与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，具体地说，涉及一种与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207及其应用。

背景技术：

小麦是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，历年种植面积分别占耕地面积的22％～30％，粮食作物总面积的22％～27％，主要分布在河南、河北、山东、山西、陕西、江苏、四川、安徽等省份；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22％，是我国约一半人口的主食，因此高产小麦品种的选育一直是育种家关注的重点。

小麦粮食产量主要由三大要素构成，产量＝穗数*穗粒数*粒重。分蘖是禾本科作物中最重要的组成成分之一，它影响着分蘖的发生和形成，从而最终影响粮食的产量(Kebrom et al.Grasses provide new insights into regulation of shoot branching.Trends Plant Sci.2013,18:41-48；Hussien et al.Genetics of tillering in rice and barley.Plant Genome.2014,7:1-20)。，同时又是单子叶植物的一种特殊的分枝现象，具有重要的研究意义。

小麦分蘖遗传研究总体进展相对缓慢，现阶段国内外工作主要围绕分蘖基因QTL的分子标记定位及其遗传效应开展。部分分蘖突变体由单基因控制，因而一些学者将其作为质量性状来研究(Richards RA.A tiller inhibition gene in wheat and its affect on plant growth.Austr J Agric Res.1988,39:749-757；Duggan BL,Richards RA,Tsuyuzaki H.Environmental effects on the expression of the tiller inhibition(tin)gene in wheat.Funct Plant Biol,2002,29:45–53)。同时，也有很多学者将分蘖作为多基因控制的数量性状来研究(Shaha MM,Gilla KS,Baenziger PS,Yen Y,Kaepplerc SM,Ariyarathne HM.Molecular mapping of loci for agronomic traits on chromosome 3A of bread wheat.Crop Sci.1999,39:1728-1732；谢玥，龙海，侯永翠，郑有良.小麦寡分蘖材料H461分蘖性状的遗传分析.麦类作物学报.2006,26:21-23；王岩.小麦永久F2群体构建及株高和分蘖特性的QTL定位.山东农业大学硕士学位论文,2009；温明星.望水白多分蘖、矮秆突变体的鉴定及相关QTL定位.南京农业大学硕士学位论文,2010；Jinpeng Zhang,Jun Wu,Weihua Liu,Xiang Lu,Xinming Yang,Ainong Gao,Xiuquan Li,Yuqing Lu,Lihui Li.Genetic mapping of a fertile tiller inhibition gene,ftin,in wheat.Mol Breeding.2013,31:441-449)。迄今为止，已报道的分蘖相关主效基因QTL位于1A，2A，3A，6A染色体，微效基因位于5A，3B，7B，1D、5D染色体，其中仅1A和3A上的tin基因研究较深入，完成了精细定位工作。

小麦材料H461相对于小麦品种川农16(国审品种)具有寡分蘖、多穗粒数、多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性(侯永翠，郑有良，蒲至恩，魏育明，李伟.穗数型小麦新品种川农16与大穗型寡分蘖品系H461遗传差异研究初报.四川农业大学学报.2003,21:94-9)，已定位到一个显著降低分蘖数量且稳定遗传的基因位于2D染色体长臂上(Wang,Zhiqiang,et al."Identification and validation of novel low-tiller number QTL in common wheat."Theoretical and Applied Genetics 129.3(2016):603-612.)。利用杂合自交家族法，结合表型和基因型成功创制Ltn3近等基因系B95-1/B95-2，近等基因系杂交构建次级F2群体，开发目标区间内的多态性分子标记，进一步缩小基因区间，寻找共分离的分子标记，促进分蘖基因的图位克隆，同时为小麦特异分蘖材料的创制及株型育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强分蘖预测的准确性，提高株型育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。

分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)，可在广泛的基因组DNA样品中，对SNP和特定位点上的Indel进行精准的双等位基因检测。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与分蘖基因共分离的，且适用于荧光定量PCR平台KASP技术的分子标记，不仅能对小麦分蘖基因进行选择，有效调控小麦分蘖发生，塑造合理的分蘖发生群体，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207，标记R207位于小麦2D染色体长臂上，核苷酸序列如下：5’-GGCATCTACATTCGCGTTCNTGCCTGCAGCGGTCAGTCTGATCACCAG-3’；其中，N为C或T。

本发明还提供所述分子标记R207在小麦育种中的应用。

本发明还提供所述分子标记在鉴定寡分蘖小麦品种中的应用。包括以下步骤：

1)提取待测小麦的基因组DNA；

2)以待测小麦的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR产物，进行基因分型。

其中，步骤2)的引物序列如下：

R207-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3’；

R207-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3’；

R207-3:5’-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3’；

并且，引物R207-1和R207-2的5’端分别连有不同的荧光探针；

所述荧光探针的序列如下：

F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)

H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)

荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物R207-1、R207-2和R207-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物R207-1、R207-2和R207-3按2:2:5体积比混合。

荧光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。

步骤3)分析PCR产物的具体方法如下：

含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461相同的荧光信号，而不含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的荧光信号。

本发明还提供一套基于KASP技术检测所述分子标记R207的引物组合，所述引物组合包括：

R207-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3’；

R207-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3’；

R207-3:5’-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3’；

并且，引物R207-1和R207-2的5’端分别连有不同的荧光探针；

所述荧光探针的序列如下：

F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)

H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)

本发明还提供所述引物组合在小麦分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记的方法，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型，将与近等基因系-寡分蘖植株分为同一类型的植株鉴定为含有小麦寡分蘖基因Ltn3的植株。

本发明还提供所述分子标记R207在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因为寡分蘖基因Ltn3。

本发明还提供上述方法在小麦品种改良中的应用。

本发明首次公开了基于竞争性等位基因特异性PCR(KASP)平台精确检测小麦H461寡分蘖基因Ltn3的分子标记R207，其为共显性标记，检测准确高效，通量高，扩增方便稳定。

本发明提供的分子标记R207与寡分蘖基因Ltn3共分离，可用于分子标记辅助选择，检测结果表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦寡分蘖基因，预测小麦的分蘖特性，进而方便进行分子设计育种。利用本发明提供的分子标记及检测方法能够加强分蘖预测的准确性，提高特异株型育种的成功率，加速实现增加小麦单产的目标。

附图说明

图1为本发明实施例1中小麦寡分蘖基因Ltn3在2D染色体上的位置及与分子标记R207之间的连锁遗传图谱。

图2为本发明实施例1中B95-1×B95-2的部分次级F2群体植株用KASP引物做基因型分型的结果。

图3为本发明实施例1中次级F2群体的重组子鉴定及基因Ltn3定位情况。

图4为本发明实施例2中利用基于KASP设计的引物，对B95-1、B95-2、F1、H461、川农16及川麦107做基因型分型的检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1小麦寡分蘖基因Ltn3及分子标记R207的获得

本发明与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207是通过以下方法获得的：

(1)利用近等基因系寡分蘖小麦B95-1作为父本本，以近等基因系多分蘖小麦B95-2为母本本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，获得含有986个单株的次级F2群体。

(2)用CTAB法提取所述的亲本，F1植株和次级F2群体的各单株的DNA，从数据库http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index下载获得目标区间内scaffold序列信息，设计测序引物对亲本B95-1和B95-2进行DNA扩增测序，通过DNAMAN 6.0对测序结果进行比对，寻找差异位点，对差异位点进行KASP分子标记开发。获得亲本B95-1的带型记为A，亲本B95-2的带型记为B，F1植株的带型记为H。

(3)小麦成熟期田间鉴定所述次级F2群体植株的分蘖数。

(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述次级F2群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序。

(5)设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用DNAMAN 6.0软件设计荧光定量PCR引物7对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～25bp，扩增产物长度45-60bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：

正向引物1：F探针+扩增引物序列

正向引物2：H探针+扩增引物序列

反向引物：扩增引物序列

F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)

H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)

表1 7对KASP引物序列及扩增片段长度

(6)竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分析

a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的7对引物，以亲本B95-1和B95-2的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，命名为R207-1/2/3(核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2-4所示)。扩增产物为具有多肽性的分子标记R207，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

b)次级F2群体的KASP分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记R207的PCR引物，扩增亲本B95-1、B95-2和次级F2群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本B95-1的类型记为A，扩增片段大小长47bp，单碱基差异位点为C。亲本B95-2的类型记为B，扩增片段长47bp，单碱基差异位点为T。次级F2群体株系类型来源于B95-1的记为A，来源于B95-2的记为B，杂合记为H。

c)遗传连锁图谱的构建：根据分子标记R207的鉴定数据，结合已开发的其他分子标记的基因分型数据，用作图软件JoinMap 4.0构建遗传高密度图谱。并结合次级F2群体分蘖表型数据定位寡分蘖基因Ltn3与R207共分离。

小麦寡分蘖基因Ltn3在2D染色体上的位置及与分子标记R207之间的连锁遗传图谱见图1。

B95-1×B95-2的部分次级F2群体植株用KASP引物做基因型分型的结果见图2。

次级F2群体的重组子鉴定及基因Ltn3定位情况见图3。

实施例2与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207的应用

基于KASP检测平台技术设计引物，对B95-1、B95-2、F1、H461、川农16及川麦107做基因型分型检测。

1、提取待测小麦三叶期的叶片基因组DNA；

2、以待测小麦的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；

3、采用荧光检测仪分析PCR产物，进行基因分型。

其中，步骤2的引物序列如下：

R207-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3’；

R207-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3’；

R207-3:5’-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3’；

并且，引物R207-1和R207-2的5’端分别连有不同的荧光探针；

所述荧光探针的序列如下：

F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)

H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)

荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物R207-1、R207-2和R207-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物R207-1、R207-2和R207-3按2:2:5体积比混合。

荧光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。

分析PCR产物的具体方法如下：

含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461相同的荧光信号，而不含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的荧光信号。基因型分型结果见图4。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207及其应用

<130> KHP161119103.5Q

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 小麦

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n为c或t

<400> 1

ggcatctaca ttcgcgttcn tgcctgcagc ggtcagtctg atcaccag 48

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tggcatctac attcgcgttc c 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tggcatctac attcgcgttc t 41

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctggtgatca gactgaccgc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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