacta1920tgctgacctatcattatgttgtggtgcattttcttttgtcagagatgattagttaatgaa1980agagtactacacggatcagaagatttgtatgtcacacattgttttgttagttataattaa2040tctggtatggaaattttaccacataaaagcaaattttgttgaataattctgttccttata2100cagttagaaagattctatttttctttatcacaagaagagcttgctaaagtgaagaagttg2160ctttcagctgatggcatattatactgtttagatgtgcaattcataattcagttgcaacat2220tgtttgcaatacagaagtcattatatttatatcaaaagacttaaggaacaactagggcta2280tactgctaaattaatgtacttgtccaaaaagataataagaggaaattactcaactcgatt2340tctatcaattcaaacttgctatctattagttgaccatgaatgtgtcaaaatgatactatg2400tactataaacaaatgggaggtttacctgttttcattgccgtgctttggtaggttcagaaa2460aagaagtaaataaaacactttcagttcacaactgtgctttttctacatgtttgcacttag2520catggttattttttagtcagaagacacataaacctgtaccataatgatcttaattttttg2580taaaaaaccttttagcagttagggcactacaagctgctctgtactggaacttgttggata2640atatctttgctaatgctgaatgtctgaaaattcccaaactcaaaataatatgaacattaa2700aaagcaactacttaaaatattaggtccctatgggcaggccatatctgaaattaggtaa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