pH敏感嵌段聚合物、FRET复合物及其制备方法与流程

本发明涉及高分子材料技术领域，特别是涉及一种pH敏感嵌段聚合物、FRET复合物模型及其制备方法。

背景技术：

荧光共振能量转移(FRET)是一种将荧光光谱与共振能量转移相结合的高灵敏，高空间分辨率，无损伤的均相检测技术。FRET是指荧光供受体在1-10nm距离内，当供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定重叠时，由于偶极-偶极相互作用，供体激发态能量以非辐射的形式传递给受体。能量转移效率与供受体之间距离R的六次方成反比，因此，FRET被称为1.0-10.0nm范围内有效的光学“分子尺”，并已在生物分析中具有广泛的应用。其应用于分析化学领域已有40多年，该技术在自身不断完善的同时，极大地促进了生物医学分析的发展^[3]。与传统的酶联免疫等异相检测体系相比，FRET是均相分析，省去了很多分离步骤，极大地简化了分析过程，使自动化、高通量分析成为可能，并可克服固相载体非特异性吸附的影响。

利用FRET的原理，设计一种空间可变构的两亲性自组装聚合物，能够通过变构实现头尾两端的亲近与疏远，以此完成FRET。如果使用常见的PCL-PEG-PCL聚合物，能够实现聚合物链段的自我折叠，完成自组装或温度敏感的凝胶化^[4]。尽管如此，经尾静脉注射的此聚合物胶束，无pH敏感性，且链段上无可用于荧光标记的化学位点，无法在体内实现诊疗一体化。另一方面，已有专利中，聚组氨酸-聚乙二醇-聚己内酯(PLH-PEG-PCL)作为一种pH敏感的聚合物载药体系，体内注射后所载药物或荧光标记的聚合物后会被体内多种组织摄取，无法在低背景条件下实现肿瘤的成像。

因此有必要设计一种能够在酸性条件下实现肿瘤特异性的成像、降低体内其他组织代谢后的荧光干扰的FRET模型。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的是提供一种肿瘤酸性微环境调节的pH敏感嵌段聚合物。

具体的技术方案如下：

一种pH敏感嵌段聚合物，该聚合物的结构为聚组氨酸-聚乙二醇-聚己内酯-硫辛酸，其中聚乙二醇的分子量为2000-5000，所述聚己内酯的分子量为2000-10000，聚组氨酸链段长度由10-30个组氨酸组成。

在其中一些实施例中，聚己内酯与聚乙二醇的链长比为1-5。

在其中一些实施例中，聚乙二醇的分子量为2000、4000或5000。

本发明的另一目的是提供上述pH敏感嵌段聚合物的制备方法。

具体的技术方案如下：

上述pH敏感嵌段聚合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将0.5-5g异双官能团聚乙二醇溶解于30-120ml 10wt％的Na₂CO₃溶液中，冷却至-4-0℃，将0.6-10g芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺溶解于5-50ml二氧六环中并缓慢滴入聚乙二醇溶液中，-4-0℃搅拌25-35min，然后置于室温继续搅拌6-12h，经乙醚沉淀、过滤，再在去离子水体系下透析40-50h，得Fmoc-NH-PEG-OH；

(2)将1-5g组氨酸单体溶解于10ml无水四氢呋喃，然后加入0.8-5ml亚硫酰氯，室温反应1-3h，经过量乙醚沉淀、过滤、重结晶得组氨酸酸酐；

(3)以辛酸亚锡为催化剂，将0.5-2gFmoc-NH-PEG-OH与1-10g己内酯在130-170℃条件下开环聚合制备Fmoc-NH-PEG-PCL-OH，所述辛酸亚锡的投料量为己内酯用量的0.4-0.6wt％；

(4)将Fmoc-NH-PEG-PCL-OH与硫辛酸按摩尔比为1：1.2-1.5的比例分别溶于二甲亚砜中，Fmoc-NH-PEG-PCL-OH与二甲亚砜的比例为1mol：(20-40)ml；然后加入二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、吡啶，23-28℃搅拌40-50h，其中二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的添加量分别为Fmoc-NH-PEG-PCL-OH摩尔量的1.2-1.5倍，三乙胺和吡啶的添加量分别为二甲亚砜体积的0.5-1.5％，过滤，再在去离子水体系下透析40-50h并冻干得Fmoc-NH-PEG-PCL-LA；

(5)将步骤(4)得到的0.2-2g Fmoc-NH-PEG-PCL-LA粉末溶于10-30mL20wt％哌啶的二甲基甲酰胺溶液中，23-28℃搅拌10-20min，使用无水乙醚沉淀，制得NH-PEG-PCL-LA；

(6)将80mg NH-PEG-PCL-LA与20-50mg组氨酸酸酐溶于25-35mL二甲基甲酰胺中，23-28℃搅拌20-30h；然后加入巯基乙醇，巯基乙醇的添加量二甲基甲酰胺体积的0.5-1.5％，继续搅拌1-1.5h，经乙醚沉淀，即得所述pH敏感嵌段聚合物。

本发明的另一目的是提供一种FRET复合物。

具体的技术方案如下：

一种由上述pH敏感嵌段聚合物制备得到的FRET复合物。

本发明的另一目的是提供上述FRET复合物的制备方法。

具体的技术方案如下：

上述FRET复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用荧光染料标记所述pH敏感嵌段聚合物的氨基末端；

(2)将10mg-200mg金纳米颗粒加入10mL浓度为5mg/mL的步骤(1)得到的产物的二甲亚砜溶液中，然后在PBS体系下透析6-7h，即得所述FRET复合物。

在其中一些实施例中，所述金纳米颗粒选自胶体金或金纳米棒。

在其中一些实施例中，所述荧光染料选自Cy5或Cy7。

在其中一些实施例中，所述PBS体系的pH值为7.2-7.4。

本发明的原理及优点如下：

大量的肿瘤诊疗一体化方案被用来设计和构建药物、探针共载体系，但是众多载体中，设计大多围绕二硫键(-S-S)、pH敏感断裂(如腙键-NH-NH等)实现载体药物释放，同时利用Gd、Fe₃O4或者ICG等实现多模态成像。当这些复合体系经血液循环到达靶组织后，能够实现预想的成像与治疗。但是肝脏、肾脏以及其他如肠道代谢中被动摄取的这些复合物同样能够发射荧光信号，干扰肿瘤部位的荧光信号分析，不利于实现肿瘤低背景的成像。我们利用Cy系列探针为荧光分子，发射的荧光信号可以在FRET条件下被金纳米棒吸收，完成荧光的淬灭或强度降低，实现FRET对荧光的开关。控制FRET模型中的分子间距离，可以实现这一概念。因为我们采用对肿瘤微环境敏感的聚组氨酸链段作为相应分子，设计了Cy7-PLH-PEG-PCL-LA/Au复合模型(如图1所示)，完成肿瘤诊疗一体化的应用目的。当该模型纳米聚合物复合体系进入碱性或中性生理环境时，荧光因为FRET效应而被关闭；当复合物体系进入肿瘤部位时，实现聚合物的pH敏感变构，打破FRET的实现条件，完成荧光的一个恢复。

本发明以功能化的嵌段聚合物聚组氨酸-聚乙二醇-聚己内酯-硫辛酸(PLH-PEG-PCL-LA)设计与合成为核心内容，构建基于荧光共振能量转移(FRET)原理、可针对肿瘤酸性微环境特异近红外成像并参与治疗的诊疗一体化模型。利用聚组氨酸在不同pH条件下的亲疏水性质变化，PLH-PEG-PCL-LA具有碱性条件下“折叠”、酸性条件下“伸展”两种纳米构象。通过对聚己内酯末端的硫辛酸修饰引入二硫键(-S-S)，荧光分子标记后的聚合物能够与金颗粒组装成近红外成像的FRET模型。控制合成反应，得到不同聚己内酯(PCL)/聚乙二醇(PEG)/聚组氨酸(PLH)链段长度的聚合物分子，由pH敏感变构作用调节作为供体的荧光分子(如花青染料Cy5、Cy7)与作为受体的金纳米颗粒的纳米构象距离，从而借助FRET控制近红外探针分子的荧光开与关，完成对实体肿瘤内酸性微环境的特异近红外成像(如图2所示)。同时，设计通过含聚乙二醇聚合物的包覆，提高金纳米颗粒的体内循环时间，增加治疗性金颗粒在肿瘤的富集，更好的实现金颗粒对肿瘤的光热治疗。

荧光共振能量转移(FRET)，是当供体与受体荧光光谱匹配、且距离小于10nm的情况下，供体的发射光谱作为受体的激发光谱，触发受体荧光激发或淬灭供体荧光的一种物理现象。利用这一物理现象，结合聚合物亲疏水性质改变导致的聚合物纳米粒构象变化这一结果，开发了一种潜在的药物递送体系。利用金棒特异的淬灭近红外荧光这一能力，构建肿瘤微环境调节荧光强度的肿瘤诊疗一体化模型，该模型既能标记肿瘤的酸性微环境，实时荧光成像；也能够递送金棒这种光敏颗粒，实现肿瘤的光热治疗。

1.利用金纳米棒作为近红外荧光分子的荧光淬灭剂，巧妙的匹配荧光分子，将发生FRET所需条件自然的整合在该发明中，构建了一种针对肿瘤酸性微环境特异性发挥作用的FRET体系模型。

2.利用pH敏感触发的聚合物纳米粒结构改变这一物理特性，控制供体(荧光基团)与与受体(金纳米粒)的距离，达到调节FRET的目的。

附图说明

图1为FRET复合物及其作用示意图；

图2为FRET复合物在肿瘤诊疗一体化应用的示意图；

图3为pH敏感嵌段聚合物的制备流程图；

图4为Cy7-PLH-PEG-PCL-LA聚合物自组装纳米粒电镜照片；

图5为Cy7-PLH-PEG-PCL-LA/Au(FRET复合物)电镜照片(左侧为明场，右侧为暗场)。

具体实施方式

本发明所使用的原料如下：

异双官能团聚乙二醇(NH2-PEG-OH，分子量为2000Da、4000Da和5000Da)购自上海炎怡生物公司；

己内酯(ε-CL)购自sigma公司；

组氨酸单体分子(Nα-CBZ-Nim-DNP-L-histidine)购自上海吉尔生化有限公司；

芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)购自sigma公司；

胶体金购自中国国药集团化学试剂有限公司；

其余试剂均为市售购得。

金纳米棒的制备方法如下：

合成金种：5mL 0.2mol/L的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)与5mL 0.5mmol/L的氯金酸相混合，再搅拌的过程中加入0.6mL 0℃保存的0.01mol/L的硼氢化钠，强烈搅拌5min，室温静置2h，作为种子金纳米粒使用；

CTAB模板法合成短的金纳米棒：取7个25mL的样品瓶(分别标记为GNP-A1、GNP-A2、GNP-A3、GNP-A4、GNP-A5、GNP-A6、GNP-A7)，分别加入5mL 0.2mol/L的CTAB水溶液，对应编号加入不同量4mmol/L的AgNO₃水溶液(0.050、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.40mL)，再分别加入5mL 1mmol/L的氯金酸水溶液，此时溶液颜色变成金黄色，接着分别加入70μL 0.0788mol/L的抗坏血酸，瞬间溶液变成无色。最后分别加入12μL的种子金纳米粒分散液，在27～30℃下静置反应2h，即得。

以下通过实施例对本申请做进一步的阐述。

实施例1

本实施例一种pH敏感嵌段聚合物的制备方法(制备流程如图3所示)如下：

使用2kDa的Fmoc-NH-PEG-OH 1g，1.2g己内酯，130℃真空、氮气保护条件下反应6小时，合成Fmoc-NH-PEG-PCL(2000-2000的聚合物)经无水乙醚沉淀、透析并冻干；

称取0.3mmolFmoc-NH-PEG-PCL、0.45mmol硫辛酸、0.45mmol二环己基碳二亚胺、0.45mmol 4-二甲氨基吡啶、0.3mL三乙胺和0.3mL吡啶加入30mL二甲亚砜中，反应48小时，制备Fmoc-NH-PEG-PCL-LA；

使用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液脱去氨基末端的保护基，即25℃搅拌10分钟，使用无水乙醚沉淀，制得NH-PEG-PCL-LA；

随后暴露的氨基用于开环组氨酸酸酐，即使用NH-PEG-PCL-LA开环聚合的方式，制备FRET模型中的聚合物：首先将上述制得的80mgNH-PEG-PCL-LA与20mg组氨酸酸酐溶于30mL二甲基甲酰胺溶液中，25℃搅拌24小时，随后加入0.3mL巯基乙醇，继续搅拌1小时，经乙醚沉淀，即得所述一端氨基、一端二硫键的pH敏感嵌段聚合物(NH₂)PLH-PEG-PCL-LA(-S-S)。

本实施例一种FRET复合物的制备方法：

经Cy7标记聚组氨酸末端，形成的聚合物均能够在DMSO中溶解，经透析法制备聚合物纳米粒。结果如图4所示。金纳米颗粒能够与二硫键(-S-S)发生特异性结合，在溶液状态下，将10mg金纳米棒加入10mL(浓度5mg/mL)Cy7-NH-PLH-PEG-PCL-LA的二甲亚砜溶液中，在使用截留分子量为1000的透析袋在5L的PBS(pH7.2-7.4)体系下透析6小时制得聚合物胶束/金纳米棒复合纳米结构的溶液。经过Cy7标记以及与金纳米粒复合，可以形成具有FRET效应的复合物。

实施例2

本实施例一种pH敏感嵌段聚合物的制备方法如下：

使用5kDa的Fmoc-NH-PEG-OH，开环己内酯至疏水链段长10000Da，合成NH₂-PEG-PCL(为5000-10000的聚合物)；

5kDa的Fmoc-NH-PEG-OH 1g，3g己内酯，170℃真空、氮气保护条件下反应6小时，合成Fmoc-NH-PEG-PCL，经无水乙醚沉淀、透析并冻干；

称取0.3mmolFmoc-NH-PEG-PCL、0.45mmol硫辛酸、0.45mmol二环己基碳二亚胺、0.45mmol 4-二甲氨基吡啶、0.3mL三乙胺和0.3mL吡啶加入30mL二甲亚砜溶液中，反应48小时，制备Fmoc-NH-PEG-PCL-LA；

使用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液脱去氨基末端的保护基，即25℃搅拌20分钟，使用无水乙醚沉淀，制得NH-PEG-PCL-LA；

随后暴露的氨基用于开环组氨酸酸酐，即使用NH-PEG-PCL-LA开环聚合的方式，制备FRET模型中的聚合物：首先将上述制得的80mgNH-PEG-PCL-LA与50mg组氨酸酸酐溶于30mL二甲基甲酰胺溶液中，25℃搅拌24小时，随后加入0.3mL巯基乙醇，继续搅拌1小时，经乙醚沉淀，即得所述一端氨基、一端二硫键的pH敏感嵌段聚合物(NH₂)PLH-PEG-PCL-LA(-S-S)。

本实施例一种FRET复合物的制备方法如下：

经Cy7标记聚组氨酸末端，形成的聚合物均能够在DMSO中溶解，经透析法制备聚合物纳米粒。在溶液状态下，将200mg金纳米棒加入10mL(浓度5mg/mL)Cy7-NH-PLH-PEG-PCL-LA的二甲亚砜溶液中，在使用截留分子量为7000的透析袋在5L的PBS(pH7.2-7.4)体系下透析6小时制得聚合物胶束/金纳米棒复合纳米结构的溶液。经过Cy7标记以及与金纳米粒复合，可以形成具有FRET效应的复合物。可以形成FRET模型(图5所示)，荧光强度在碱性条件缓冲液中减弱，而在偏酸缓冲液略有恢复。

实施例3

本实施例一种pH敏感嵌段聚合物的制备方法如下：

使用4kDa的Fmoc-NH-PEG-OH，开环己内酯至链段长4000Da，合成NH₂-PEG-PCL(4000-4000的聚合物)；

4kDa的Fmoc-NH-PEG-OH 1g，1.2g己内酯，140℃真空、氮气保护条件下反应6小时，合成Fmoc-NH-PEG-PCL(4000-4000的聚合物)经无水乙醚沉淀、透析并冻干；

称取0.3mmolFmoc-NH-PEG-PCL、0.45mmol硫辛酸、0.45mmol二环己基碳二亚胺、0.45mmol 4-二甲氨基吡啶、0.3mL三乙胺和0.3mL吡啶加入30mL二甲亚砜溶液中，反应48小时，制备Fmoc-NH-PEG-PCL-LA；

使用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液脱去氨基末端的保护基，即25℃搅拌15分钟，使用无水乙醚沉淀，制得NH-PEG-PCL-LA；

随后暴露的氨基用于开环组氨酸酸酐，即使用NH-PEG-PCL-LA开环聚合的方式，制备FRET模型中的聚合物：首先将上述制得的80mgNH-PEG-PCL-LA与30mg组氨酸酸酐溶于30mL二甲基甲酰胺溶液中，25℃搅拌24小时，随后加入0.3mL巯基乙醇，继续搅拌1小时，经乙醚沉淀，即得所述一端氨基、一端二硫键的pH敏感嵌段聚合物(NH₂)PLH-PEG-PCL-LA(-S-S)。

本实施例一种FRET复合物的制备方法如下：

经Cy7标记聚组氨酸末端，形成的聚合物均能够在DMSO中溶解，经透析法制备聚合物纳米粒。在溶液状态下，将100mg金纳米棒加入10mL(浓度5mg/mL)Cy7-NH-PLH-PEG-PCL-LA的二甲亚砜溶液中，在使用截留分子量为3500的透析袋在5L的PBS(pH7.2-7.4)体系下透析6小时制得聚合物胶束/金纳米棒复合纳米结构的溶液。经过Cy7标记以及与金纳米粒复合，可以形成具有FRET效应的复合物。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。