一种促进机体冷习服能力的单体药物的提取方法及应用与流程

本发明属于中药活性物质提取领域，具体涉及附子中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取工艺及耐寒作用。

背景技术：

附子为毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根。附子具有补火助阳、逐风寒湿邪之功效。主治亡阳虚脱、肢冷脉微、阳痿、宫冷、心腹冷痛、虚寒吐泻、阴寒水肿、寒湿痹痛等。2012年成都中医药大学耿昭在《附子的化学成分研究》的硕士论文中首次报道了从附子中分离出反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，报道称该物质为白色胶状物，易溶于水、甲醇，难溶于氯仿，分离工艺是在正丁醇部分中经氯仿、甲醇混合溶剂洗脱得到，该文献记载5.5kg附子分离得到8mg反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，收率仅0.000145％，分离过程较难重现。2013年成都中医药大学李小红、郭力等在《附子的化学成分研究》(中国实验方剂学杂志，2013,19(19)86-89)报道了从附子中分离出反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，称该物质为无色针状结晶，分离工艺是95％乙醇回流提取，再经硅胶柱层析分离精制得到，该文献记载5kg附子分离得到100mg反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，收率仅为0.002％。

反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷，CAS号：117405-51-3，分子式：C₁₆H₂₀O₉，分子量：356.3，结构式如下：

耐寒性指耐受寒冷而能生存的特性。组织液和细胞液等处于冰点以下的温度时，生物表现其耐寒性必须具有高的耐过冷的能力或具有高的耐冻性。目前，尚未见到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷与动物耐寒有直接关联的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种促进机体冷习服能力的单体药物的提取方法及应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

将附子原料药粉碎、过筛，得附子粉末，将附子粉末与95％乙醇混合后进行回流提取，得浸提液；将浸提液减压浓缩，得浸膏；将浸膏经中等极性溶剂萃取得反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品，将反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品依次经过硅胶柱层析、反相硅胶柱层析分离后进行重结晶，得到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷。

所述附子原料药选自生附子。

所述附子粉末为30～40目。

所述95％乙醇的用量为每1kg附子原料药使用12～16L。

所述回流提取进行2～3次，每次1～2小时，回流温度控制为75～79℃。

所述硅胶柱层析的条件包括：硅胶粒径为300～400目，等度洗脱，流动相为乙醇与水的混合溶剂(乙醇体积分数85～95％)；所述反相硅胶柱层析的条件包括：硅胶柱为反相C18硅胶柱，等度洗脱，流动相为乙腈与水的混合溶剂(乙腈体积分数为5～15％)。

所述中等极性溶剂萃取具体包括以下步骤：将浸膏与水混合后用NaOH进行碱化，然后用三氯甲烷或二氯甲烷萃取，上层水相冷冻干燥，得反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品。

所述重结晶具体包括以下步骤：将反相硅胶柱层析的洗脱液冷冻干燥后用水溶解，然后用HCl调pH至5～6后静置沉淀(4～10℃)，分离沉淀得到粗结晶，将粗结晶用水溶解后静置沉淀(4～10℃)，将沉淀真空干燥，得到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明提出的提取方法，通过优化提取分离工艺，使得附子中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取效率从文献的0.000145％、0.002％，提高到本发明的0.2827％。本发明首次发现并揭示了反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷具有促进机体冷习服的的作用，可在制备提高机体耐寒能力的药物中应用。

附图说明

图1是提取的反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的质谱图谱；其中，(a)为钠谱，(b)为氢谱。

图2是提取的反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的红外图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例是对本发明的解释，而不是限定。

(一)附子中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取工艺

1、仪器、材料与试剂

附子药材(生附子)于2016年5月购自安国药材市场，产地四川江油(批号：20160508)，经陕西中药研究所鉴定为毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根。

反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷对照品(山东博洛德生物科技公司，批号：AWSTG20160612，纯度99.5％)。

硅胶(300～400目，青岛海洋化工公司)。

反相C18硅胶柱(75m，日本Cosmosil公司)。

乙腈、甲醇(色谱纯，上海化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯。

高效液相色谱仪系统：LC-20AD输液泵、SPD-M20A紫外检测器、CTO-20A柱温箱、LC-Solution色谱工作站(日本岛津公司)；ODS色谱柱(C18-AR-Ⅱ，4.6mm×250mm，日本Cosmosil公司)。

ME215S型电子天平(德国Starorious公司)；UV-2600紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；BP-Purifier-100制备中压液相系统(苏州利穗有限公司)；C18填料(75m，日本Cosmosil公司)；400MHz核磁共振仪(美国Bruker公司)。

2、方法

2.1 反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷液相分析(HPLC)条件

流动相：水:甲醇:0.05％磷酸(体积比66:24:10)

流速：1.0mL/min

柱温：30℃

检测波长：290nm

进样量：10μL

2.2 提取与分离

2.2.1 反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的提取

称取附子药材(生附子)，粉碎，过40目筛，将40目粗粉3980g用95％乙醇(即体积分数95％的乙醇水溶液)回流提取2次(每次2h，放冷，滤过)，95％乙醇用量按照1kg附子药材计为12L，回流温度控制在75～79℃，合并2次滤液，在65℃下减压浓缩回收乙醇，得到反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷醇浸膏，浸膏收率10.04％。

HPLC检测其中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的含量，醇浸膏中反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷含量为2.819％。

2.2.2 反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的硅胶柱精制

2.2.2.1 醇浸膏精制

将醇浸膏用水溶解(例如膏:水质量比＝0.8:1)，用NaOH调至呈碱性(例如pH＝10)，中等极性溶剂(例如三氯甲烷)萃取3次，下层浓缩得总生物碱，上层水相冷冻干燥，得反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品。

2.2.2.2 硅胶分离

取300～400目硅胶100g，装入中压柱(15cm×2.5cm)，柱体积70mL，将反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷粗品1.0g硅胶拌样，上样后以95％乙醇等度洗脱，流速为50mL/min，检测波长为290nm，每50mL接收一瓶，收集第30分钟到第60分钟的洗脱液，低温(40～60℃)浓缩得膏状物。

2.2.2.3 反相硅胶分离

取反相C18硅胶柱(15cm×2.5cm)，将2.2.2.2制备的膏状物上柱，体积分数11％乙腈水溶液等度洗脱，流速为50mL/min，检测波长为290nm。每50mL收集一瓶，收集第15分钟到第30分钟的洗脱液，HPLC检测其反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的含量，得率为0.2827％。收集目标物即洗脱液，低温(40～60℃)浓缩尽量除去溶剂后冷冻干燥，室温下，加3～5倍质量蒸馏水溶解，用HCl调pH至5～6(此处对于pH有严格要求，否则无法形成结晶析出)，重结晶(4℃冰箱内静置)，滤过，室温下，粗结晶再用5倍质量蒸馏水溶解，重结晶(4℃冰箱内静置)，滤过，真空干燥(40～60℃)，最终样品经过鉴定为反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷(参见图1以及图2)，纯度为99.8％。

(二)反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷的耐寒作用研究

1、材料与方法

1.1 实验动物

昆明系雄性健康小鼠18g～22g，由中国人民解放军第四军医大学实验动物繁育场提供。

1.2 实验样品资料

1^#样品：附子药材(生附子)40目粗粉(去离子水配成溶液)；

2^#样品：附子药材(生附子)95％乙醇提取物(干燥成粉，用去离子水配成溶液)；

3^#样品：附子药材(生附子)水煎煮提取物(干燥成粉，用去离子水配成溶液)；

4^#样品：附子药材(生附子)醇浸膏硅胶柱层析洗脱物(干燥成粉，用去离子水配成溶液)；

5^#样品：反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷对照品(去离子水配成溶液)；

6^#样品：空白对照(去离子水)。

1.3 小鼠耐寒实验

昆明系雄性健康小鼠18g～22g，随机分组，每组12只，连续灌胃给药，以生附子原粉当量折算，剂量为0.003g/kg/d，1～5组小鼠分别给予上述1^#～5^#号样品，空白对照组小鼠给予等体积去离子水。动物4℃环境暴露，同时给药期间正常饮水饮食，连续给药5天后，在-10℃观察小鼠冻亡时间(禁水禁食)，结果见表1。

2、结果与分析

表1.小鼠耐寒实验测定结果

参见表1，2、4、5组小鼠在-10℃条件存活时间分别是54.5±6.3、63.7±4.9、74.6±5.7，与空白对照组(或第1组)相比均有明显统计学差异，分别是P<0.01，即2、4、5组小鼠较空白对照组(或第1组)小鼠存活时间极显著的延长。第5组与第2、4组相比，小鼠存活时间明显延长，差异有统计学意义，P＜0.05。

3、结论

附子中分离得到的反式阿魏酸-4-β-葡萄糖苷具有促进动物(特别是哺乳动物)冷习服，增加机体耐寒能力的作用。