木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂制备方法及用途与流程

本发明属于医药技术领域或化妆品技术领域，涉及木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂的制备方法。

背景技术：

瘢痕是各种创伤后所引起的正常皮肤组织的外观形态和组织病理学改变的统称。病理上表现为成纤维细胞的过度增殖和以胶原为主的细胞外基质成分的过度沉积，并伴有胶原组织结构排列紊乱，影响外观和功能，其严重影响患者的身心健康和生活质量。现阶段临床上对瘢痕的常用治疗手段主要有手术切除、磨削、激光照射、放射性照射、液氮冷冻、加压疗法、药物治疗等，不管是单一的手术或者非手术治疗还是多种方法联合治疗，结果都不是很理想。

大量杂乱排列的过剩的间质胶原的病理特点，是异常瘢痕增宽隆起、弹性下降、质地坚实的临床特点的基础。因此，可以认为促使过度增生的瘢痕组织内胶原有效降解是治疗的关键之一。木瓜蛋白酶具有溶胶原活性，目前木瓜蛋白酶在医药方面的应用有：①清除挫伤、切伤、烫伤等各种皮肤表面的溃疡，而对健康组织无影响。[starleyif，mohammedp，schneiderg，etal.thetreatmentofpaediatricburnsusingtopicalpapaya.burns，1999，25(7)：636-639.]②治疗腰椎间盘突出症，已有60余万患者接受了chymopapain溶核技术，疗效良好。[hooglandt，schubertm，miklitzb，etal.transforaminalposterolateralendoscopicdiscectomywithorwithoutthecombinationofalow-dosechymopapain：aprospectiverandomizedstudyin280consecutivecases.spine，2006，31(24)：890-897.]③降解生物毒液中的蛋白毒素，是澳大利亚急救药stopitch中的主要成分。这些应用均是基于木瓜蛋白酶可水解蛋白或胶原的活性。

脂质体是将药物包封于类脂双分子层形成的薄膜中间所制成的超微型球状载体制剂。由于脂质体有许多皮肤局部用药的优点，目前已开发出不少脂质体经皮给药制剂。木瓜蛋白酶分子量较大(2.3kd)，难以透过皮肤角质层；且瘢痕组织相对正常皮肤结构致密，更增加了透皮难度。为促进其透皮吸收，采用柔性脂质体来包封木瓜蛋白酶。柔性脂质体由于自身特有的柔性可产生很大程度的变形，顺利通过比它小的多的皮肤微孔，从而促进药物透皮吸收。

本发明给出了一种木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂，在脂质体中加入膜软化剂，使其具有变形能力而易于透过皮肤；以凝胶作为赋形剂，使其具有一定的黏度和触变性，使用方便。

技术实现要素：

本发明提供了一种木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂。

本发明提供了一种木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂的制备方法。

本发明提供的木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂，主要用于皮肤创伤及瘢痕的修复作用。

本发明是通过如下方式实现的：木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂包含木瓜蛋白酶、膜材、膜稳定剂、膜软化剂、凝胶基质，其中木瓜蛋白酶为活性成分。

本发明所述的木瓜蛋白酶为市售或通过常规方法制备得到，活力不低于6000u，在总凝胶剂中所占的重量百分比为0.2％-2％。

本发明所述的膜材，其特征在于为大豆磷脂或蛋黄卵磷脂中的一种。膜材在总凝胶剂中所占的重量百分比为1％-3％。

本发明所述的膜稳定剂，其特征在于为胆固醇和维生素e，胆固醇主要起到调节磷脂双分子层流动性的作用，嵌入到脂质膜中增强了膜的刚性和致密度，水合过程中提高了脂质体膜的稳定性；维生素e可降低磷脂氧化水平，增加脂质体的稳定性。胆固醇在总凝胶剂中所占的重量百分比为0.2％-1％，维生素e在总凝胶剂中所占的重量百分比为0.05％-0.2％。

本发明所述的膜软化剂，其特征在于可使脂质体膜具有高度的变形能力，使其携带物易于透过皮肤，可选用胆酸钠、脱氧胆酸钠或吐温-80中的一种。膜软化剂在总凝胶剂中所占的重量百分比为0.1％-0.5％。

本发明所述的凝胶基质，包含凝胶材料、分散介质、ph调节剂。其特征在于凝胶基质成分在总凝胶剂中所占的重量百分比，其中凝胶材料为0.5％-5％、分散介质适量、ph调节剂适量。

本发明所述凝胶材料选自卡波姆940或部分中和的聚丙烯酸钠np-800中的一种。分散介质包括丙三醇和磷酸盐缓冲溶液。ph调节剂选自三乙醇胺或氢氧化钠，能将凝胶剂的ph值调整至6-8，若用np-800不需要调节ph。

本发明所述木瓜蛋白酶脂质体，通过下述方法制备：①逆向蒸发法：称取处方量膜材和膜稳定剂，溶于乙醚中得到类脂溶液；称取处方量木瓜蛋白酶和膜软化剂，溶于磷酸盐缓冲液中；将两者的混合液在冰浴中超声得稳定的w/o乳液；减压旋蒸除去有机溶剂，达到胶态，加入磷酸盐缓冲液水合，冰浴中探头超声即得脂质体。②乙醇注入法：称取处方量膜材和膜稳定剂，溶于无水乙醇得到类脂溶液；称取处方量木瓜蛋白酶和膜软化剂，溶于磷酸盐缓冲液中；将类脂溶液注入磷酸盐缓冲液中，水合，形成脂质体混悬液；将上述脂质体混悬液于减压旋蒸至无醇味；冰浴中探头超声即得脂质体。③薄膜分散法：称取处方量膜材和膜稳定剂，溶于氯仿中得到类脂溶液，减压旋蒸除去有机溶剂，形成均匀薄膜；称取处方量木瓜蛋白酶和膜软化剂，溶于磷酸盐缓冲液中；将磷酸盐溶液加入上述均匀薄膜中，水合；冰浴中探头超声，即得脂质体。

本发明所述的木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂，通过下述方法制备：将木瓜蛋白酶脂质体凝胶加入到空白凝胶剂中，搅拌均匀，即得木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂。

本发明所述的木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂，其特征在于该凝胶剂主要用于皮肤创伤及瘢痕的修复作 用。

附图说明

图1为实施例1制备的木瓜蛋白酶脂质体的透射电镜图。

图2为实施例1制备的木瓜蛋白酶脂质体的粒度分布图。

具体实施方式

以下是结合实施例对本发明做进一步说明，本发明不限于实施例。

实施例1

逆向蒸发法制备木瓜蛋白酶脂质体：称取大豆磷脂200mg、胆固醇40mg和ve10mg，溶于12ml乙醚中得到类脂溶液；称取木瓜蛋白酶80mg、吐温-8020mg，溶于4ml磷酸盐缓冲液中；将木瓜蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液加入类脂溶液中，将两者的混合液在冰浴中超声10min(1s/1s)得稳定的w/o乳液。在40℃减压旋蒸除去有机溶剂，达到胶态，加入10ml磷酸盐缓冲液中，继续旋转蒸发水合30min，冰浴中探头超声5min(280w，1s/1s)，即得脂质体。

取np-800100mg，加丙三醇1g润湿分散，加磷酸盐缓冲溶液溶胀过夜，搅拌均匀形成重量为10g的空白凝胶剂。

将制备好的木瓜蛋白酶脂质体加入到空白凝胶剂中，继续搅拌均匀，即得木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂。

实施例2

乙醇注入法制备木瓜蛋白酶脂质体：称取大豆磷脂200mg、胆固醇40mg和ve10mg溶于10ml无水乙醇得到类脂溶液；称取木瓜蛋白酶80mg、胆酸钠20mg，溶于10ml磷酸盐缓冲液中；将膜材注入恒温于60℃的磷酸盐缓冲液中，保温30min，形成脂质体混悬液；将上述脂质体混悬液于40℃减压旋蒸至无醇味；冰浴中探头超声5min(280w，1s/1s)，即得脂质体。

取卡波姆940200mg，加丙三醇1g润湿分散，加磷酸盐缓冲溶液溶胀过夜，用三乙醇胺调制ph6.5，搅拌均匀形成重量为10g的空白凝胶剂。

将制备好的木瓜蛋白酶脂质体加入到空白凝胶剂中，继续搅拌均匀，即得木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂。

实施例3

薄膜分散法制备木瓜蛋白酶脂质体：称取蛋黄卵磷脂200mg、胆固醇40mg和ve10mg溶于10ml氯仿中得到类脂溶液，在40℃减压旋蒸除去有机溶剂，形成均匀薄膜；称取木瓜蛋白酶80mg、脱氧胆酸钠20mg，溶于10ml磷酸盐缓冲液中；将磷酸盐溶液加入上述均匀薄膜中，40℃旋转蒸发水合30min， 冰浴中探头超声5min(280w，1s/1s)，即得脂质体。

取卡波姆940200mg，加丙三醇1g润湿分散，加磷酸盐缓冲溶液溶胀过夜，用三乙醇胺调制ph6.5，搅拌均匀形成重量为10g的空白凝胶剂。

将制备好的木瓜蛋白酶脂质体加入到空白凝胶剂中，继续搅拌均匀，即得木瓜蛋白酶脂质体凝胶剂。

实施例4木瓜蛋白酶脂质体形态观察

脂质体用超纯水稀释，滴至铜网表面，用滤纸除去过量的样品后，自然挥干。以2％磷钨酸水溶液进行负染，室温下放置，待干燥后用透射电子显微镜进行观察。脂质体为圆球状的囊泡，外观圆整规则，大小均匀。

实施例5木瓜蛋白酶脂质体粒径和粒度分布

采用激光粒径分析仪测定脂质体的粒径及其分布范围，测定温度25℃，吸取脂质体样品，用超纯水稀释10倍。每个样品测定经过至少10次运行。水的粘度(0.8872mpa·s)和折光指数(1.33)作为样品的测定参考。脂质体的平均粒径分布和多分散性指数自动由设备累积分析给出。结果实施例1、2、3制备的脂质体粒径分别为109±1.8nm、117±2.2nm、95±1.5nm、，多分散系数分别为0.2037±0.0005、0.2140±0.0102、0.2731±0.006。脂质体粒径小，粒度分布均匀，分散性好，粒径呈正态分布。

实施例6木瓜蛋白酶脂质体变形性测定

将脂质体用超纯水稀释10倍，在40℃下，以0.5mpa的压力，用50nm的聚碳酸酯膜挤出，记录5min内挤出的体积。挤出后立即测定挤出后的平均粒径，根据挤出前后粒径与体积计算其变形性。评价指标：①变形指数d公式：d＝j(rv/rp)²，其中d表示传递双分子层的变形指数，j为5分钟挤出的混悬液的体积，rv为柔性脂质体挤出后的粒径，rp为聚碳酯膜的孔径。②根据方法①的校正方法dcor公式：dcor＝[(j(rv/rp)2)/(jo(rvo/rp)2)]×100％，基于此公式进行校正。其中j0为挤出实验制备的柔性脂质体混悬液的体积，rv0为柔性脂质体挤出前的粒径。③根据挤出前后粒径的变化评价变形性％deformability＝(挤出前柔性脂质体的粒径-挤出后柔性脂质体的粒径)/挤出前柔性脂质体的粒径×100％。结果实施例1、2、3制备的脂质体评价指数d分别为11.91、2.34、1.29，评价指数dcor为分别为0.4712、0.0892、0.0479，评价指数％deformability分别为0.2682、0.1585、0.2702。

实施例7木瓜蛋白酶脂质体包封率测定

采用紫外分光光度法测定木瓜蛋白酶含量。精密适量吸取木瓜蛋白酶样品贮备液(10mg/ml)，以超纯水稀释，制备为0.5，0.8，1.0，2.0，4.0mg/ml的系列对照品溶液，用紫外分光光度计在其最大吸收峰276nm处分别测定它们的吸光度，将吸光度y与标准溶液浓度x进行线性回归分析，得到木瓜蛋白酶的线性回归方程为y＝0.18506x+0.00251(r²＝0.9993)，表明木瓜蛋白酶在0.50-4.0mg/ml范围内线性 良好。

采用超滤离心法分离脂质体与游离药物，紫外分光光度法测定木瓜蛋白酶含量。精密吸取3ml脂质体混悬液于4ml超滤管(100kd)中，8000r/min离心40min。取下层超滤液测吸光度，参照对应的标准曲线计算出游离的木瓜蛋白酶的含量w2，木瓜蛋白酶总量为w1，包封率按下列公式计算：ee％＝(1-w2/w1)×100％。结果实施例1、2、3制备的脂质体包封率分别为41.3±2.6％、37.2±1.8％和21.4±2.3％。