一种果胶酶及其应用的制作方法

本发明涉及一种果胶酶及其应用，属于酶工程领域。

背景技术：

碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2，简称PGL)，全称聚半乳糖醛酸裂解酶，在碱性条件下具有高活性，可以利用反式消去作用切断聚乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，将果胶质分解为不饱和的寡聚半乳糖醛酸。该酶广泛存在于细菌、酵母菌、真菌、植物以及和某些寄生线虫。不同来源的碱性果胶酶同源性差异较大。碱性果胶酶广泛应用于食品、纺织、造纸、环境、生物技术等各个领域，在茶和咖啡发酵、纺织和植物纤维加工、油提取、含果胶工业废水处理等发挥巨大作用。

在棉纤维初生细胞壁的最表面含有很多伴生杂质，如：果胶质、蜡质、含氮物质以及蛋白质等非纤维素类物质，互相包结成为复杂庞大的疏水网状结构。纺织工业中包含精炼步骤，其目的就是去除棉纤维上的杂质，提高棉织物的吸湿功能性，再进行后续加工。传统的化学纺织精炼方法即热碱法，其需要消耗大量的化学品与水资源，环境污染严重，据统计，印染过程中约70％的废水是在这个步骤中产生的。除此之外，热碱处理将对纤维造成严重损伤，机械强度将大幅下降。

近十几年来，随着分子生物学与工业微生物研究的迅猛快速发展，采用基因工程手段构建重组菌，以期实现碱性果胶酶的过量重组表达。目前，已相继出现了利用Escherichia coli、Bacillus subtilis和Pichia pastoris等作为宿主表达不同来源果胶酶基因的报道。

现在对碱性果胶酶的研究主要集中于合成碱性果胶酶工程菌与发酵过程控制。尽管PGL的表达量很高，但是酶的催化效率耐热性等酶学特性还有待进一步改进。

技术实现要素：

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种热稳定性提高的碱性果胶酶突变体。所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的碱性果胶酶(野生型)为基础，将第229位的丝氨酸S点突变为赖氨酸K、第230位的天冬酰胺N突变为脯氨酸P、第231位的甘氨酸G突变为赖氨酸K。

本发明要解决的第二个技术问题是提供构建所述碱性果胶酶突变体的方法，是通过设计引物对编码碱性果胶酶的基因进行定点突变后表达。

所述构建方法，优选以质粒pET-20b(+)-pgl为模板设计引物进行突变并将突变后的质粒转化进入E.coli JM109进行扩增，然后以E.coli BL21(DE3)表达含突变基因的重组质粒，得到热稳定性增强的碱性果胶酶突变体。

本发明要解决的第三个技术问题是提供应用基因工程菌发酵生产所述碱性果胶酶突变体的方法，是将含有编码突变碱性果胶酶的基因的重组菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K)活化培养后接种到含有发酵培养基中培养，并以IPTG诱导所述碱性果胶酶突变体的表达。

所述活化培养是将重组菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K)接种于含有100μg mL^-1氨苄青霉素的种子培养基中，装液量为20mL/250mL，培养温度37℃，200rpm min^-1摇床上振荡培养10h。

所述发酵培养基组成：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K₂HPO₄72mmol L^-1，KH₂PO₄17mmol L^-1。

突变前碱性果胶酶(WT)在经过30℃保温24h，50℃保温2h，55℃下保温1h后酶活损失比较明显；但是突变后的碱性果胶酶(S229K/N230P/G231K)做相同处理后，仍保持较高的残留酶活。30℃保温24h后，突变后的残留酶活比突变前提高了57.4％；50℃保温2h后，突变后的残留酶活是突变前的5.8倍；55℃下保温1h，突变后的残留酶活是突变前的4.3倍。总的来说，碱性果胶酶S229K/N230P/G231K在30℃、50℃和55℃下的耐热性明显提高。本发明提供的碱性果胶酶更加适合工业化生产需求，满足社会生产的要求。

具体实施方式

碱性果胶酶酶活力检测：取一定量发酵液，8000rpm离心10min，胞外碱性果胶酶位于发酵上清液之中。碱性果胶酶反应体系为：酶稀释液20μL，含0.2％PGA的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol L^-1，0.44mmol L^-1的CaCl₂，pH9.4)2mL，无活性的酶液为空白对照。碱性果胶酶反应条件为：45℃水浴15min，使用3mL磷酸溶液(0.03mol L^-1)终止反应，235nm处测定反应物吸光度值。

碱性果胶酶酶活单位定义为：1分钟裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol不饱和聚半乳糖醛酸所对应酶量。碱性果胶酶酶活计算方法：

(OD₂₃₅×10⁶×体系体积×酶液稀释倍数)/(10³×比色杯厚度×4600×酶反应线性范围内的酶促反应时间×酶液体积)

碱性果胶酶纯化条件：A液：甘氨酸-NaOH，pH 7.5；B液：甘氨酸-NaOH，2M硫酸铵，pH 7.5；5mL疏水柱[HiTrap Phenvl(high sub)FF]，3mL/min，30％B液洗脱得到目的蛋白；30kDa millipore超滤离心管浓缩得到SDS-PAGE电泳纯。

碱性果胶酶热稳定性检测：在不同温度下按照标准方法测定酶活力，以处理前酶活定为100％.，将酶液分别在30℃保温24h，40℃保温2h，50℃保温2h，55℃下保温1h，利用冰浴迅速冷却后，按上述方法测残余酶活力，考察其热稳定性。

碱性果胶酶K_m、V_max检测：在0.05-2g/L不等的底物浓度下测定，由GraphPad Prism 5预测得到。

实施例1突变表达质粒的构建及重组枯草芽孢杆菌的获得

1、以pET-20b(+)-pgl质粒为模板构建突变表达载体

编码野生型碱性果胶酶及由21个氨基酸组成的信号肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，野生型成熟碱性果胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。结合碱性果胶酶的三维结构，确定将第229位的丝氨酸S点突变为赖氨酸K、第230位的天冬酰胺N突变为脯氨酸P、第231位的甘氨酸G突变为赖氨酸K。

以pET-20b(+)-pgl质粒为模板，设计引物将第229位的丝氨酸S点突变为赖氨酸K、第230位的天冬酰胺N突变为脯氨酸P、第231位的甘氨酸G突变为赖氨酸K。用于定点突变的引物：

PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

加水补至50μl。

PCR反应条件：94℃预变性10min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸5min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。将通过PCR得到的突变表达载体pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K利用DpnI核酸内切酶进行酶切消化DNA模板。

质粒pET-20b(+)-pgl的构建方法参见文献：Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach.2011,Shuying Fang et al.Volume 102,Issue 22,p10671–10678.

2、突变表达载体的转化

(1)感受态细胞的制备

将E.coli BL21(DE3)在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到LB培养基中。37℃振荡(200rpm)培养。测定OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值达到0.35～0.5时(约培养5小时)放置冰中停止培养(如果OD₆₀₀值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率)。取上述菌体培养液1ml于1.5ml Microtube中(根据需要量确定Microtube数量)。1,500×g(一般的微型离心机约4000rpm)4℃离心5分钟，弃上清(注意尽量除尽上清)。在每个Microtube中加入100l冰中预冷的Solution A，轻轻弹动Microtube使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡1,500×g(一般的微型离心机约4000rpm)4℃离心5分钟，弃上清(注意尽量除尽上清)。在每个Microtube中加入100μL冰中预冷的Solution B，轻轻弹动Microtube使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。

(2)突变表达载体的验证扩增

感受态细胞制作完成。本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。感受态细胞的DNA转化将-80℃保存的感受态细胞置于冰中融化10分钟。取100μL的感受态细胞移至新的转化管中。向感受态细胞中加入0.1ng～10ng(3μL～10μL)的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。42℃水浴中放置90秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。加入890μL 37℃预温的LB培养基。37℃振荡培养1小时。取适量涂平板后，将平板倒置于37℃培养箱中培养一夜。确认培养菌落，进行下步实验。

实施例2突变PGL的表达

种子培养基组成(g/L)：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10，葡萄糖20，pH 7.0。

发酵培养基组成：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K₂HPO₄72mmol L^-1，KH₂PO₄17mmol L^-1。

从甘油管中将含有突变表达载体pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K的重组菌E.coliBL21(DE3)接种于含有100μg mL^-1氨苄青霉素的种子培养基中，装液量为20mL/250mL。培养温度37℃，200rpm摇床上振荡培养10h。

将培养10h的种子液以3％(V/V)的接种量接入含有100μg mL^-1氨苄青霉素的发酵培养基中，装液量为50mL/500mL，于37℃，200r min^-1培养。菌体生长到一定阶段(OD₆₀₀＝0.6)，加入终浓度0.4mM IPTG进行诱导，同时将温度调整为30℃，诱导发酵48h。

实施例3突变前后PGL的酶学性质

按照实施例2所述的方法分别以含未经突变的表达载体pET-20b(+)-pgl的E.coli BL21(DE3)及突变株E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-pgl S229K/N230P/G231K)进行发酵，将发酵液中的酶纯化后进行耐热性等酶学性质分析。所得碱性果胶酶突变体命名为S229K/N230P/G231K。

突变前碱性果胶酶(WT)在经过30℃保温24h，50℃保温2h，55℃下保温1h后酶活损失比较明显；但是突变后的碱性果胶酶(S229K/N230P/G231K)做相同处理后，仍保持较高的残留酶活。30℃保温24h后，突变后的残留酶活比突变前提高了57.4％；50℃保温2h后，突变后的残留酶活是突变前的5.8倍；55℃下保温1h，突变后的残留酶活是突变前的4.3倍。总的来说，碱性果胶酶S229K/N230P/G231K在30℃、50℃和55℃下的耐热性明显提高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 曹书华

<120> 一种果胶酶及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1263

<212> DNA

<213> Bacillus sp. WSHB04-02

<400> 1

atgaaaaaag tgatgttagc tacggctttg tttttaggat tgactccagc tggcgcgaac 60

gcagctgatt taggccacca gacgttggga tccaatgatg gctggggcgc gtactcgacc 120

ggcacgacag gcgggtcaaa agcatcgtcc ttaaatgtgt ataccgtcag caacagaaac 180

cagcttgtct cggcattagg gaaggaaacg aacacaacgc caaaaatcat ttatatcaag 240

ggaacgattg acatgaacgt agatgacaat ctgaagccgc ttggtctaaa tgactataaa 300

gatccggagt atgatttgga caaatatttg aaagcctatg atcctagcac atggggcaaa 360

aaagagccgt cgggaacaca agaagaagcg agagcacgct ctcagaaaaa ccaaaaagca 420

cgggttatgg tggatatccc tgcaaacacg acgatcgtcg gttcagggac taacgctaaa 480

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caggatgcct atgattattt tccgcaatgg gatccgactg acggaagctc aggaaactgg 600

aactcacaat acgacaacat cacgataaac ggcggcacac acatctggat tgatcactgt 660

acatttaacg acggttcgcg tccggacagc acatcaccga aatattatgg aagaaaatat 720

cagcaccatg acggccaaac ggatgcgtcc aacggcgcta actatatcac gatgtcctac 780

aactattatc acgatcatga taaaagctcc attttcggat caagtgacag caaaacctcc 840

gatgacggca aattaaaaat tacgctccat cataaccgct ataaaaatat tgtccagcgc 900

gcgccgagag tccgcttcgg gcaagtgcac gtatacaaca actattatga aggaagcaca 960

agctcttcaa gttatccttt cagctatgca tggggaatcg gaaagtcatc taaaatctat 1020

gcccaaaaca atgtcattga cgtaccggga ctgtcagctg ctaaaacgat cagcgtattc 1080

agcgggggaa cggctttata tgactccggc acgttgctga acggcacaca gatcaacgca 1140

tcggctgcaa acgggctgag ctcttctgtc ggctggacgc cgtctctgca tggatcgatt 1200

gatgcttctg ctaatgtgaa atcaaatgtc ataaatcaag cgggtgcggg taaattaaat 1260

taa 1263

<210> 2

<211> 399

<212> PRT

<213> Bacillus sp. WSHB04-02

<400> 2

Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Leu Asn Val

20 25 30

Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Glu

35 40 45

Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met

50 55 60

Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp

65 70 75 80

Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr

85 90 95

Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Gln Glu Glu Ala Arg Ala Arg

100 105 110

Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn

115 120 125

Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Val Val Gly Gly Asn

130 135 140

Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln

145 150 155 160

Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser

165 170 175

Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr

180 185 190

His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp

195 200 205

Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Tyr Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly

210 215 220

Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn

225 230 235 240

Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser

245 250 255

Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg

260 265 270

Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val

275 280 285

His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr

290 295 300

Pro Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala

305 310 315 320

Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu

340 345 350

Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser

355 360 365

Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Ser Ile Asp Ala Ser Ala Asn

370 375 380

Val Lys Ser Asn Val Ile Asn Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn

385 390 395

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<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 3

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<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 4

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