专利名称：一种高纯度木瓜蛋白酶的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种高纯度木瓜蛋白酶的提取方法，属于生物技术领域。
背景技术：
木瓜蛋白酶(Papain)简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木 瓜(Carica papaya)果实中的乳汁，采用现代生物工程:忮术^t是炼而成的纯天然 生物酶制品。由于木瓜蛋白酶具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全及使用 简便等特点，可广泛应用于食品、医药、日化、饲料、皮革及纺织等行业。
随着木瓜蛋白酶应用的不断开发，对木瓜蛋白酶的纯度要求也越来越高。传 统的萃取分离技术所提取的木瓜蛋白酶的纯度，已经不能满足工业上的要求， 特别是对于医药行业，含杂质的木瓜蛋白酶会对人体引起过敏反应。
研究发现双水相萃取具有两相界而张力低，有助于保持生物活性和强化相际 间的质量传递、易于连续化操作等优点，因而其在木瓜蛋白酶的制备中占有一 席之地，但这方面的报道非常有限。1990年，国外的学者进行了初步的探索。 因此迫切需要特异性更大的制备木瓜蛋白酶的方法，开发新型的亲和双水相萃 取技术，作为有效的高纯度木瓜蛋白酶的分离提取方法，是很有意义的。
但是双水相萃取4喿作过程中，对溶液的PH值及两相的质量分数比要求非常 高，因此准确的确定两相物质的质量分数比，变成一项关键的技术。这关系到 能否成功的提纯木瓜蛋白酶。国内外对此技术的报道非常有限，没有参考的先 例，只能依靠不断的尝试来确定最佳的质量比。
在现有的木瓜蛋白酶的提纯工艺中， 一般采用通过PP膜、聚砜膜、聚醚砜 膜、中空纤维膜等膜材料进行分离层析。在高温下割收木瓜并在高温下长时间停留，褐变厉害，酶活性破坏大；野外 割收卫生条件极差，乳汁收集难，回收率低。传统的分级沉淀、盐析等方法提 取成本高，产量低，搡作较繁瑣，而且经割采乳汁后的番木瓜果实未能得到充 分的利用，从而造成浪费。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提取高纯度木瓜蛋白酶的高效 萃取技术，将番木瓜的果实及乳汁充分利用，快速分离出粗酶，提高酶活回收 率，并利用双水相萃取技术提高酶的纯度，将其运用到实际生产过程中。
为了解决以上技术问题，本发明所采取的技术方案是粗酶提取过程中使用 Sephadex G100凝胶层析，进行粗酶的分离，此种方法可省去反复沉淀的步骤， 使活力回收大大提高。精酶提取过程中使用双水相萃取，提纯精酶，此操作具 有目标产物有较高的收率，不存在有机溶剂残留，分离过程经济的优点。
本发明的有益效果是，采用超声波粉粹技术、S印hadex G100凝胶层析技术 及双水相萃取技术对木瓜蛋白酶的活性影响最小，所得到的木瓜蛋白酶产品活 性高，生产的木瓜蛋白酶的活力超过350万单位/克，酶回收率高达90°/。以上且 纯度高。
具体实施例方式
(一)木瓜蛋白酶的提取方法及步骤
1、 超声波粉碎
选择新鲜的番木瓜，清洗去皮、籽、鉱后，切块破碎，称取果肉，加入一定 量的蒸馏水进行打浆，配成浆溶液；用超声波处理果浆，离心；除杂过滤后，进 行超滤浓缩，制得酶液。整个过程中料液的温度尽量控制在2-3。C的低温状态。
2、 层析(粗酶)
将酶液取出进行自然风干处理。称取一定量的木瓜粉，加入吸附剂，充分研磨，加入蒸镏水，用G5熔砂-漏斗抽滤，得到的滤液用S印hadexG100层析柱进 行分离，收集酶液，再进行喷雾干燥即可获得粗酶成品。 3、双水相萃取(精酶)
将粗酶提取过程中获得的酶液与番木瓜乳汁混合，调成PH为5.7,采用双水 相萃取，再进行分离、洗脱、烘干，即可获得精酶成品。双水相体系的形成主 要是由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗 透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。 一般 认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎 水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。是依据物质在两相间的选择性分配。 当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和
各种力(如憎水键、氢键和离子键)等的存在和环境因素的影响，使其在上、下 相中的浓度不同。
将确定好的双水相物质调整好PH值后，加入到木瓜乳液中，混合离心，洗 脱后，用以测量其活力与纯度。
(二)木瓜蛋白酶酶活力及纯度测定
1、 木瓜蛋白酶酶活力测定
在每支试管中加入250酪蛋白(1. O/ml), 37。C保温IO分钟，各试管中加入 适量的酶，37。C精确保温10分钟，之后加入5ml考马斯亮蓝溶液(100mg考马 斯亮蓝、50ml 95%乙醇、100ml 85%磷酸，定容至1000ml )混匀，室温放置20 分钟，测595加i的光吸收，对照蛋白浓度标准曲线查处相应的蛋白浓度，并计算 酶活力(取平均值)。 一个酶活力单位定义为37C, l分钟内水解lmg酪蛋白所需 酶量。
2、 木瓜蛋白酶纯度测定
FPLC中的离子交换层析可计算木瓜的蛋白的纯度。25个微升的纯化木瓜蛋 白酶(25G蛋白)在PH为10. 6的20mM甘氨酸-氢氧化钠緩冲区緩冲。木瓜蛋白 酶和其他蛋白随后洗脱后，使用编程线性梯度氯化钠从0至0. 5米(总量为24毫
5升)在液相色谱中的流速为1. Oml/分钟。记录色谱小块A280和梯度组成与洗脱 量，洗百分比的高峰地区的木瓜蛋白酶和其他蛋白质是从一个自动集成，木瓜 蛋白酶的纯度为指定的百分比峰面积木瓜蛋白酶对总峰面积。以此测定方法测 定用本发明方法提取的木瓜蛋白酶其纯度是99.63%,比现有技术提取的木瓜蛋 白酶纯度提高0. 32%。
权利要求
1、一种高纯度木瓜蛋白酶的提取方法，其特征在于其工艺步骤中所采用的工艺方法为(1)粗酶提取过程中使用Sephadex G100凝胶层析，进行粗酶的分离；(2)精酶提取过程中使用双水相萃取，提纯精酶。
全文摘要
本发明涉及一种高纯度木瓜蛋白酶的提取方法，将番木瓜的果实及乳汁充分利用，快速分离出粗酶，提高酶活回收率，并利用双水相萃取技术提高酶的纯度，为此在粗酶提取过程中使用Sephadex G100凝胶层析，进行粗酶的分离，此种方法可省去反复沉淀的步骤，使活力回收大大提高。精酶提取过程中使用双水相萃取，提纯精酶，此操作具有目标产物有较高的收率，不存在有机溶剂残留，分离过程经济，对木瓜蛋白酶的活性影响最小，所得到的木瓜蛋白酶产品活性高，酶回收率高，纯度高。
文档编号C12N9/50GK101560508SQ20091014353
公开日2009年10月21日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者羌利民 申请人:南通远大生物科技发展有限公司