本发明属多肽化学领域，特别涉及一种西曲瑞克的固相制备方法。
背景技术：
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西曲瑞克是德国astamedica公司研制的一种lhrh拮抗剂，能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕。大量研究表明，西曲瑞克对卵巢癌、前列腺癌、子宫纤维瘤、子宫内膜异位等疾病有较好的疗效，而且对良性前列腺肥大和卵巢过度刺激综合征有预防和改善作用。西曲瑞克的结构为十肽:ac-d-2-nal-d-4-cl-phe-d-3-pal-ser-tyr-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-nh2；其结构式如下式所示：
西曲瑞克的制备采用化学法合成。
专利cn101863960b采用王树脂和boc策略合成西曲瑞克，存在问题是：每一步采用tfa脱boc均会使部分多肽被切除，导致产率下降。pd/h2脱除侧链保护基需要特殊装置，增加危险性。专利cn101284863b使用侧链无保护的cit，会导致杂质[d-cit(ac)]-西曲瑞克的产生。专利cn104086632a采用侧链用dde保护的鸟氨酸为原料，避免了[d-cit(ac)]-西曲瑞克的产生，但是由鸟氨酸转变为cit则需要繁琐的操作，增加生产成本。
专利cn104610433a采用ac-d-2-nal-oh为原料，省略了乙酰化操作，避免了杂质[d-cit(ac)]-西曲瑞克的产生。但是采用切割试剂脱除侧链保护基的同时，多肽也将从树脂上被切割到溶液中，保护基及切割试剂产生的杂质将提高纯化的难度。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种简便、高效的西曲瑞克制备方法，解决目前西曲瑞克制备繁琐、合成及酸解时副反应多的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种西曲瑞克的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备fmoc-d-ala-树脂复合物：用二甲基甲酰胺溶解c端氨基酸fmoc-d-ala-oh及酯化试剂后，加入到用二甲基甲酰胺浸泡处理后的树脂中进行酯化反应，反应结束后，用二甲基甲酰胺洗涤树脂，得到fmoc-d-ala-树脂复合物；
(2)制备保护的西曲瑞克-树脂复合物：向步骤(1)得到的fmoc-d-ala-树脂复合物中加入fmoc脱保护试剂进行fmoc脱保护反应，反应结束后过滤并用二甲基甲酰胺洗涤树脂，然后向脱保护的fmoc-d-ala-树脂复合物中加入西曲瑞克的c端第二个氨基酸和缩合试剂进行缩合反应，缩合反应结束后用二甲基甲酰胺洗涤树脂；按照西曲瑞克从c端到n端的顺序，更换氨基酸，重复fmoc脱保护反应和缩合反应，得到保护的西曲瑞克-树脂复合物；
(3)制备脱保护的西曲瑞克-树脂复合物：向保护的西曲瑞克-树脂复合物中加入切割试剂，脱除多肽侧链保护基；反应结束后过滤，并加入洗涤溶剂洗涤树脂，过滤，得到脱保护的西曲瑞克-树脂复合物；
(4)制备西曲瑞克粗品：向脱保护的西曲瑞克-树脂复合物中加入氨解试剂，反应结束后，过滤，收集滤液，旋蒸后得到西曲瑞克粗品；
(5)制备西曲瑞克精品：采用反相高效液相色谱分离纯化西曲瑞克粗品，得到西曲瑞克精品。
步骤(1)中所述的树脂为merrifield树脂、羟甲基树脂、4-羟甲基苯乙酰胺甲基树脂或4-羟甲基苯甲酰胺甲基树脂。
步骤(1)中所述的酯化试剂包含n,n-二环己基碳二亚胺和n,n-二异丙基碳二亚胺中的任意一种以及1-羟基苯并三氮唑和二甲氨基吡啶；
所述的fmoc-d-ala-oh、n,n-二环己基碳二亚胺和n,n-二异丙基碳二亚胺两者中的任意一种以及1-羟基苯并三氮唑的物质的量的比例为1：1.2～1：1.2～1；所述的fmoc-d-ala-oh与树脂的物质的量的比例为7～3：1；所述的二甲氨基吡啶与树脂的物质的量的比例为0.5～0.1：1；所述酯化反应的温度为20℃～60℃，反应时间为3小时～20小时。
步骤(2)中所述的fmoc脱保护试剂是体积比为1：1～4的哌啶与二甲基甲酰胺，所述fmoc脱保护反应的温度为20℃～60℃，反应时间为10min～60min。
步骤(2)中所述的氨基酸依次分别为：n-芴甲氧羰酰基-脯氨酸，n-芴甲氧羰-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸，n-芴甲氧羰酰基-亮氨酸，n-芴甲氧羰酰基-d-瓜氨酸盐酸盐，n-芴甲氧羰酰基-o-叔丁基-酪氨酸，n-芴甲氧羰酰基-o-叔丁基-丝氨酸，n-芴甲氧羰酰基-d-3-吡啶-丙氨酸，n-芴甲氧羰酰基-d-4-氯-苯丙氨酸，以及乙酰基-d-3-(2-萘基)-丙氨酸。
步骤(2)中所述缩合试剂的组分为以下(1)和(2)两种情况中的任意一种：
(1)所述的缩合剂为缩合试剂1和缩合试剂2的组合；其中，缩合反应时各试剂的物质的量的比例为：氨基酸：缩合试剂1：缩合试剂2：树脂＝6～3：6～3：6～3：1；
(2)所述的缩合剂为缩合试剂4、缩合试剂2和缩合试剂3的组合；其中，缩合反应时各试剂的物质的量的比例为：氨基酸：缩合试剂4：缩合试剂2：缩合试剂3：树脂＝6～3：6～3：6～3：12～6：1；
所述的缩合试剂1为n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)或n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)；
所述的缩合试剂2为1-羟基苯并三氮唑(hobt)或n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat)；
所述的缩合试剂3为二异丙基乙胺(diea)；
所述的缩合试剂4为苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、卡特缩合剂(bop)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(pybop)；
所述缩合反应的温度为20℃～60℃，反应时间为1小时～4小时。
步骤(3)中所述的切割试剂为重蒸水、三乙基硅烷、1,2二硫苏糖醇、苯酚、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、苯甲醚和乙二硫醇中的至少一种与三氟乙酸的混合液，所述的混合液中三氟乙酸的体积比不小于80％；向保护的西曲瑞克-树脂复合物中加入切割试剂进行反应的温度为0℃～60℃，反应时间为1小时～4小时。
步骤(3)中所述的洗涤溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、水中的一种。
步骤(4)中所述的氨解试剂为氨的饱和水溶液或饱和四氢呋喃溶液，所述反应的条件为：0℃～30℃下反应1小时～24小时。
步骤(5)中所述的纯化条件为：制备柱填料为碳载硅胶类型，流动相为含0.1％(w/w)tfa的水、含0.1％(w/w)tfa的乙腈和含0.1％(w/w)tfa的甲醇中的一种或几种。
本发明优选技术方案的详细步骤为：
(1)制备fmoc-d-ala-树脂复合物
向带有过滤装置的反应容器中加入树脂。向所述容器中加入溶剂dmf，浸没树脂，静置1小时，过滤。
用dmf溶解fmoc-d-ala-oh和酯化试剂后，加入到树脂中，在20℃～60℃下反应3h～20h。反应结束后，过滤并加入溶剂dmf，洗涤树脂三遍，过滤。所述的酯化试剂包含dcc(或dic)、hobt和dmap，其中各反应物物质的量之比为n(fmoc-d-ala-oh)：n(dcc或dic)：n(hobt)＝1：1.2～1：1.2～1；n(fmoc-d-ala-oh)：n(树脂)＝7～3：1；n(dmap)：n(树脂)＝0.5～0.1：1。
(2)制备保护的西曲瑞克-树脂复合物
在上述的fmoc-d-ala-树脂复合物中加入体积比为1：1～4的pip/dmf溶液，进行脱保护反应，20℃～60℃下反应10min～60min。反应完毕后，过滤。然后加入dmf洗涤树脂，过滤。
向反应器中加入西曲瑞克的c端第二个氨基酸(fmoc-pro-oh)和缩合试剂。20℃～60℃下反应1h～4h。反应结束后加入dmf洗涤树脂，过滤。所述缩合试剂的组分为以下(1)和(2)两种情况中的任意一种：(1)所述的缩合剂为缩合试剂1和缩合试剂2的组合；其中，缩合反应时各试剂的物质的量的比例为：n(fmoc-pro-oh)：n(缩合试剂1)：n(缩合试剂2)：n(树脂)＝6～3：6～3：6～3：1；(2)所述的缩合剂为缩合试剂4、缩合试剂2和缩合试剂3的组合；其中，缩合反应时各试剂的物质的量的比例为：n(fmoc-pro-oh)：n(缩合试剂4)：n(缩合试剂2)：n(缩合试剂3)：n(树脂)＝6～3：6～3：6～3：12～6：1；
所述的缩合试剂1为n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)或n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)；所述的缩合试剂2为1-羟基苯并三氮唑(hobt)或n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat)；所述的缩合试剂3为二异丙基乙胺(diea)；所述的缩合试剂4为苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、卡特缩合剂(bop)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(pybop)；
按照西曲瑞克c端到n端的顺序，更换氨基酸，循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的西曲瑞克-树脂复合物。其中所述的反应物物质的量之比以及反应条件同于fmoc-pro-oh。其中所述的氨基酸为：fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-d-cit-oh，fmoc-tyr(tbu)-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-d-cpa-oh，fmoc-d-phe(4-cl)-oh，ac-d-2-nal-oh。
(3)制备脱保护的西曲瑞克-树脂复合物
在上述树脂中加入切割试剂，反应条件为0℃～60℃下反应1小时～4小时。所述的切割试剂为重蒸水、三乙基硅烷、1,2二硫苏糖醇、苯酚、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、苯甲醚和乙二硫醇中的至少一种与三氟乙酸的混合液，混合液中三氟乙酸的体积比不小于80％。反应完后过滤，并加入洗涤溶剂(水、thf、dcm)洗涤树脂，过滤。
(4)制备西曲瑞克粗品
向脱保护的西曲瑞克-树脂复合物中加入氨的饱和水溶液或氨的饱和四氢呋喃溶液，0℃～30℃下反应1小时～24小时。反应结束后，过滤，收集滤液，旋蒸后得到保护的西曲瑞克粗品。
(5)制备西曲瑞克精品
将西曲瑞克粗品用体积比为5％的甲醇水溶液或5％的乙腈水溶液溶解，采用制备型高效液相色谱纯化，得到西曲瑞克精品。制备柱为c4/c8/c18类型反相色谱柱，流动相为含0.1％tfa的水、含0.1％tfa的乙腈和含0.1％tfa的甲醇中的一种或几种。
本发明采用merrifield树脂、羟甲基树脂、4-羟甲基苯乙酰胺甲基树脂或4-羟甲基苯甲酰胺甲基树脂中的任意一种为固相载体，可以在固相上脱除侧链保护基，通过洗涤的方式除去保护基杂质以及切割试剂引入的杂质，降低纯化的难度；并且采用ac-d-2-nal-oh为原料，省略了乙酰化操作，避免了杂质[d-cit(ac)]-西曲瑞克的产生。
本发明的有益效果是：
本发明采用merrifield树脂、羟甲基树脂、4-羟甲基苯乙酰胺甲基树脂或4-羟甲基苯甲酰胺甲基树脂中的一种为固相载体，可以在固相上脱除侧链保护基，通过洗涤的方式除去保护基杂质以及切割试剂引入的杂质，降低纯化的难度；并且采用ac-d-2-nal-oh为原料，省略了乙酰化操作，避免了杂质[d-cit(ac)]-西曲瑞克的产生。
本发明中一些常用的缩写具有如下含义：
fmoc:芴甲氧羰酰基
tfa：三氟乙酸
edt：乙二硫醇
phenol：苯酚
thioanisole：苯甲硫醚
tes：三乙基硅烷
tis：三异丙基硅烷
dtt：1,2二硫苏糖醇
anisole：苯甲醚
meoh：甲醇
dcm：二氯甲烷
dmf：n,n-二甲基甲酰胺
pip：哌啶
cetrerelix：西曲瑞克
pamresin：4-羟甲基苯乙酰胺甲基树脂
hmbaresin：4-羟甲基苯甲酰胺甲基树脂
dmap：二甲氨基吡啶
diea：n,n-二异丙基乙胺
bop：卡特缩合剂
hobt:1-羟基苯并三氮唑
dic：n,n-二异丙基碳化二亚胺
dcc：n,n-二环己基碳二亚胺
hoat：n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
hbtu：苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯
hatu：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯
pybop：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
fmoc-d-ala-oh：n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸
fmoc-pro-oh：n-芴甲氧羰酰基-脯氨酸
fmoc-arg(pbf)-oh：n-芴甲氧羰-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸
fmoc-leu-oh：n-芴甲氧羰酰基-亮氨酸
fmoc-d-cit-oh：n-芴甲氧羰酰基-d-瓜氨酸盐酸盐
fmoc-tyr(tbu)-oh：n-芴甲氧羰酰基-o-叔丁基-酪氨酸
fmoc-ser(tbu)-oh：n-芴甲氧羰酰基-o-叔丁基-丝氨酸
fmoc-d-cpa-oh：n-芴甲氧羰酰基-d-3-吡啶-丙氨酸
fmoc-d-phe(4-cl)-oh：n-芴甲氧羰酰基-d-4-氯-苯丙氨酸
ac-d-2-nal-oh：乙酰基-d-3-(2-萘基)-丙氨酸
具体实施方式
本发明通过以下实例作进一步举例说明，这些实例不应解释为对本发明的限制。实施例1：制备西曲瑞克
(1)制备fmoc-d-ala-树脂复合物
向带有过滤装置的反应器中加入hmbaresin(1.0mmol/g)1g，注入10mldmf，静置1h，过滤。
取4mmolfmoc-d-ala-oh，4mmoldic，4mmolhobt及0.2mmoldmap，溶于10mldmf中并过滤，然后将所得滤液加入到反应器中，30℃下反应10h。反应结束后，过滤。然后加入10mldmf，洗涤树脂三遍，过滤。
(2)制备保护的西曲瑞克-树脂复合物
向反应器中加入10ml体积比为1：4的pip/dmf溶液，30℃下反应30min。反应完毕后，过滤。然后加入10mldmf洗涤树脂三遍，过滤。
取4mmolfmoc-pro-oh，4mmoldic，4mmolhobt，溶于10mldmf中，将所得溶液加入到反应器中，30℃下反应2h。反应结束后，过滤。然后加入10mldmf，洗涤树脂三遍，过滤。
所述的各试剂的物质的量的比例为：氨基酸：dic：hobt：树脂＝4：4：4：1；所述缩合反应的温度为30℃，反应时间为2小时。
按照西曲瑞克c端到n端的顺序，更换氨基酸，分别为：fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-d-cit-oh，fmoc-tyr(tbu)-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-d-cpa-oh，fmoc-d-phe(4-cl)-oh，ac-d-2-nal-oh。循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的西曲瑞克-树脂复合物。
(3)制备脱保护的西曲瑞克-树脂复合物
向上述保护的西曲瑞克-树脂复合物中加入10ml切割试剂(按体积百分含量计，tfa:phenol:thioanisole:edt:h2o＝82.5％:5％:5％:2.5％:5％)，20℃下反应2h。过滤，然后加入10mldcm，洗涤树脂三遍，过滤。
(4)制备西曲瑞克粗品
向上述的西曲瑞克-树脂复合物中加入10ml氨的饱和thf溶液，0℃下反应10h。反应结束后，过滤。然后加入10ml氨的饱和thf溶液，洗涤树脂三遍，过滤。旋蒸滤液得到保护的西曲瑞克粗品。
(5)制备西曲瑞克精品
将西曲瑞克粗品溶于体积比为5％的乙腈水溶液中，经高效液相色谱纯化得到西曲瑞克精品，冷冻干燥后得0.781g，纯度为98.9％。制备条件为：c18制备柱，两种流动相分别为含0.1％(w/w)tfa的水、含0.1％(w/w)tfa的乙腈。
实施例2：制备西曲瑞克
(1)制备fmoc-d-ala-树脂复合物
向带有过滤装置的反应器中加入pamresin(1.0mmol/g)1g，注入10mldmf，静置1h，过滤。
取3mmolfmoc-d-ala-oh，3mmoldic，3mmolhobt及0.1mmoldmap，溶于10mldmf中并过滤，然后将所得滤液加入到反应器中，20℃下反应3h。反应结束后，过滤。然后加入10mldmf，洗涤树脂三遍，过滤。
(2)制备保护的西曲瑞克-树脂复合物
向反应器中加入10ml体积比为1：3的pip/dmf溶液，20℃下反应10min。反应完毕后，过滤。然后加入10mldmf洗涤树脂三遍，过滤。
取3mmolfmoc-pro-oh，3mmolhbtu，3mmolhobt及6mmoldiea，溶于10mldmf中，将所得溶液加入到反应器中，20℃下反应1h。反应结束后，过滤。然后加入10mldmf，洗涤树脂三遍，过滤。
按照西曲瑞克c端到n端的顺序，更换氨基酸，分别为：fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-d-cit-oh，fmoc-tyr(tbu)-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-d-cpa-oh，fmoc-d-phe(4-cl)-oh，ac-d-2-nal-oh。循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的西曲瑞克-树脂复合物。
(3)制备脱保护的西曲瑞克-树脂复合物
向上述保护的西曲瑞克-树脂复合物中加入10ml切割试剂(按体积百分含量计，tfa:phenol:h2o＝90％:5％:5％)，20℃下反应1h。过滤，然后加入10mlthf，洗涤树脂三遍，过滤。
(4)制备西曲瑞克粗品
向上述的西曲瑞克-树脂复合物中加入10ml氨的饱和水溶液，0℃下反应5h。反应结束后，过滤。然后加入10ml氨的饱和水溶液，洗涤树脂三遍，过滤。旋蒸滤液得到保护的西曲瑞克粗品。
(5)制备西曲瑞克精品
将西曲瑞克粗品溶于体积比为5％的甲醇水溶液中，经高效液相色谱纯化得到西曲瑞克精品，冷冻干燥后得0.612g，纯度为98.7％。制备条件为：c8制备柱，两种流动相分别为含0.1％(w/w)tfa的水、含0.1％(w/w)tfa的甲醇。
实施例3：制备西曲瑞克
(1)制备fmoc-d-ala-树脂复合物
向带有过滤装置的反应器中加入羟甲基树脂(1.0mmol/g)1g，注入10mldmf，静置1h，过滤。
取7mmolfmoc-d-ala-oh，7mmoldic，7mmolhobt及0.5mmoldmap，溶于10mldmf中并过滤，然后将所得滤液加入到反应器中，60℃下反应20h。反应结束后，过滤。然后加入10mldmf，洗涤树脂三遍，过滤。
(2)制备保护的西曲瑞克-树脂复合物
向反应器中加入10ml体积比为1：1的pip/dmf溶液，60℃下反应60min。反应完毕后，过滤。然后加入10mldmf洗涤树脂三遍，过滤。
取6mmolfmoc-pro-oh，6mmolpybop，6mmolhobt及12mmoldiea，溶于10mldmf中，将所得溶液加入到反应器中，60℃下反应4h。反应结束后，过滤。然后加入10mldmf，洗涤树脂三遍，过滤。
按照西曲瑞克c端到n端的顺序，更换氨基酸，分别为：fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-d-cit-oh，fmoc-tyr(tbu)-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-d-cpa-oh，fmoc-d-phe(4-cl)-oh，ac-d-2-nal-oh。循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的西曲瑞克-树脂复合物。
(3)制备脱保护的西曲瑞克-树脂复合物
向上述保护的西曲瑞克-树脂复合物中加入10ml切割试剂(按体积百分含量计，tfa:phenol:thioanisole:h2o＝90％:5％:5％)，60℃下反应4h。过滤，然后加入10ml水，洗涤树脂三遍，过滤。
(4)制备西曲瑞克粗品
向上述的西曲瑞克-树脂复合物中加入10ml氨的饱和水溶液，30℃下反应24h。反应结束后，过滤。然后加入10ml氨的饱和水溶液，洗涤树脂三遍，过滤。旋蒸滤液得到保护的西曲瑞克粗品。
(5)制备西曲瑞克精品
将西曲瑞克粗品溶于体积比为5％的甲醇水溶液中，经高效液相色谱纯化得到西曲瑞克精品，冷冻干燥后得0.675g，纯度为98.5％。制备条件为：c4制备柱，两种流动相分别为含0.1％(w/w)tfa的水、含0.1％(w/w)tfa的甲醇。