专利名称：油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或甾醇类化合物的检测方法
技术领域：
本发明属于中药制药领域，具体涉及油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或甾醇类化合物的检测方法。
背景技术：
国内外临床实践均证明花粉及其制剂是治疗前列腺疾病的理想药物。李永辉(李永辉.青菜花粉抗前列腺增生的药效物质基础研究.上海医药工业研究院硕士学位论文(D)，2009)针对文献报道有抗前列腺增生物活性的油菜蜂花粉、青菜花粉、玉米花粉、松花粉和向日葵花粉，在全国各大产区收集了 10余种不同品种、不同产地的花粉，以抗炎和抗丙酸睾丸素诱导所致的大鼠前列腺增生为药理筛选模型，以阿司匹林、舍尼通和前列康两种花粉制剂为阳性对照，以小鼠耳肿胀、大鼠足跖肿胀、腺脏器总重、前列腺脏器指数和前列腺增生组织学变化(间质水肿、间质充血、炎细胞浸润、纤维组织增生)为指标，考察了不同种类及产地的花粉抗前列腺增生活性。研究结果显示:油菜蜂花粉具有很强的抗前列腺增生作用，确定了油菜蜂花粉抗前列腺增生的最佳有效成分为脂肪酸类和黄酮类。研究过程中还发现产地对油菜蜂花粉和玉米花粉中脂肪酸含量的影响很大，可达2 3倍。在药效筛选研究过程中，发现花粉二氧化碳超临界提取物具有良好的抗前列腺增生活性。并经GC-MS分析，显示脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物是二氧化碳超临界提取物的主要化学成分，且以棕榈酸和亚麻酸含量最高。文献(朱刚，王建业，刘俊达，等.雌雄激素对前列腺基质细胞增殖的影响[J].中华泌尿外科杂志，2000，21 (6):361-363.)报道亚麻酸具有抗5-还原酶和抗前列腺增生的活性，因此本研究对花粉中的活性成分亚麻酸和主要成分棕榈酸进行定量分析，为花粉药材和提取物的质量控制提供参考。聚类分析的结果显示，最佳药效油菜蜂花粉在脂肪酸成分聚类和药效聚类中都聚为一类，两者存在一定的相关性，且棕榈酸有显著的相关性。近年来越来越多的研究表明，炎症与前列腺增生关系密切。前列腺素E2 (PGE2)是前列腺增生(BPH)病变非常重要的相关炎症因子。张琚教授的研究结果表明前列腺上皮细胞受到刺激后，可以分泌PGE2，进而刺激前列腺基质细胞中芳香化酶作用的增强，高水平表达雌激素，从而促进前列腺增生。因此选择PGE2抑制活性筛选抗前列腺增生的药物具有重要意义。C0X-2是影响前列腺素E2产生的限速酶，可做为前列腺增生的体外研究靶点。油菜蜂花粉超临界提取物中主要成分为长链脂肪酸及其衍生物和/或留醇类化合物，经过药效学实验证明对前列腺疾病有很好的疗效，其中主要包括亚麻酰胺，亚麻酸甘油酯，棕榈酸，10-甲氧基-1-十七烷烯-4，6- 二炔基-3，9- 二醇，鲦油酸，二十碳二酸，12甲基-肉豆蘧酸甲酯，亚麻酸，油酸，漆树酸A，豆留醇阿魏酸酯等长链脂肪酸及其衍生物和/或留醇类化合物。目前，脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物常用的分析检测方法有气相色谱(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)这些方法都需先将脂肪酸衍生为易挥发的甲酯等酯化物，其缺点是酯化过程中氧化、分解和异构化等副反应，也很难保证酯化完全，酯化过程增加的分析时间并使分析方法复杂化，由于游离脂肪酸和脂肪酸衍生物都被衍生成了脂肪酸甲酯等，这些方法不能用于直接测定非衍生脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物的含量，而且也不适合作为生产过程中检测。
发明内容
鉴于上述现有技术中的缺陷，本发明的一个目的是提供一种便捷，快速，灵敏度高的检测油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物的方法，所述方法包括:a)对待测油菜蜂花粉进行预处理，得到油菜蜂花粉提取物；b调HPLC-ELSD法(高效液相色谱-蒸发光散射检测器)检测油菜蜂花粉提取物中一种或多种脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物。ELSD是一种通用型检测器，它的响应与样品的光学特性无关，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。ELSD最大的优越性在于能检测不含发色团的化合物，如:碳水化合物、脂类、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性剂、药物，并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物，与气相色谱相比不用酯化就能直接检测脂肪酸及其衍生物，该方法精密度高，选择性好，检测时间短；HPLC-ELSD可以检测到油菜蜂花粉中四种有效物质即亚麻酰胺，亚麻酸甘油酯，亚麻酸和棕榈酸。HPLC-ELSD对实验条件要求严格，但是谱图效果更好。根据本发明一个优选的实施方式，a)步骤中所述预处理包括以下步骤:I)提供油菜蜂花粉水洗离心后的沉淀；2)用微波真空干燥上述沉淀；3)进行超临界萃取，得到超临界萃取物；4)用C1-C5的醇类或其水溶液提取上述超临界萃取物，得到油菜蜂花粉提取物。根据本发明，I)提供油菜蜂花粉水洗离心后的沉淀是现有技术，可按照专利申请CN 101933947A公开的方法制备，具体步骤如下:称取粉碎后的油菜蜂花粉2000克置于桶内搅拌，加入蒸馏水12L，室温搅拌4小时后，置于离心机中以5000r/min离心20分钟，倾去上清液，之后将离心沉淀干燥至含水量小于4%。此外，2)步骤中所述微波真空干燥的条件为:每次干燥水洗离心后沉淀投料为Ι-lOkg，优选8-10kg，干燥时间为1-4小时，干燥温度为40°C _70°C，真空度为-0.05MPa—0.1MPa，干燥微波功率为 1800MHZ-2450MHZ，排水量 50% -55%。根据本发明，3)步骤中的超临界萃取也是现有技术，该步骤可根据专利申请CN101933947A公开的方法制备，具体方法是:将2)步骤所得的微波真空干燥后的油菜蜂花粉粉碎并过60目筛后投入到IOL的萃取斧中，对萃取釜、分离釜1、分离釜II分别加热，并启动制冷剂制冷，控制萃取温度分别为50°C，萃取压力为35MPa，二氧化碳流量20L/h，分离I温度45°C，压力8MPa ;分离II温度35°C，压力4_6MPa，萃取时间为90min，在分离釜中得到超临界提取物。根据本发明一个优选的实施方式，4)步骤具体包括以下步骤:将3)步骤所得的超临界萃取物溶于C1-C5的醇类或其水溶液，加热至20-100°C，搅拌0.5-10h，冷却到15-30°C，优选20-25°C进行抽滤，取滤液，将滤液在30-100°C下浓缩得到黄色油状流体，即油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物。根据本发明一个优选的实施方式，4)步骤中，C1-C5的醇类的体积浓度为1% -100%，优选 55% -80%，更优选 70% -80%，最优选 80%。根据本发明一个优选的实施方式，4)步骤中，C1-C5的醇类的体积与超临界萃取物的质量比为 15ml/g-250ml/g,优选 20ml/g-100ml/g,最优选 50ml/g。根据本发明一个优选的实施方式，所述C1-C5的醇类为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物。但是乙醇与其他几种溶剂相比低毒，防腐，污染小，价廉等特性更适于本工艺应用于工业化大生产，因此根据本发明一个优选的实施方式，所述C1-C5的醇类为乙醇。根据本发明一个优选的实施方式，所述HPLC-ELSD法的HPLC条件如下:I)取0.3g-0.Sg超临界萃取物，用甲醇、乙醇或乙腈溶解，定容至25ml容量瓶，过0.45 μ m膜待用；2)米用反相C18柱,流动相为乙腈和水,米用梯度洗脱。根据本发明一个优选的实施方式，所述HPLC-ELSD法的HPLC条件如下:采用反相C18柱最好选用YMC J’ sphere 0DS-H80系列柱子。根据本发明一个优选的实施方式，所述梯度洗脱为Omin时乙腈:水的体积比为40: 60，IOmin时乙腈:水的体积比为60: 40，20min时乙腈:水的体积比为80: 20，30min和35min时乙腈:水的体积比为100: O。根据本发明一个优选的实施方式,所述流动相的流速为0.6ml/min-l.20ml/min,最佳流速为1.00ml/min。根据本发明一个优选的实施方式，所述反相C18柱的柱温为20°C -40°C，优选35°C，柱体积优选为 4.6mmX 250mm, 4 μ m。根据本发明一个优选的实施方式，所述HPLC-ELSD法的ELSD条件如下:ELSD漂移管温度:75°C _95°C，最优温度85°C;ELSD气体:空气；ELSD气体流速:2.5L/min_3.5L/min，最优流速为3.0L/min。本发明所述的HPLC-ELSD法检测油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物的方法可检测到4种有效物质，亚麻酰胺，亚麻酸甘油酯，亚麻酸或棕榈酸。UV是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器，是HPLC中常用的一种检测器。因为对紫外吸收差的化合物如不含不饱和键的烃类等灵敏度很低，所以很少用UV作为检测脂肪酸及其衍生物的检测器，但是油菜蜂花粉中的脂肪酸及其衍生物和留醇类化合物正好在200nm-230nm有紫外吸收，经过反复实验验证在低波长下的吸收峰是油菜蜂花粉中有效物质吸收峰，而不是有流动相等溶剂引起的，所以确定了 UV是油菜蜂花粉中有效物质的一种检测方法，UV检测方法对环境温度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，可以检测到10-甲氧基-1-十七烷烯_4，6- 二炔基-3，9- 二醇，鲦油酸，二十碳二酸，12甲基-肉豆蘧酸甲酯，亚麻酸，油酸，漆树酸A，豆留醇阿魏酸酯。因此，本发明的另一个目的是提供另一种便捷，快速，灵敏度高的检测油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物的方法，所述方法包括:a)对待测油菜蜂花粉进行预处理，得到油菜蜂花粉提取物；b调HPLC-UV法(高效液相色谱-紫外检测器)检测油菜蜂花粉提取物中一种或多种脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物。其中所述a)步骤和上述HPLC-ELSD检测方法完全相同。所述HPLC-UV法的HPLC条件如下:I)取0.3g-0.Sg超临界萃取物，用甲醇，乙醇或乙腈溶解，定容至25ml容量瓶，过
0.45 μ m膜待用；2)采用反相C18柱，流动相为乙腈和酸水，采用梯度洗脱。根据本发明一个优选的实施方式，所述梯度洗脱为Omin时乙腈:酸水的体积比为60: 40，10min时乙腈:酸水的体积比为70: 30，20min时乙腈:酸水的体积比为80: 20,30min和50min时乙腈:酸水的体积比为90: 10，优选的洗脱梯度为Omin时乙腈:酸水的体积比为80: 20，IOmin和35min时乙腈:酸水的体积比为90: 10。根据本发明一个优选的实施方式，所述酸水选自磷酸，甲酸或乙酸的水溶液。根据本发明一个优选的实施方式，所述酸水的pH值为2-6.9，优选2.2。根据本发明一个优选的实施方式,所述流动相的流速为0.6ml/min-l.20ml/min,优选 1.00ml/min。根据本发明一个优选的实施方式，所述反相C18柱选自YMCJ’ sphere 0DS-H80系列柱，柱体积优选为4.6mmX 250mm, 4 μ m。根据本发明一个优选的实施方式，所述反相C18柱的柱温为20°C _40°C，最佳柱温为 35。。。根据本发明一个优选的实施方式，所述HPLC-UV法的UV检测波长为205nm_230nm，优选波长为210nm。本发明所述的HPLC-UV法检测油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或留醇类的方法可检测到8种有效物质，即10-甲氧基-1-十七烷烯-4，6- 二炔基-3，9- 二醇，鲦油酸，二十碳二酸，12甲基-肉豆蘧酸甲酯，亚麻酸，油酸，漆树酸A，豆留醇阿魏酸酯。本发明用HPLC-ELSD和HPLC-UV检测油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或甾醇类化合物的两种方法各有优点，总体都使得检测到的油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或甾醇类化合物种类增多，检测速度加快，检测灵敏度提高，精密度提高。
图1是HPLC-ELSD法检测油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物的HPLC谱图，其中I代表亚麻酸酰胺，2代表亚麻酸甘油酯，3代表亚麻酸，4代表棕榈酸。图2是HPLC-UV法检测油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物的HPLC谱图，八个峰依次为10-甲氧基-1-十七烷烯-4，6-二炔基-3，9-二醇，鲦油酸，二十碳二酸，12甲基-肉豆蘧酸甲酯，亚麻酸，油酸，漆树酸A，豆留醇阿魏酸酯。
具体实施例方式为了更好地理解本发明，通过以下实施例来说明:实施例1:油菜蜂花粉的预处理称取粉碎后的油菜蜂花粉(购自安徽宣城百康蜂业)7kg置于搅拌桶内，加蒸馏水28L，室温搅拌4小时后，置于离心机中以5000r/min离心20分钟，倾去上清液，制得浸膏9kg，将离心沉淀放置微波干燥器中(贵阳新奇微波工业有限责任公司)，干燥温度60°C，200min后干燥完成,耗电量97.7千瓦,排水5.12kg,干燥样品重3.88kg,干燥前后样品颜色基本无改变。将上述经微波真空干燥后的油菜蜂花粉粉碎并过60目筛后投入到IOL的萃取斧中，对萃取釜、分离釜1、分离釜II分别加热，并启动制冷剂制冷，控制萃取温度分别为50°C，萃取压力为35MPa，二氧化碳流量20L/h，分离I温度45°C，压力8MPa ;分离II温度35°C，压力4-6MPa，萃取时间为90min，在分离釜中得到超临界提取物0.776kg，萃取釜中剩余3.104kg超临界残渣，超临界提取物收率为20%。供试品溶液的制备:取2g超临界提取物，加入80%的乙醇溶液100ml，提取温度为40°C，提取时间为1.0h，密闭条件下，边加热边搅拌，实验结束均冷却到22°C进行抽滤。滤液分别在60°C浓缩成浸膏。将浸膏用甲醇溶解定容到IOOml容量瓶，将溶液通过0.45 μ m膜，取续滤液，续滤液即为供试品溶液。实施例2:HPLC-ELSD法检测油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物仪器:waters515 HPLC pumpALLTECH ELSD 2000柱子:YMCY sphere 0DS-H80 (4.6mmX 250mm, 4 μ m)；流动相:乙腈-水梯度洗脱(Omin:40: 60, IOmin:60: 40, 20min:80: 20,30min:100: 0,35min:100: O)；流动相流速:1.00ml/min ；柱温箱温度:35°C ;ELSD 漂移管温度:85°C ；ELSD气体:空气；ELSD 气体流速:3.0L/min ；1、线性关系实验:对照品溶液的制备:精密称取亚麻酸酰胺对照品14.47mg、亚麻酸甘油酯对照品
8.26mg、亚麻酸对照品39.85mg、棕榈酸对照品20.92mg置25ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得四个脂肪酸类化合物的混合标准品溶液。准确量取混合对照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0ml分别置于IOml容量瓶中，
用甲醇定容，配成梯度溶液，分别精密吸取6种梯度溶液20 μ L注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，以浓度(yg/ml)值(X)与峰面积值(Y)作图得标准曲线，数据经回归处理得回归方程。4种脂肪酸类化合物对照品的线性方程
权利要求
1.菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物的检测方法，其特征在于，所述方法包括: a)对待测油菜蜂花粉进行预处理，得到油菜蜂花粉提取物； b)用HPLC-ELSD法检测油菜蜂花粉提取物中一种或多种脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，a)步骤中所述预处理包括以下步骤: 1)提供油菜蜂花粉水洗离心后的沉淀； 2)用微波真空干燥上述沉淀； 3)进行超临界萃取，得到超临界萃取物； 4)用C1-C5的醇类或其水溶液提取上述超临界萃取物，得到油菜蜂花粉提取物。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述C1-C5的醇类为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物，优选乙醇。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC-ELSD法的HPLC条件如下: 1)取0.3g-0.Sg超临界萃取物，用甲醇、乙醇或乙腈溶解，定容至25ml容量瓶，过0.45 μ m膜待用； 2)米用反相C18柱，流动相为乙腈和水，米用梯度洗脱。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC-ELSD法梯度洗脱为Omin时乙腈:水的体积比为40: 60，IOmin时乙腈:水的体积比为60: 40,20min时乙腈:水的体积比为80: 20，30min和35min时乙腈:水的体积比为100: O。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.60ml/min-1.20ml/min,优选 1.00ml/mino
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述反相C18柱的柱温为200C -40°C，优选 35°C。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述反相C18柱选自YMCJ’ sphere0DS-H80系列柱，柱体积优选为4.6mmX 250mm, 4 μ m。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC-ELSD法的ELSD条件如下:ELSD漂移管温度:75°C -95°C，优选温度85°C ；ELSD气体:空气；ELSD气体流速:2.51/min-3.5L/min,优选流速为 3.0L/mino
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，b)步骤中所述脂肪酸类化合物和/或甾醇类化合物为亚麻酰胺，亚麻酸甘油酯，亚麻酸或棕榈酸。
11.菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物的检测方法，其特征在于，所述方法包括: a)对待测油菜蜂花粉进行预处理，得到油菜蜂花粉提取物； b)用HPLC-UV法检测油菜蜂花粉提取物中一种或多种脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物。
11、根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，a)步骤中所述预处理包括以下步骤: I)提供油菜蜂花粉水洗离心后的沉淀；2)用微波真空干燥上述沉淀； 3)进行超临界萃取，得到超临界萃取物； 4)用C1-C5的醇类或其水溶液提取上述超临界萃取物，得到油菜蜂花粉提取物。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述C1-C5的醇类为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物，优选乙醇。
13.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC-UV法的HPLC条件如下: 1)取0.3g-0.Sg超临界萃取物，用甲醇，乙醇或乙腈溶解，定容至25ml容量瓶，过0.45 μ m膜待用； 2)米用反相C18柱，流动相为乙腈和酸水，米用梯度洗脱。
14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱为Omin时乙腈:酸水的体积比为60: 40，IOmin时乙腈:酸水的体积比为70: 30，20min时乙腈:酸水的体积比为80: 20，30min和50min时乙腈:酸水的体积比为90: 10，优选的洗脱梯度为Omin时乙腈:酸水的体积比为80: 20，IOmin和35min时乙腈:酸水的体积比为90: 10。
15.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述酸水选自磷酸、甲酸或乙酸的水溶液。
16.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述酸水的pH值为2-6.9，优选2.2。
17.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.6ml/min-1.20ml/min,优选 1.00ml/mino
18.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述反相C18柱选自YMCJ’sphere0DS-H80系列柱，柱体积优选为4.6mmX 250mm, 4 μ m。
19.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述反相C18柱的柱温为200C _40°C，最佳柱温为35°C。
20.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述HPLC-UV法的UV检测波长为205nm-230nm，优选波长为 210nm。
21.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，b)步骤中所述脂肪酸类化合物和/或留醇类化合物为10-甲氧基-1-十七烷烯_4，6-二炔基_3，9-二醇，鲦油酸，二十碳二酸，12甲基-肉豆蘧酸甲酯，亚麻酸，油酸，漆树酸A，豆留醇阿魏酸酯。
全文摘要
油菜蜂花粉中脂肪酸类化合物和/或甾醇类化合物的检测方法，其特征在于，所述方法包括a)对待测油菜蜂花粉进行预处理，得到油菜蜂花粉提取物；b)用HPLC-ELSD和HPLC-UV法检测油菜蜂花粉提取物中多种脂肪酸类化合物和/或甾醇类化合物。本发明所述油菜蜂花粉长链脂肪酸及其衍生物和/或甾醇类化合物的检测方法的可控性强，能耗低，利于工业化生产。
文档编号G01N30/89GK103091406SQ20111034648
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者杨义芳, 韦洁, 杨必成 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院