本发明涉及一种热稳定性提高的碱性果胶酶突变体，属于酶工程领域。
背景技术：
果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。
目前对碱性果胶酶研究比较深入的菌株主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。综合比较可表达碱性果胶酶的不同宿主，毕赤酵母虽然表达蛋白易于纯化，产量高，但发酵周期长、过程复杂、低温诱导耗能高；枯草芽孢杆菌不易表达或表达酶活低等缺点。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种碱性果胶酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述碱性果胶酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种提高碱性果胶酶热稳定性的方法，所述方法是将SEQ ID NO,3所示碱性果胶酶的N端通过PT-Linker连接SEQ ID NO.4所示的双亲短肽。
在本发明的一种实施方式中，所述PT-Linker序列为PTPPTTPTPPTTPTPT。
本发明的第四个目的是提供表达所述碱性果胶酶突变体的细胞系。
本发明的第五个目的是提供一种产碱性果胶酶的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主、以pET-22b(+)为载体，表达SEQ ID NO.1所示碱性果胶酶突变体。
本发明的第六个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是以pET-22b(+)为载体，将SEQ ID NO.2所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌中。
本发明的第七个目的是提供一种碱性果胶酶的生产方法，是将所述基因工程菌接种至发酵培养基，于37℃培养至OD600＝0.6～1.0，加入终浓度0.04～0.06mmol/L的IPTG，于30℃诱导24～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将基因工程菌接种至发酵培养基，于37℃培养至OD600＝0.6～1.0，加入终浓度0.04～0.06mmol/L的IPTG，于30℃诱导48h。
在本发明的一种实施方式中，所述接种是按体积接种3～5％的种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液是将所述重组菌接种于LB培养基中，于37℃,200～250rpm培养10～12h，获得种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是先进行种子培养，再进行发酵；所述种子培养是将所构建好的重组菌E.coli BL21(DE3)从甘油管中取适量接种于含100μg·mL-1氨苄青霉素，2％葡萄糖的LB培养基中，装液量为20mL/250mL。37℃，200r·min-1摇床上振荡培养10h；所述摇瓶发酵是将培养10h的种子液以3％(V/V)的接种量接入含100μg·mL-1氨苄青霉素的TB培养基中，装液量为20mL/250mL，37℃，200r·min-1培养至菌体浓度OD600＝0.6，加入终浓度0.04mM IPTG进行诱导，30℃下诱导48h。
本发明还要求保护所述突变体和基因工程菌在食品、纺织或造纸领域的应用。
有益效果：相对于现有的PGL而言，本发明的构建的突变体PGL-3S1的比酶活提高了3.4倍，在60℃的半衰期由原来的5.2min提高到19min，提高了3.6倍。本发明的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。
具体实施方式：
培养基：
种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L。
发酵培养基：蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油10g/L、KH2PO42.32g/L、K2HPO416.43g/L。
碱性果胶酶酶活测定：
采用分光光度法测定。单位酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所用的酶量。酶活测定条件为：酶活力检测：发酵液8000rpm离心10min，胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。PGL反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol·L-1，0.44mmol·L-1的CaCl2，pH9.4)2mL，待测样品20μL，无活性的酶液为空白对照。PGL反应条件为：将反应体系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L-1)终止反应，在235nm处测定吸光度值。
热稳定性测定：
将稀释好的酶液分装并置于60℃金属浴中，每隔3min取样进行残余酶活测定，计算半衰期。
实施例1：突变菌株的获得
采用PCR扩增或者化学合成的方法，得到序列如SEQ ID NO.2所示的碱性果胶酶基因，然后将基因连接到pET-22b(+)，再转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，筛选，正确的转化子命名为重组菌E.coli BL21(DE3)(pET-22b(+)/PGL-3S1)。
实施例2：突变株的验证
种子培养：将重组菌E.coli BL21(DE3)(pET-22b(+)/PGL-3S1)从甘油管中取适量接种于LB培养基中(100μg·mL-1氨苄青霉素，2％葡萄糖)，装液量为20mL/250mL。37℃，200r·min-1摇床上振荡培养10h。
摇瓶发酵：将培养10h的种子液以3％(V/V)的接种量接入发酵培养基TB(100μg·mL-1氨苄青霉素)中，装液量为20mL/250mL，37℃，200r·min-1培养至菌体浓度OD600＝0.6，加入终浓度0.04mM IPTG进行诱导，30℃下诱导48h。
实施例3：碱性果胶酶的纯化
将重组菌发酵液8000r/min离心20min，取上清液，加硫酸铵进行梯度盐析，低温离心收集30～50％硫酸铵沉淀部分，将盐析沉淀的酶溶解在甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH7.5)中，用20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液透析处理24h。离心所得上清液经阳离子交换层析进行进一步分离纯化，所得95％电泳纯的蛋白经脱盐柱脱盐，所得纯酶液进行性质测定。
实施例4：碱性果胶酶纯酶液比酶活及半衰期测定
将纯化后的碱性果胶酶稀释，并测定酶活，用BSA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。结果显示，本发明构建的碱性果胶酶突变体PGL-3S1热稳定性提高显著，60℃下半衰期由原来的5.2提高到19min。且对酶活的测定结果显示，出发PGL比酶活为264.17±5.48U/mg，而突变体PGL-3S1比酶活高达902.25±20.22U/mg，与出发PGL相比酶活提高了3.42倍。
此外，本发明还比较了其余融合不同长度的自组装双亲短肽的融合蛋白的热稳定性，结果如表1所示。
表1不同长度双亲短肽对酶热稳定性的影响
采用SEQ ID NO.4所示序列构建的碱性果胶酶突变体热稳定性显著提高，其半衰期达19.06min。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种热稳定性提高的碱性果胶酶突变体
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
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Met His His His His His His Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala
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Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala
20 25 30
Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala
35 40 45
Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro
50 55 60
Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Ala Met Asp Ala Asp Leu Gly His
65 70 75 80
Gln Thr Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala Tyr Ser Thr Gly Thr
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Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Leu Asn Val Tyr Thr Val Ser Asn
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Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Glu Thr Asn Thr Thr Pro
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Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met Asn Val Asp Asp Asn
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Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp Pro Glu Tyr Asp Leu
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Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr Trp Gly Lys Lys Glu
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Pro Ser Gly Thr Gln Glu Glu Ala Arg Ala Arg Ser Gln Lys Asn Gln
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Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn Thr Thr Ile Val Gly
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210 215 220
Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln Asp Ala Tyr Asp Tyr
225 230 235 240
Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser Gly Asn Trp Asn Ser
245 250 255
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260 265 270
His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp Ser Thr Ser Pro Lys
275 280 285
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305 310 315 320
Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser Lys Thr Ser Asp Asp
325 330 335
Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Val
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaagcagaag cgaaagccaa agcagaagca gaagcgaaag ccaaatggat atcgcctact 180
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ggcgggtcaa aagcatcgtc cttaaatgtg tataccgtca gcaacagaaa ccagcttgtc 360
tcggcattag ggaaggaaac gaacacaacg ccaaaaatca tttatatcaa gggaacgatt 420
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cacgatcatg ataaaagctc cattttcgga tcaagtgaca gcaaaacctc cgatgacggc 1020
aaattaaaaa ttacgctcca tcataaccgc tataaaaata ttgtccagcg cgcgccgaga 1080
gtccgcttcg ggcaagtgca cgtatacaac aactattatg aaggaagcac aagctcttca 1140
agttatcctt tcagctatgc atggggaatc ggaaagtcat ctaaaatcta tgcccaaaac 1200
aatgtcattg acgtaccggg actgtcagct gctaaaacga tcagcgtatt cagcggggga 1260
acggctttat atgactccgg cacgttgctg aacggcacac agatcaacgc atcggctgca 1320
aacgggctga gctcttctgt cggctggacg ccgtctctgc atggatcgat tgatgcttct 1380
gctaatgtga aatcaaatgt cataaatcaa gcgggtgcgg gtaaattaaa t 1431
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<212> PRT
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<400> 3
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