本发明属于微生物的酶失活领域，具体涉及一种耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活方法。此外，本发明还涉及一种原料乳的处理方法，以及经该方法处理后得到的原料乳。
背景技术：
假单胞菌是原料乳中常见的占主导地位的耐冷菌群。耐冷假单胞菌能在原料乳冷藏过程中分泌耐热蛋白酶，这种蛋白酶难以通过高温加热的方式加以灭活，其耐热的机理是：经过高温处理后，未被破坏的处于非折叠状态的蛋白酶分子(无活性)重新折叠成有活性的天然构象。因此这类酶能够耐受巴氏灭菌(72℃/15s)或超高温(120～150℃/0.5～8.0s)灭菌工艺，无法通过单一的热处理完全灭活。
耐热蛋白酶主要通过降解酪蛋白引起原料乳物理化学性质发生明显变化，包括原料乳沉积，Zeta电势和酪蛋白胶束水合作用降低，以及释放出多肽，从而导致原料乳变质，影响后续乳产品的货架期。
当前采用的耐冷菌蛋白酶失活方法有高温失活法和低温失活法，高温失活法由于温度高，会破坏乳品营养成分；而低温失活法处理时间过长，能耗大。因此，如何不破坏乳品营养成分又快速地使耐冷假单胞菌的胞外蛋白酶失活，这是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种新的耐冷假单胞菌的胞外蛋白酶失活方法，通过该方法既能避免高温破坏原料乳的营养成分，同时大大缩短了低温处理的时间，降低了失活过程中消耗的能源。
具体的，一方面，提供了一种耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活方法，包括以下步骤：将含有耐冷假单胞菌胞外蛋白酶的溶液在50-70℃热浴加热2-4min，再经800W微波加热60-120s。
进一步地，上述微波加热时间为90s。
进一步地，上述热浴加热的温度为55℃，时间为3.5min。
进一步地，上述热浴为金属浴。
第二方面，提供了一种原料乳的处理方法，包括以下步骤：将原料乳在50-70℃热浴加热2-4min，再经800W微波加热60-120s。
第三方面，提供了一种原料乳，经上述的处理方法进行处理后得到。
进一步地，原料乳中耐冷假单胞菌菌体数量低于105cfu/ml。
上述耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活方法，首先将含有耐冷假单胞菌胞外蛋白酶的溶液在50-70℃热浴加热2-4min，使胞外蛋白酶在处于最佳失活温度范围情况下先开始自降解，而后通过微波800W加热60-120s，促进溶液中分子内的振动，破坏蛋白酶空间折叠，并加速蛋白酶肽链和自身催化位点结合，促进肽链断裂以及降解后的肽段从反应位点离去，进而加速使胞外蛋白酶彻底失活。
此外，上述的胞外蛋白酶失活方法，与低温失活方法相比，大大缩短了处理时间，降低能耗，灭活效果也优于传统方法，并且，不会破坏胞外蛋白酶所处的溶液环境中的其他营养物质。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步阐述。
与普通的胞外酶不同，耐冷假单胞菌所分泌的耐热蛋白酶，难以通过现有的高温或低温失活方法使其完全灭活，也难以通过常规的微波加热方法使其快速失活，常规微波方法使酶失活的效率低，时间长，并且和高温失活一样，也会破坏牛乳的营养成分。为此，发明人通过创造性劳动，开发出一种新的使耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活的方法，包括以下步骤：将含有耐冷假单胞菌胞外蛋白酶的溶液在50-70℃热浴加热2-4min，再经800W微波加热60-120s。
上述耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活方法，首先将含有耐冷假单胞菌胞外蛋白酶的溶液在50-70℃加热2-4min，使胞外蛋白酶在处于最佳失活温度范围情况下先开始自降解，而后通过微波800W加热60-120s，促进溶液中分子内的振动，破坏蛋白酶空间折叠，并加速蛋白酶肽链和自身催化位点结合，促进肽链断裂以及降解后的肽段从反应位点离去，进而加速使胞外蛋白酶彻底失活。上述的胞外蛋白酶失活方法，与低温失活方法相比，大大缩短了处理时间，降低能耗，灭活效果也优于传统方法，并且，不会破坏胞外蛋白酶所处的溶液环境中的其他营养物质。
需要注意的是，上述失活方法中，当微波功率在800W左右时，例如750W，850W等，也具有一定的使耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活的效果，而优选的在800W时，酶失活的效果相对更好。在不影响本发明的核心思想的基础上，对微波功率进行合理地调整，视为对该技术特征的的等同替换。
进一步地，上述微波加热时间优选的为90s。上述热浴加热的温度优选的为55℃；热浴加热时间优选的为3.5min。通过实施例的比对亦可见，在上述优选的加热时间和温度下，耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活效果更好。
上述的热浴是指将容器置于热浴介质内，让热浴介质的温度热量通过容器传递给容器内物质，从而达到加热容器内物质的目的。常用的热浴有水浴、油浴、沙浴、铅浴等，在上述的耐冷假单胞菌胞外蛋白酶失活方法中，优选采用金属浴的方式，金属浴加热控制更加方便精准。
在另一个具体的实施方式中，还提供了一种原料乳的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：将原料乳在50-70℃热浴加热2-4min，再经800W微波加热60-120s。
通过采用上述原料乳的处理方法，一方面避免了高温工艺破坏原料乳中的维生素、蛋白质等营养物质，另一方面对胞外蛋白酶的灭活效果优于其他传统方法，并且相对于传统方法而言缩短了处理时间，降低了能耗，非常适合应用于原料乳的工业化生产。
在另一个具体的实施方式中，还提供了一种原料乳，该原料乳通过上述原料乳的处理方法得到。原料乳的处理方法具备上述的有益效果，通过该方法处理得到的原料乳也相应地具备上述有益效果，此处不再赘述。
进一步地，上述原料乳中耐冷假单胞菌菌体数量低于105cfu/ml。低温加热和微波加热处理的过程，不但使耐冷假单胞菌产生的胞外蛋白酶失活，而且，也同时起到了杀灭耐冷假单胞菌的作用，从而使处理过后的原料乳中耐冷假单胞菌菌体数量低于105cfu/ml。
下述实施例中，耐冷假单胞菌株(Pseudomonas sp)，编号为948，1034，1035，1044，M73，M35，D22，D81，M73，N33，M55，J935，M97和D72，这些菌种在实施例中为产生胞外蛋白酶的具体菌株，只是为了验证说明本发明技术方案的技术效果，不涉及本发明的失活方法的本身，因此这些具体菌株不会影响本发明技术方案的实施。
下列实施例中的MA溶液，其成分包括偶氮酪蛋白5.0g/l,3-吗啉丙磺酸缓冲液MOPS(pH 6.7)50mM，氯化钙1mM。其他未作特别说明的试剂和实验设备，均可以通过商业途径直接购得。
实施例1
将耐冷假单胞菌株1034，1035，1044，M73和948复壮后的菌液20μL接种至含1mL浓度为10g/L的灭菌脱脂奶粉溶液的EP管中，6℃培养8d。将培养后的菌液以12000rpm，于25℃离心15min。
对照样品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
对照样品2：取100μL上清于金属浴中，55℃加热10min后，于4℃冷却30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测试样品：取100μL上清于金属浴中，55℃加热3.5min后，迅速转移至微波炉(美的微波炉，额定电压220V-50Hz，2450MHz，腔体容积352×325×202mm(23L))中，于800W加热90S后,4℃冷却30S，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
对三组样品分别用20μL 2M的三氯乙酸终止反应，以10000rpm，于25℃离心15min后，取150μL上清至96孔孔细胞培养板中，加50μl浓度为1M氢氧化钠溶液中和。将96孔细胞培养板置于酶标仪中测450nm处的吸收值。反应2h的吸光值减去同一空白样品(菌液上清由去离子水替代)的吸光值得到吸光值增值(DA)。450nm处每毫升样品每小时的吸光值增值为蛋白酶活力(ΔA h-1mL-1)。
菌株的蛋白酶活力小于0.3ΔA h-1ml-1被认为是蛋白酶完全失活。
每次试验进行两次，取平均值。残留酶活力计算方法是，将对照样品2和测试样品的蛋白酶活力值分别除以对照样品1的蛋白酶活力值，得到残留酶活力百分比作为各自的残留酶活力值。
测得的残留酶活力值结果如下表1所示：
表1
从表1结果可见，测试样品的失活方法处理时间仅5min，是对照样品2处理时间的1/2。并且，对于1034，1035，1044，M73和948这5个菌株，采用本发明的失活方法均能使相应的胞外酶失活，除菌株1044外，其他4个菌株产生的蛋白酶的残留活力均小于采用低温失活法，这说明本发明的失活效果远优于低温失活法。
实施例2
将耐冷假单胞菌株M35，D22，D81，M73，N33，M55，M97和D72复壮后的菌液20μL接种至含1mL浓度为10g/L的灭菌脱脂奶粉溶液的EP管中，6℃培养8d。将培养后的菌液以12000rpm，于25℃离心15min。
对照样品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
对照样品2：取100μL上清于金属浴中，55℃加热10min后，于4℃冷却30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测试样品：取100μL上清于金属浴中，55℃加热3.5min后，迅速转移至微波炉(美的微波炉，额定电压220V-50Hz，2450MHz，腔体容积352×325×202mm(23L))中，于800W加热90S后,4℃冷却30S，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测定残留酶活力值的方法同实施例1，结果如下表2所示：
表2
从表2结果可见，测试样品的失活方法处理时间仅5min，是对照样品2处理时间的1/2。并且，对于M35，D22，D81，M73，N33，M55，M97和D72这8个菌株，采用本发明的失活方法均能使相应的胞外酶失活，8个菌株产生的蛋白酶的残留活力均远小于采用低温失活法，这说明本发明的失活效果远优于低温失活法，尤其是对于菌株D22、D72、M55、N33等，其失活效果分别约为低温失活法的7倍、3倍、1.7倍及1.5倍。
实施例3
将耐冷假单胞菌株1034，1035，1044和M73复壮后的菌液20μL接种至含1mL浓度为10g/L的灭菌脱脂奶粉溶液的EP管中，6℃培养8d。将培养后的菌液以12000rpm，于25℃离心15min。
对照样品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
对照样品2：取100μL上清于金属浴中，55℃加热10min后，于4℃冷却30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测试样品：取100μL上清于金属浴中，55℃加热2min后，迅速转移至微波炉(美的微波炉，额定电压220V-50Hz，2450MHz，腔体容积352×325×202mm(23L))中，于800W加热90S后,4℃冷却30S，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测定残留酶活力值的方法同实施例1，结果如下表3所示：
表3
从表3结果可见，将测试样品的失活方法处理时间缩短为2min，对于1034，1035，1044和M73这4个菌株，采用本发明的失活方法均能使相应的胞外酶失活，并且除菌株1044外，其他3个菌株产生的蛋白酶残留活力均小于低温失活法。但与实施例1的最优条件失活效果相比，所有菌株残留活力均大于最优失活条件处理后的酶活力，这说明此条件失活效果劣于最优条件下的失活效果。
实施例4
将耐冷假单胞菌株N33复壮后的菌液20μL接种至含1mL浓度为10g/L的灭菌脱脂奶粉溶液的EP管中，6℃培养8d。将培养后的菌液以12000rpm，于25℃离心15min。
对照样品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
对照样品2：取100μL上清于金属浴中，55℃加热10min后，于4℃冷却30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测试样品：取100μL上清于金属浴中，70℃加热2min后，迅速转移至微波炉(美的微波炉，额定电压220V-50Hz，2450MHz，腔体容积352×325×202mm(23L))中，于800W加热90S后,4℃冷却30S，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测定残留酶活力值的方法同实施例1，结果如下表4所示：
表4
从表4结果可见，采用70℃加热2min后立即微波处理，N33产生的胞外蛋白酶的残留活力略低于与低温失活法，但二者无显著差异。而与实施例1的最优条件失活效果相比，远高于采用最优条件处理的残留酶活力。这说明此条件失活效果劣于最优条件失活效果，但与传统低温失活的效果相当，二者无显著差异。
实施例5
将耐冷假单胞菌株948复壮后的菌液20μL接种至含1mL浓度为10g/L的灭菌脱脂奶粉溶液的EP管中，6℃培养8d。将培养后的菌液以12000rpm，于25℃离心15min。
对照样品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
对照样品2：取100μL上清于金属浴中，55℃加热10min后，于4℃冷却30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测试样品：取100μL上清于金属浴中，70℃加热4min后，迅速转移至微波炉(美的微波炉，额定电压220V-50Hz，2450MHz，腔体容积352×325×202mm(23L))中，于800W加热120S后,4℃冷却30S，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测定残留酶活力值的方法同实施例1，结果如下表5所示：
表5
从表5结果可见，采用70℃加热4min后立即微波处理120s，耐冷假单胞菌948产生的胞外蛋白酶的残留活力略高于与低温失活法，但二者无显著差异。而与实施例1的最优条件失活效果相比，远高于采用最优条件处理的残留酶活力。这说明此条件失活效果劣于最优条件失活效果，但与传统低温失活的效果相当，二者无显著差异。
实施例6
将耐冷假单胞菌株948复壮后的菌液20μL接种至含1mL浓度为10g/L的灭菌脱脂奶粉溶液的EP管中，6℃培养8d。将培养后的菌液以12000rpm，于25℃离心15min。
对照样品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
对照样品2：取100μL上清于金属浴中，55℃加热10min后，于4℃冷却30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测试样品：取100μL上清于金属浴中，70℃加热4min后，迅速转移至微波炉(美的微波炉，额定电压220V-50Hz，2450MHz，腔体容积352×325×202mm(23L))中，于800W加热120S后,4℃冷却30S，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测定残留酶活力值的方法同实施例1，结果如下表6所示：
表6
从表6结果可见，对菌株948产生的胞外蛋白酶而言，其残留活力大于实施例1的最优失活条件处理后的酶活力，与低温失活法处理后的酶活力相当，这说明此条件失活效果劣于最优条件失活效果，但与传统低温失活的效果相当，二者无显著差异。
实施例7
将耐冷假单胞菌株J935复壮后的菌液20μL接种至含1mL浓度为10g/L的灭菌脱脂奶粉溶液的EP管中，6℃培养8d。将培养后的菌液以12000rpm，于25℃离心15min。
对照样品1：取100μL上清加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
对照样品2：取100μL上清于金属浴中，55℃加热10min后，于4℃冷却30S后，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测试样品：取100μL上清于金属浴中，50℃加热2min后，迅速转移至微波炉(美的微波炉，额定电压220V-50Hz，2450MHz，腔体容积352×325×202mm(23L))中，于800W加热90S后,4℃冷却30S，加至100μL MA溶液中，40℃反应2h。
测定残留酶活力值的方法同实施例1，结果如下表7所示：
表7
从表7结果可见，对菌株J935产生的胞外蛋白酶而言，其残留活力大于实施例1的最优失活条件处理后的酶活力，但是远低于传统低温失活法处理后的酶活力，这说明此条件失活效果劣于最优条件失活效果，优于传统低温失活的效果。
需要说明的是，上述实施例中，为了便于验证本发明的失活方法的效果，采用脱脂乳粉溶液接种高浓度的菌液来进行试验，因而经过处理后样品中仍残留一部分具有活力的蛋白酶。当处理样品为正常工业中的原料乳时，原料乳中的耐冷假单胞菌胞外蛋白酶的浓度远远小于上述实施例中的浓度，因此采用本发明的失活方法可以使胞外蛋白酶几乎全部失活，从而避免由胞外蛋白酶引起的原料乳变质，有利于延长原料乳的货架期。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以帮助理解本发明的技术方案及核心思想，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换也落入本发明权利要求的保护范围内。