本发明属于生物技术领域，主要涉及zn++和麦芽糊精修饰三种hrps功能多肽组合片段的技术方法，以及通过该技术方法，将zn++、麦芽糊精和几个hrps功能多肽片段不同程度的共价复合，生成完全和部分不完全双修饰共价三聚肽(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n，以及双修饰共价三聚肽产物在多领域的应用。
背景技术：
所有生物的细胞表面都由许多不同类型的糖链所包被，而且在细胞内也存在各种类型的糖基化。寡糖链与蛋白质多肽链中的氨基酸以多种形式共价连接,构成糖蛋白的糖肽连接链。糖蛋白是参与许多生物过程的基本物质,这些过程包括细胞生长、细胞与细胞的粘着、免疫应答、受精、凝血块的降解、病毒增殖、寄生虫感染和炎症反应等。随着蛋白质组技术的不断发展，糖基化蛋白质组的研究将越来越受到广泛的重视。
植物在长期进化中，在同周围各种生存和生长环境条件(包括生物的和非生物的)相互作用中，形成了一种共同的适应能力，这就是进化中形成的共同防御系统和生长系统，这是植物共有的一类防御机制和生长机制，并由多条信号通路和代谢途径来实现。
研究表明，hrp蛋白类作为植物的上游信号物质，与植物细胞壁中广泛存在的受体hrp结合蛋白(harpin-bindingproteins)结合并激活植物中的多条信号通路，这些信号通路的激活，将实现对植物固有的细胞防御和生长多条代谢途径和机制的启动和调控，这就是hrp蛋白类作为植物生长调节剂和生物农药的作用机制。目前，称为超敏蛋白的hrp蛋白类产品已被广泛研究、开发和应用，具有广阔的前景。
随着基因工程技术的发展，越来越多的多肽、酶、信号分子、细胞因子等蛋白类制品被研究开发，这些蛋白类制品具有专一性强、时效高、应用广泛、安全性好等优点，但同时也发现了几个显著的不足之处，比如(1)可溶性和均一度较差；(2)抗原性及免疫原性；(3)容易从循环系统中被快速清除；(4)不稳定，容易被体内外的酶降解；(5)外用时，容易被外界环境的微生物快速降解和光降解。
对于hrps类蛋白来说，由于植物种类繁多，不同物种间、品种间生物学特性差异较大，内外环境不同以及基因间互作的差异，不同来源和条件下获得的hrps类蛋白及其制剂的性质在使用条件和效果上存在明显的选择性差异，单一种类的hrps蛋白在功效上已经明显表现出不足；hrps类蛋白作为应用于植物的一类上游功能性信号蛋白质，其可溶性和稳定性较差；在自然条件下使用(叶面喷施和根施时)，很容易被外界环境快速降解，从而影响它们的时效和功效。
鉴于以上原因，需要对hrps类蛋白进行结构改造和化学修饰。
结构改造和化学修饰法是指在分子水平上对蛋白质进行局部改造和修饰，即在体外将蛋白质的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的分子基团和大分子进行共价连接，形成完全和部分不完全的共价复合物，从而部分改变蛋白质的性质和结构，并显示出比各自独立存在时更优越的性能，该技术和方法已经在医药卫生和食品业的蛋白质产品的应用上引起越来越广泛的重视。
需要强调指出的是，对不同来源的hrps类蛋白多肽进行组合、结构改造和化学修饰形成共价复合物，国内外目前均未见报道。
常见用于蛋白质修饰的分子基团和大分子很多，主要有聚乙二醇类(包括peg和mpeg等)、多糖类，以及同源蛋白质及人工合成的多肽类、聚氨基酸以及其它分子及基团等。对蛋白质的结构改造和化学修饰技术近几年来发展很快，针对不同的酶、多肽或蛋白质的化学修饰形成了多种技术和方法，但是，都有其适用范围和局限性，至今还没有普适的通用技术和方法可供选择和利用。
核酸、蛋白质、多肽、寡多糖等活性有机配位化合物在结构和性质上均具有功能性的亲水性和疏水性基团，以及带正电荷和负电荷的电性基团，容易产生疏水-亲水不良的自耗性的相互作用，且溶液状态构象和非溶液状态构象差异较大，在自然暴露情况下容易吸湿、降解、光解和氧化；其次，这些活性有机配位化合物大多具有柔性结构，难以与作用靶点达到理想的匹配，这使得单纯活性有机配位化合物的生物学活性受到一定制约。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种zn++和麦芽糊精双修饰的hrps共价三聚肽及其制备方法，解决现有的hrps多肽片段在自然暴露情况下容易吸湿、降解、光解和氧化及由于活性有机配位化合物大多具有柔性结构，难以与作用靶点达到理想的匹配，这使得单纯活性有机配位化合物的生物学活性受到一定制约的问题。
本发明的技术方案为：.zn++和麦芽糊精双修饰的hrps共价三聚肽，它由三种hrps多肽、zn++和麦芽糊精通过双修饰形成共价三聚肽，结构通式为：(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n，三种hrps多肽为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示的氨基酸序列中的任意三种。
本发明中的zn++是指锌的二价盐。
进一步地，seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4四种hrps多肽的质量配比为3:2:3:2。
进一步地，三种hrps多肽与zn++的质量配比为6:1至1:1；三种hrps多肽和zn++总质量与麦芽糊精的质量配比10:1至1:5。
进一步地，三种hrps多肽与zn++的质量配比为3:1；三种hrps多肽和zn++总质量与麦芽糊精的质量配比1:3。
进一步地，所述麦芽糊精采用聚合度为6、7或8、de值5％-20％麦芽糊精。
进一步地，所述麦芽糊精采用聚合度为7、de值13-17％麦芽糊精。
进一步地，zn++采用znso4或硫酸锌的水合物。
进一步地，zn++采用znso4·7h2o。
zn++和麦芽糊精双修饰的hrps共价三聚肽的制备方法，制备方法如下：
(1)从seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示的四种hrps多肽中任意选择三种hrps多肽；
(2)将步骤(1)选择的三种hrps多肽与zn++按质量配比为6:1至1:1混合，加入浓度为10-200mmol/l的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的加入量为三种hrps多肽与zn++的总质量的10至100倍，使体系ph值为2-10，静置预处理0-5小时，然后在温度15-80℃、搅拌速度为30-300r/min条件下反应1-12小时，形成结构稳定的两亲性结构(3hrps-zn++)n；
(3)向步骤(2)处理后的体系中加入麦芽糊精，麦芽糊精的加入量按三种hrps多肽和zn++的总质量与麦芽糊精的质量配比10:1至1:5，并加入浓度为10-200mmol/l的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液加入量为三种hrps多肽、zn++及麦芽糊精的总质量的10至50倍，使体系ph值为4-8，静置预处理0-3小时，然后在温度为35-80℃、搅拌速度50-200r/min条件下反应5-15小时，
(4)反应完成后，进行低温真空连续干燥处理，收集产物即得双修饰共价三聚肽：(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n。
优选地，制备方法如下：
(1)从seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示的四种hrps多肽中任意选择三种hrps多肽；
(2)将步骤(1)选择的三种hrps多肽与zn++混合，zn++采用znso4·7h2o；三种hrps多肽与zn++的质量配比为3:1，加入浓度为50mmol/l的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的加入量为三种hrps多肽与zn++的总质量的40倍，使体系ph值为7，静置预处理1小时，然后在温度37℃、搅拌速度为100r/min条件下反应3小时，形成结构稳定的两亲性结构(3hrps-zn++)n；
(3)向步骤(2)处理后的体系中加入麦芽糊精，麦芽糊精采用聚合度为7、de值13-17％麦芽糊精；(3hrps-zn++)n与麦芽糊精的质量配比为1:3，并加入浓度为50mmol/l的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液加入量为三种hrps多肽、zn++及麦芽糊精的总质量的40倍，使体系ph值为7，静置预处理1小时，然后在温度为48℃、搅拌速度60r/min条件下反应10小时，
(4)反应完成后，进行低温真空连续干燥处理，收集产物即得双修饰共价三聚肽：(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n。
四种hrps功能多肽片段分别是：
seqnoid:1所示的hrps多肽片段来源于由356个氨基酸组成的hrpsneccs基因编码蛋白所含的harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由200个氨基酸组成，位于蛋白的c-端(氨基酸157-356)。
seqnoid:2所示的hrps多肽片段来源于由370个氨基酸组成的hrpszpst基因编码蛋白所含的harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由312个氨基酸组成，位于蛋白的n-端及c-端(氨基酸1-270和329-370)。
seqnoid:3所示的hrps多肽片段来源于由370个氨基酸组成的hrpsnecb基因编码蛋白所含的harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由200个氨基酸组成，位于蛋白的c-端(氨基酸171-370)。
seqnoid:4所示的hrps多肽片段来源于由339个氨基酸组成的hrpsnech基因编码蛋白所含的harpin家族蛋白质高度保守区域片段，由326个氨基酸组成，位于蛋白的中段(氨基酸9-334)。
这些功能多肽片段都是专利发明人自主完成的基因及其表达产物研究成果，已由专利发明人在genbank注册，它们注册号分别是：ay999002.1,ay999004,dq355519.1及ay999001；按照这些功能多肽片段的大小、在保守区域位置和序列差异，以及hrps蛋白基因来源细菌的特征，互补性地选择了这些片段，配置了四个组合，每种组合含有3个不同的多肽片段，将要进行的修饰多肽的四个片段组合分别是，i:seqnoid:1、seqnoid:2、seqnoid:3,ii:seqnoid:1、seqnoid:2、seqnoid:4,iii:seqnoid:1、seqnoid:3、seqnoid:4和iv:seqnoid:2、seqnoid:3、seqnoid:4，它们的表达通式是(3hrps)n，四个片段组合的表达式分别为(3hrps)n(i)、(3hrps)n(ii)、(3hrps)n(iii)和(3hrps)n(iv)。
对以上4个hrps功能多肽片段作进一步的说明：
1、几个hrps功能多肽来源的源头基因编码的harpin蛋白，它们的大小和氨基酸序列组成差异较大。seqnoid:1的hrpsneccs蛋白由356个氨基酸组成；seqnoid:2的hrpszpst蛋白由370个氨基酸组成；seqnoid:3的hrpsnecb蛋白由370个氨基酸组成；而seqnoid:4的hrpsnech蛋白只有339个氨基酸。
2、四个基因编码的harpin蛋白都含harpin家族蛋白质高度保守区域(domain)。harpin家族蛋白质高度保守区域是harpin类蛋白的主要功能区域，其卓越的生物功效主要由所含harpin家族蛋白质高度保守区域的序列，以及这些保守区域的多肽高级结构所决定。
3、四个harpin蛋白及其所含之harpin家族蛋白质高度保守区域间的氨基酸序列无论从序列大小、位置以及氨基酸组成，它们间的差异都极大。1号蛋白的harpin家族蛋白质高度保守区域由200个氨基酸组成，位于蛋白的c-端(氨基酸157-356)；2号蛋白的harpin家族蛋白质高度保守区域由312个氨基酸组成，位于蛋白的n-端及c-端(氨基酸1-270和329-370)；3号蛋白的harpin家族蛋白质高度保守区域由200个氨基酸组成，位于蛋白的c-端(氨基酸171-370)；4号蛋白的harpin家族蛋白质高度保守区域由326个氨基酸组成，位于蛋白的中段(氨基酸9-334)。这4个harpin家族蛋白质高度保守区域的多肽片段氨基酸序列以及保守区域的多肽高级结构决定了它们具有的卓越的生物功效。
zn++和麦芽糊精修饰三种hrps多肽组合片段制备双修饰共价三聚肽分两步进行，第一步是zn++对hrps功能多肽的两亲性修饰，以zn++作中心离子或原子，以hrps多肽组合片段分子为配位体，在一定控制条件下结合或键合，首先形成“活性中间体”，然后循“多点挂钩、柔顺结合、最大成键”的反应原则，通过电荷控制和轨道控制这种电价性和共价性作用，结合形成稳定的两亲性结构(3hrps-zn++多肽)n，蛋白多肽分子亲水基团内聚，疏水基团外露，从而表现出特殊的结构状态和功能属性；第二步是麦芽糊精继续修饰三种已形成稳定两亲性结构的hrps多肽组合片段(3hrps-zn++多肽)n，通过共价复合方式，制备成双修饰共价三聚肽，即(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽。使新制备的hrps双修饰共价三聚肽形成空间和电性上彼此互恰的和匹配更优、更合理的刚性结构，且产品的乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，生物学活性更强，功能更多，应用范围更广。
hrps多肽组合片段分子经zn++和麦芽糊精修饰以后，由于相互间依靠共价键、电荷转移、离子键、氢键、范德华力、疏水作用等形成空间和电性上彼此互恰的和匹配更优、更合理的刚性结构，从而使其稳定性增强，降低了它们因疏水-亲水产生的不良的自耗性相互作用，溶液状态构象和非溶液状态构象更趋一致，与靶点结合的区域增加，与靶点作用的构象匹配性增强，并使hrps多肽组合片段诱发作用对象的一系列生理生化反应的时间延长，从而表现出更优、更强、更广谱的功能活性。
寡糖链与蛋白质多肽链中的氨基酸以多种形式共价连接,构成糖蛋白的糖肽连接链,简称糖肽链。根据糖肽链类型,蛋白质糖基化可以分为四类,即以丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基为连接点,形成-o-糖苷键型；以天冬酰胺的酰胺基、n2末端氨基酸的α-氨基以及赖氨酸或精氨酸的ω-氨基为连接点,形成-n-糖苷键型；以天冬氨酸或谷氨酸的游离羧基为连接点,形成酯糖苷键型以及以半胱氨酸为连接点的糖肽键。
麦芽糊精是以优质淀粉为原料，经淀粉酶有限度的液化水解后精制而成的de值5％-20％的淀粉水解产物，不含游离淀粉的淀粉衍生物，是由d-葡萄糖以α-1，4糖苷键连接成的环状低聚糖，根据聚合度分为α，β和γ，它们的聚合度分别为6、7和8，聚合度介于可溶性淀粉与麦芽糖之间，化学分子式：(c6h10o5)n·xh2o，是相对大和相对柔性的分子。经x射线衍射和核磁共振研究，证明麦芽糊精分子成锥柱状或圆锥状花环，有许多可旋转的键和羟基，内有一个空腔。空腔内部排列着配糖氧桥原子，氧原子的非键电子对指向中心，使空腔内部具有很高的电子密度，表现出部分路易斯碱的性质。分子构型为葡萄糖的c-1椅式构型，在它的圆筒内部有-ch-葡萄糖苷结合的o原子，故呈疏水性。葡萄糖的2位和3位的-oh基在圆筒的一端开口处，6位的-oh基在圆筒的另一端开口处，所以圆筒的二端开口处都呈亲水性，这样，糊精的筒形体的内部上层、中层、下层由不同的疏水-亲水基团组成。
寡糖链与蛋白质多肽链中的氨基酸以多种形式共价连接,构成糖蛋白的糖肽链,我们所涉及的hrps功能蛋白多肽片段，它们是只有一、二、三级结构而无四级结构的非酶蛋白质，不含胱氨酸和半胱氨酸，富含能与寡糖链以其它3种类型共价连接形成糖肽链的氨基酸。hrpneccs基因编码蛋白中有丝氨酸40个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有丝氨酸19个；有苏氨酸13个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有苏氨酸10个；有赖氨酸18个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有赖氨酸16个；有脯氨酸9个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有脯氨酸6个；有甘氨酸75个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有甘氨酸26个；有精氨酸5个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有精氨酸6个；有天冬氨酸15个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有天冬氨酸13个；有谷氨酸9个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有谷氨酸7个。hrpzpst基因编码蛋白中有丝氨酸38个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有丝氨酸32个；有苏氨酸23个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有苏氨酸18个；有赖氨酸11个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有赖氨酸11个；有脯氨酸12个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有脯氨酸8个；有甘氨酸57个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有甘氨酸46个；有精氨酸4个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有精氨酸2个；有天冬氨酸27个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有天冬氨酸25个；有谷氨酸9个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有谷氨酸9个。hrpnecb基因编码蛋白中有丝氨酸34个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有丝氨酸16个；有苏氨酸13个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有苏氨酸9个；有赖氨酸17个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有赖氨酸15个；有脯氨酸8个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有脯氨酸7个；有甘氨酸87个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有甘氨酸29个；有精氨酸4个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有精氨酸3个；有天冬氨酸17个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有天冬氨酸14个；有谷氨酸8个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有谷氨酸6个；以及hrpnech基因编码蛋白中有丝氨酸40个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有丝氨酸40个；有苏氨酸14个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有苏氨酸13个；有赖氨酸21个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有赖氨酸20个；有脯氨酸5个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有脯氨酸5个；有甘氨酸55个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有甘氨酸55个；有精氨酸3个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有精氨酸3个；有天冬氨酸22个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有天冬氨酸22个；有谷氨酸4个，其中harpin家族蛋白质高度保守区域片段中有谷氨酸4个。这些结构决定了它们可以与寡糖链以多种形式共价连接的方式,构成糖蛋白的糖肽连接链，实现zn++和麦芽糊精经修饰三种hrps功能多肽片段制备双修饰共价三聚肽。
糖蛋白是一类以多种形式共价连接的复合物。应用蛋白多肽的不同组合、结构改造和化学修饰技术，在优选的控制条件下，使zn++和麦芽糊精与几个hrps多肽发生共价复合作用，生成完全和部分不完全双修饰共价聚合体。该聚合体使原来hrps多肽功能组合片段的功能性质得到较大的改善，无毒，且具有较强的乳化稳定性和较大的抵抗外界环境变化的能力，扩大了新生成物的功能和应用范围。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
通过zn++和麦芽糊精(md)修饰三种hrps多肽组合片段，以共价复合的方式，将zn++、麦芽糊精(md)和几个hrps功能多肽组合片段制备成完全和部分不完全双修饰共价三聚肽，即(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽，使新制备的hrps双修饰共价三聚肽形成空间和电性上彼此互恰的和匹配更优、更合理的刚性结构，且产品的乳化稳定性、均一性和结构稳定性更高、时效更长，生物学活性更强，功能更多，应用范围更广，该技术及其制备相关产物可以广泛应用于农业领域的蛋白多肽类农肥、农药、生长调节剂产品生产，应用于医药领域的蛋白多肽类外用药、内服药、肌肉注射药和静脉注射药产品的生产，以及食品业的有关蛋白多肽产品的生产加工。
具体实施方式
技术实施过程和条件包含：
(1)hrps功能多肽1-4号片段在组合中的质量(以mm计量)配比：通常是以相同至不同mm质量组成组合；
(2)zn++是指锌的二价盐，本试验采用的是硫酸锌或硫酸锌水合物；麦芽糊精的选择：聚合度6、7和8，de5％-20％；
(3)zn++对hrps功能多肽的两亲性修饰：a、3个hrps功能多肽片段和zn++的质量配比：6:1至1:1；b、反应浓度：3个hrps多肽片段和zn++混合,10-200mm磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10至100倍；c、反应ph和静置处理：10-200mm磷酸缓冲液ph2-10，静置处理0-5小时；d、反应温度和时间：反应温度为15℃-80℃，反应时间1-12小时，反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度为每分钟30-300转；e、zn++对hrps功能多肽的两亲性修饰的条件选择以反应溶液中游离zn++浓度不再增加为响应值，表明所形成的两亲性结构(3hrps-zn++多肽)n已经稳定，蛋白多肽分子亲水基团内聚，疏水基团外露；
(4)麦芽糊精继续修饰几个已形成稳定两亲性结构的hrps多肽组合片段(3hrps-zn++多肽)n：a、组合中3hrps-zn++多肽片段和麦芽糊精的质量配比：10:1至1:10之间；b、反应浓度：3hrps-zn++多肽片段和麦芽糊精混合,10-200mm磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10至100倍；c、反应ph和静置处理：10-200mm磷酸缓冲液ph2-10，静置预处理时间0-5小时；d、反应温度和时间：反应温度为15℃-80℃，反应时间5-25小时，反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度为每分钟30-300转；e、制备3hrps-zn++多肽和麦芽糊精共价三聚肽的最佳条件以反应溶液静置沉淀时间和诱发凤仙花叶片发生过敏反应的时间以及燕麦胚轴生长速度作为最终筛选依据(生物学效应)；
(5)反应完成后，低温真空连续干燥，最后收集的产物是：(3hrps-zn++多肽)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽，简化通式为：(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n。
(6)生成物检测：采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sds-page)，结果表明,(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽形成大分子，在分离胶和浓缩胶界面处出现大分子量的新谱带,3个hrps多肽片段的电泳谱带随着制备反应的进行逐渐减弱，证实hrps多肽组合片段与麦芽糊精之间发生共价交联,生成了共价复合物。对比试验表明，hrps多肽组合片段经麦芽糊精修饰后,(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽的乳化稳定性显著提高；zeta电位发生明显变化,等电点下降1个ph单位以上。
研究表明，以生成的稳定两亲性结构的hrps多肽组合片段(3hrps-zn++多肽)n和麦芽糊精(md)制备的不同接枝度的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n聚合物,通过巯基含量测定、sds-page凝胶电泳、差式量热扫描、傅里叶红外光谱、电子扫描显微镜和不同接枝度的hrps多肽组合片段聚合物结构特征的变化分析，随着接枝度的提高,(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽的巯基含量逐渐降低、α-螺旋和β-转角的结构含量减少以及β-折叠和无规则卷曲结构含量增多，(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n是以共价键的结合方式聚合，聚合物的微观结构松散,呈多孔状，形成新的超分子结构。
hrps多肽片段的四个组合(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽的制备，均采用相同方法同时并列进行，取得一致的结果。
实施例1zn++和麦芽糊精(md)修饰几个hrps多肽组合片段制备双修饰共价三聚肽的技术方法
(1)hrps功能多肽1-4号片段在组合中的质量(以mm计量)配比：通常是以相同至不同mm质量组成组合；
(2)zn++是指锌的二价盐，本试验采用的是硫酸锌，分子式znso4，分子量161；麦芽糊精的选择：聚合度6、7和8，de5％-20％；
(3)zn++对hrps蛋白功能多肽的两亲性修饰：a、3个hrps功能多肽片段和zn++的质量配比：6:1至1:1；b、反应浓度：3个hrps多肽片段和zn++混合,10-200mm磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10至100倍；c、反应ph和静置处理：10-200mm磷酸缓冲液ph2-10，静置处理0-5小时；d、反应温度和时间：反应温度为15℃-80℃，反应时间1-12小时，反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度为每分钟30-300转；e、zn++对hrps功能多肽的两亲性修饰的条件选择以反应溶液中游离zn++浓度不再增加为响应值，表明所形成的两亲性结构(3hrps-zn++多肽)n已经稳定，蛋白多肽分子亲水基团内聚，疏水基团外露；
(4)麦芽糊精继续修饰几个已形成稳定两亲性结构的hrps多肽组合片段(3hrps-zn++多肽)n：a、组合中3hrps-zn++多肽片段和麦芽糊精的质量配比：10:1至1:5之间；b、反应浓度：3hrps-zn++多肽片段和麦芽糊精混合,10-200mm磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10至50倍；c、反应ph和静置处理：10-200mm磷酸缓冲液ph4-8，静置处理0-3小时；d、反应温度和时间：反应温度为35℃-80℃，反应时间5-15小时，反应时，反应混合液需要搅拌，搅拌速度为每分钟50-200转；e、制备3hrps-zn++多肽-麦芽糊精双修饰共价三聚肽的最佳条件以反应溶液静置沉淀时间和诱发凤仙花叶片发生过敏反应的时间以及燕麦胚轴生长速度为最终筛选依据(生物学效应)；
(5)反应完成后，低温真空连续干燥，最后收集的产物是：(3hrps-zn++多肽)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽，简化通式为：(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n。
(6)生成物检测：采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sds-page)，结果表明,(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽形成大分子，在分离胶和浓缩胶界面处出现大分子量的新谱带,3个hrps多肽片段的电泳谱带随着制备反应的进行逐渐减弱，证实hrps多肽组合片段与麦芽糊精之间发生共价交联,生成了共价复合物。对比试验表明，hrps多肽组合片段经zn++和麦芽糊精修饰后,(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽的乳化稳定性显著提高；zeta电位发生明显变化,等电点显著下降1个ph单位以上。
hrps多肽片段四个组合的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽的制备，均采用同样方法同时并列进行，取得一致的结果。
zn++和麦芽糊精(md)修饰hrps多肽组合片段制备双修饰共价聚合体的最佳条件以最终筛选依据(生物学效应)为响应值时，经多次对制备条件进行试验和筛选，获得优选的控制条件是，(1)hrps功能多肽1-4号片段在组合中的质量(以mm计量)配比：通常是以相同至不同mm质量组成组合，优选为1、2、3、4号片段均为相同mm质量，更优选为1号2mm、2号3mm、3号2mm和4号3mm，最优选为1号3mm、2号2mm、3号3mm和4号2mm组成组合；(2)硫酸锌和麦芽糊精(md)的选择，硫酸锌的选择：优选分子量为179、znso4·h2o，更优选为215、znso4·3h2o，最优选为287、znso4·7h2o；麦芽糊精(md)的选择：通常为聚合度6-8，de5％-20％，优选聚合度为6、de9％-12％，进一步优选聚合度为8、de18％-22％，最优选聚合度为7、de13％-17％；(3)zn++对hrps蛋白功能多肽的两亲性修饰：a、3个hrps功能多肽片段和zn++的质量配比：通常配比为6:1至1:1，优选为6:1，更优选为5:1，进一步优选为2:1，最优选为3:1；b、反应浓度：3个hrps多肽片段和zn++混合,50mm磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10至100倍，优选为20倍，更优选为80倍，进一步优选为30倍，再优选为50倍，最优选为40倍；c、反应ph和静置处理：通常10-200mm磷酸缓冲液ph2-10，磷酸缓冲液，优选为10mm，更优选为150mm，进一步优选为30mm，再优选为80mm，最优选为50mm；反应ph,优选为ph3，更优选为ph10，进一步优选为ph5，再优选为ph8，最优选为ph7；通常静置预处理时间0-5小时，优选为5小时，更优选为0小时，进一步优选为4小时，再优选为2小时，最优选为1小时；d、反应温度和时间：通常反应温度为15℃-80℃，优选为20℃，更优选为60℃，进一步优选为30℃，再优选为40℃，最优选为37℃；通常反应时间1-12小时，优选为9小时，更优选为7小时，进一步优选为5小时，再优选为1小时，最优选为3小时；通常反应时搅拌速度为每分钟30-300转，优选为50转，更优选为200转，进一步优选为80转，再优选为150转，最优选为100转；e、zn++对hrps功能多肽的两亲性修饰的条件选择以反应溶液中游离zn++浓度不再增加为响应值，表明所形成的两亲性结构(3hrps-zn++多肽)n已经稳定，蛋白多肽分子亲水基团内聚，疏水基团外露；(4)麦芽糊精继续修饰几个已形成稳定两亲性结构的hrps多肽组合片段(3hrps-zn++多肽)n：a、组合中3hrps-zn++多肽片段和麦芽糊精的质量配比：通常为10:1到1:5，优选为5:1，更优选为4:1，进一步优选为1:2，最优选为1:3；b、反应浓度：3hrps-zn++多肽片段和麦芽糊精混合,通常50mm磷酸缓冲液稀释为混合物质量的10-50倍，优选为20倍，更优选为30倍，进一步优选为50倍，最优选为40倍；c、反应ph和静置处理：通常10-200mm磷酸缓冲液ph为4-8和时间为0-3小时，磷酸缓冲液，优选为10mm，更优选为150mm，进一步优选为30mm，再优选为80mm，最优选为50mm；反应ph,优选为ph5，更优选为ph6，进一步优选为ph8，最优选为ph7；优选静置处理时间为3小时，更优选为2，最优选为1小时；d、反应温度和时间：反应温度通常为35℃-80℃，优选为40℃，更优选为50℃，最优选为48℃，特别要指出的是，提高热处理的温度可以增加糖基化产物的接枝度，但是，对于hrps功能多肽而言，不要把温度提高到80℃，以免影响hrps功能多肽的生物学效应；反应时间通常为5-15小时，优选为5小时，更优选为8小时，进一步优选为12小时，最优选为10小时；反应时搅拌速度通常为每分钟50-200转，优选为150转，更优选为100转，进一步优选为80转，最优选为60转；e、制备3hrps-zn++多肽和麦芽糊精双修饰共价三聚肽的最佳条件的最终筛选依据是：反应溶液静置沉淀时间不得少于2小时，诱发凤仙花叶片发生过敏反应的时间不得超过4小时，以及燕麦胚轴生长速度不得低于0.03cm/h(生物学效应)；(5)反应完成后，低温真空连续干燥，最后收集的产物是：(3hrps-zn++多肽)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽，简化通式为：(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n。
hrps蛋白多肽片段的四个组合的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽制备的优选控制条件试验，均采用同样方法同时并列进行，取得与上述一致的结果。完成最终生成物(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽的制备以及产物检测。
按照上述zn++对hrps蛋白功能多肽的两亲性修饰的优化技术实施过程和条件，我们用(k+)、钙(ca++)、镁(mg++)、铁(fe+++)、铜(cu++)、锰(mn++)的硫酸盐对hrps蛋白功能多肽进行了两亲性修饰，也获得了与(3hrps-zn++多肽)n相似的稳定的两亲性结构:(3hrps-k+)n、(3hrps-ca++)n、(3hrps-mg++)n、(3hrps-fe+++)n、(3hrps-cu++)n、(3hrps-mn++)n；进一步采用上述麦芽糊精修饰几个已形成稳定两亲性结构的hrps多肽组合片段的优化技术实施过程和条件，最后制备出系列双修饰共价三聚肽：(3hrps-k+)n-(c6h10o5)n、(3hrps-ca++)n-(c6h10o5)n、(3hrps-mg++)n-(c6h10o5)n、(3hrps-fe+++)n-(c6h10o5)n、(3hrps-cu++)n-(c6h10o5)n、(3hrps-mn++)n-(c6h10o5)n。
进一步采用同样制备技术和条件，优选控制条件，以zn++和麦芽糊精修饰更多hrps类蛋白(harpineccs、harpinecc、harpinea、harpinech、harpinpst、harpinpsg、harpinpss等，以及通过基因重组方式获得的融合蛋白harpineccs+harpinecc、harpineccs+harpinea、harpineccs+harpinech、harpinecc+harpineca、harpinecc+harpinech、harpinea+harpinech等)，制备多类型的异源双修饰共价二聚体、异源双修饰共价三聚体、异源双修饰共价四聚体以及异源双修饰共价多聚体。
实施例2zn++和麦芽糊精(md)修饰hrps多肽片段制备四个组合(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽剂型设计:
(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽在制备、储存和应用中的设计剂型有：原药，包括固体即原粉和液体即原液；储存和应用的产品剂型包括颗粒剂、可湿性粉剂、水剂、缓释剂以及与其他肥料、或杀菌剂、杀虫剂或植物生长调节剂调制的混合制剂等。另外，(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽的相关辅料和助剂，包括食品级的可溶性大量营养成分及少量营养成分。由于这类功能多肽共价聚合体(双修饰共价三聚肽)及其制剂无毒、无公害，使用时无需特殊的防护。
实施例3zn++和麦芽糊精(md)修饰hrps多肽片段制备四个组合(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽的使用方法和要求:
应用这类功能多肽共价聚合体时：(1)处理植物的适宜方法包括浸种、拌种、种子包衣、蘸根、叶面喷雾、根施、注射、花果喷涂等；(2)处理植物的适宜条件包括选择适宜的用药时间和用药时的环境气象条件；颗粒剂、可湿性粉剂或水剂应用无氯的河水、井水、地下水或自来水配成要求的使用浓度，切忌与酸、碱混合，药品应保存在阴凉干燥处；(3)处理植物的具体要求包括整个生长季节均适于用药，一季作物可施药3-6次，每次间隔10-20天，施用时间和次数视使用目的确定，使用时已配制好的药液建议在24小时内用完。
实施例4zn++和麦芽糊精(md)修饰hrps多肽片段制备四个组合(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n双修饰共价三聚肽的稳定性检测:
按实施例1方法制备的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽与对应的hrps多肽组合的混合片段，在几种条件下的稳定性进行了比较，结果如下：
在ph2条件下，hrps多肽组合的混合片段100分钟后丧失活性，由它们作为配位体形成的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽200分钟仍保持活性；在ph12条件下，hrps多肽组合的混合片段100分钟后丧失活性，由它们作为配位体形成的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽500分钟仍保持活性，在中性和强碱性条件下表现为优越的乳化活性和乳化稳定性，(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽在所有ph范围内都能达到很好的溶解性能,并且溶解性大大提高。
在室温下，均配制成含量3％的水溶液，hrps多肽组合的混合片段水溶液静置20分钟后，出现明显的分层，1小时后，形成絮状沉淀；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽水溶液静置72小时后，溶液仍均匀，未出现分层。
裸露在自然条件下，均配制成含量3％的水溶液，分别在培养皿注入一薄层配制的水溶液，hrps多肽组合的混合片段水溶液3天后，取样电泳时hrp蛋白谱带已经很弱了，5天后，hrps蛋白谱带已经消失，表明hrps多肽基本降解；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽水溶液14天后，电泳时它们的谱带还清晰可见。
在100℃条件下，均配制成含量3％的水溶液，hrps多肽组合混合片段水溶液加热25分钟后，注射不再引起烟草叶片过敏反应，hrps多肽基本丧失活性；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽水溶液加热30分钟后，注射引起烟草叶片过敏反应，双修饰共价三聚肽仍有活性，40分钟后还有活性保持。进一步证实按实施例1方法制备的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)，已经生成新的化合物,该产物热稳定性提高。
暴露在30000lux强光照条件下，均配制成含量3％的水溶液，分别在培养皿注入一薄层配制的水溶液，hrps多肽组合混合片段水溶液强光照60分钟后，注射不再引起烟草叶片过敏反应，hrps多肽丧失活性；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽强光照240分钟后，注射引起烟草叶片过敏反应，仍有活性，表明所制备的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽不容易发生光解。
hrps蛋白多肽片段的四个组合的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽的稳定性试验，同样方法同时并列进行，获得类似的结果。
实施例5zn++和麦芽糊精(md)修饰hrps功能多肽片段制备四个组合的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽的更多的功能
按实施例1方法制备的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽与对应的hrps多肽组合的混合片段对种子萌发和幼苗生长的影响进行了比较。以种子发芽率、幼苗株高和干重作为测定指标，hrps多肽组合的混合片段和(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽的作用浓度均为100μg/ml，并以ph6.5的5mm磷酸钾缓冲液作对照处理，在28℃条件下分别对油菜种子、水稻种子和小麦种子浸种24小时，然后分别播于三组育苗盘中，7天后统计种子发芽率，15天后测量幼苗平均株高和平均干重。结果如下：
hrps多肽组合的混合片段处理组，油菜种子发芽率92％、水稻种子发芽率90％、小麦种子发芽率86％；油菜平均株高4.7cm、水稻平均株高12.4cm、小麦平均株高13.5cm；油菜平均干物质重1.2g、水稻平均干物质重2.3g、小麦平均干物质重2.2g；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽处理组，油菜种子发芽率95％、水稻种子发芽率93％、小麦种子发芽率89％；油菜平均株高4.9cm、水稻平均株高14.1cm、小麦平均株高15.3cm；油菜平均干物质重1.3g、水稻平均干物质重2.7g、小麦平均干物质重2.5g；磷酸钾缓冲液对照处理组，油菜种子发芽率90％、水稻种子发芽率88％、小麦种子发芽率84％；油菜平均株高4.5cm、水稻平均株高11.5cm、小麦平均株高12.6cm；油菜平均干物质重1.1g、水稻平均干物质重2.0g、小麦平均干物质重1.9g。
以上结果表明，hrps多肽组合的混合片段和(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽与对照处理相比，对被处理种子的发芽率、株高和干物质积累方面均具有明显的促进作用，但(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽比hrps多肽组合的混合片段在这方面的功能活性更具优越性。
(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽具有以下更多的功能：
用于浸种、拌种，使种子出芽早，发芽率高，出芽整齐，芽苗茁壮，防病抗逆，根系发达；用于幼苗叶面喷施、根施，植株健壮，生长势好，防病抗逆，根系发达；用于成苗叶面喷施、根施，提高作物的光合效率，枝叶繁茂，分枝分蘖多，植株造型好，提高孕花孕果率，增强作物对病虫害和多类不良环境(低温、高热，干旱、水涝等)危害的防御能力，大幅度减轻危害，并具强大的修复能力；用于花前叶面喷施、根施，提高作物的光合效率，花枝花穗多，提前开花挂果，果枝果穗多，防止落花落果，增强作物对病虫害和多类不良环境(低温、高热，干旱、水涝等)危害的防御能力，大幅度减轻危害，并具强大的修复能力；用于开花结果叶面喷施、根施，提高作物的光合效率，提高坐果率、结实率和成熟度，果实大小均匀，显著提高产量和质量，提升农产品商品品质，减轻收获后病害危害，延长农产品货架保鲜期，增产增收。
实施例6zn++和麦芽糊精(md)修饰hrps功能多肽片段制备四个组合的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽的更广的使用范围
按实施例1方法制备的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽与对应的hrps多肽组合的混合片段对诱导植物抗性反应方面的活性效果进行了比较。
结果表明，在相同处理条件下，对应的hrps多肽组合的混合片段6小时后引起凤仙花叶面明显出现褐色枯萎斑，而(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽仅2小时后就引起植物叶面明显出现褐色枯萎斑；12小时后，前者出现枯萎斑的面积只有后者的二分之一；24小时后，前者出现枯萎斑的面积只有后者的三分之一。说明(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽能提早触发或诱发抗性反应事件，并且其维持抗性反应的时间和强度均优于对应的hrps多肽组合的混合片段。
按实施例1方法制备的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽与对应的hrps多肽组合的混合片段对有害昆虫的防治作用进行了比较。
以烟草蚜虫为例，用100μg/ml浓度的对应的hrps多肽组合的混合片段溶液和(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽溶液在25℃条件下对烟草种子浸种24-48小时，并以ph6.5的5mm磷酸钾缓冲液作对照处理，然后分别播于三个培养盘中萌发，待出苗以后分组移栽于同一块大田中，随后每天观察记录感染蚜虫的数目。结果发现，对照处理组第1、2、3、6、7、8、9、10天单株感染蚜虫的平均数分别为：0、3、3、6、7、9、13、17；对应的hrps多肽组合的混合片段处理组第1、2、3、6、7、8、9、10天单株感染蚜虫的平均数分别为：0、0、0、1、0、0、2、2；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽处理组第1、2、3、6、7、8、9、10天单株感染蚜虫的平均数分别为：0、0、0、0、0、0、1、0。
同样以烟草蚜虫为例，用25μg/ml浓度的对应的hrps多肽组合的混合片段溶液和25μg/ml浓度的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽溶液对已严重感染蚜虫的烟草植株叶片进行渗透或喷洒处理，并以ph6.5的5mm磷酸钾缓冲液处理作对照，然后每天观察统计烟草植株上蚜虫的数目。结果发现，对照处理组的蚜虫数量在处理期间明显增加；对应的hrps多肽组合的混合片段处理组的蚜虫在处理的第2-3天开始离开该植株，到第10天左右蚜虫基本上消失，植株上留下部分死亡蚜虫；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽处理组的蚜虫在处理的第1-2天开始离开该植株，到第6-8天左右蚜虫基本上消失，植株上留下部分死亡蚜虫。
以上结果表明，对应的hrps多肽组合的混合片段及(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽与对照处理相比，均能有效防治植物有害昆虫的侵害，但(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽比对应的hrps多肽组合的混合片段在控制害虫方面似乎更具优越性。
进一步进行(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽与单一hrpecb蛋白和对应的hrps多肽组合的混合片段三种蛋白制剂生物学活性—过敏反应的比较试验，对36种植物叶片进行过敏反应试验，24小时后，观察统计发生典型特征性过敏反应的植物种类数，过敏反应是植物诱导抗逆性的外在表现，因而通过植物是否发生过敏反应或过敏反应的强弱，就可以比较相应诱抗蛋白的生物学活性和诱导植物抗性的能力，(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽能诱导36种供试植物产生过敏反应，它们是烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季、槐树、豌豆、桃树、一串红、丝瓜、四季豆、花椰菜、菠菜、油菜、薯蓣、豇豆、蚕豆、玉米、水稻、大豆、仙客来、桑树、南瓜、枇杷、椿树，过敏反应斑较大，组织坏死程度(过敏反应强度)较高；单一hrpecb蛋白能诱导16种供试植物产生过敏反应，它们是烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季,过敏反应斑或组织坏死程度(过敏反应强度)一般或较弱；对应的hrps多肽组合的混合片段能诱导26种供试植物产生过敏反应，它们是烟草、辣椒、茄子、西红柿、土豆、草莓、黄瓜、空心菜、鸡冠花、玻璃海棠、九月菊、三色堇、胭脂花、矮牵牛、葡萄、月季、槐树、豌豆、桃树、一串红、丝瓜、四季豆、花椰菜、菠菜、油菜、薯蓣，过敏反应斑或组织坏死程度(过敏反应强度)一般或较弱。
结果表明，(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽、单一hrpecb蛋白和对应的hrps多肽组合的混合片段都具有诱导供试植物抗性的能力和生物学活性，在诱导过敏反应的植物种类范围以及诱导抗性的能力和生物学活性上，(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽最优、最强，其次是对应的hrps多肽组合的混合片段，再其次是单一hrpecb蛋白，显然，(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽具有更广泛的供试植物使用范围，并具有更强的诱抗能力。
实施例7zn++和麦芽糊精(md)修饰hrps功能多肽片段制备四个组合的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽更强大的增效动力
作为添加中间补体，应用于肥料产品中，是一类独特而功能强大的增效动力，可以显著强化和提升肥料使用效果和效率，可以节省30％以上的肥料使用量，并实现增产、增收、抗逆、安全的效果。
作为添加中间补体，应用于农药产品中，是一类独特而功能强大的增效动力，可以显著强化和提升农药使用效果和效率，特别是对细菌和病毒病害的防治效果十分显著，可以节省80％的农药使用量，并实现增产、增收、抗逆、安全的效果。
作为添加中间补体，应用于植物生长调节剂产品中，是一类独特而功能强大的增效动力，可以显著强化和提升植物生长调节剂使用效果和效率，可以节省80％的植物生长调节剂使用量，并实现增产、增收、抗逆、安全的效果。
实施例8麦芽糊精(md)修饰hrps功能多肽片段制备的四个组合的(3hrps)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽在多种供试作物上的使用效果
按实施例1方法制备的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽与对应的hrps多肽组合的混合片段对诱导植物广谱抗病性方面的作用进行了比较。
结果表明，用100μg/ml浓度的hrps多肽组合的混合片段和100μg/ml浓度的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽溶液对植物种子浸种24小时以上，或在植物疫病发生前以稀释4-10倍的浓度每隔2周定期喷洒植物幼苗或叶片，均可有效防治油菜软腐病、白菜软腐病、蕃茄溃疡病、甘蓝黑腐病、辣椒疮痂病、水稻白叶枯病等细菌类病害和水稻稻瘟病、水稻纹枯病、玉米大斑病、玉米小斑病、玉米纹枯病、小麦赤霉病、小麦白粉病、小麦锈病、白菜霜霉病、黄瓜枯萎病、莴苣菌黑病、辣椒疫病、茄子绵疫病、马铃薯早疫病、马铃薯晚疫病等真菌类病害，以及油菜病毒病、马铃薯病毒病、蕃茄病毒病等病毒类病害。试验结果表明，(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽比对应的hrps多肽组合的混合片段更能提早触发或诱发植物的抗性反应机制，并能使诱抗反应维持更长的时间和强度。
实验表明，本发明诱导植物广谱抗病性的(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽适合用于多种植物，包括各种自然条件和栽培条件下的所有单子叶植物和双子叶植物，以及来自这些植物的种子和无性繁殖系，如营养繁殖器官或外植体、组织培养物、细胞或原生质体培养物及其再生植株等；其中，适用的粮食作物、蔬菜作物、经济作物和果树包括：水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、青稞、大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、甘薯、马铃薯、莴苣、蕃茄、甘蓝、菠菜、萝卜、胡萝卜、洋葱、茄子、芹菜、大白菜、大蒜、小白菜、花椰菜、南瓜、冬瓜、西瓜、丝瓜、黄瓜、瓠瓜、空心菜、青菜、韭菜、辣椒、姜、葱、菜花、豇豆、四季豆、菜豆、甜菜、苜蓿、向日葵、花生、芝麻、蓖麻、油菜、棉花、亚麻、桑、甘蔗、烟草、胡椒、花椒、苹果、梨、柑桔、柚、橘、葡萄、草莓、桃、杏、李、枇杷、荔枝、桂圆、波萝、香蕉等；适用的室内室外观赏性花卉植物和藤蔓植物包括：兰花、牵牛、郁金香、风信子、百合、月季、玫瑰、菊花、牡丹、康乃馨、蔷薇等；适用的各种药用植物包括：川芎、天麻、当归、芍药、紫苏、薄荷、板兰根、连翘、金银花、薯蓣、山药、杜仲、丁香、人参、三七、贝母、枸杞子等；此外还适用于各种经济用林木或苗木、绿化用林木或苗木以及各种牧草和绿化用草皮等。
(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽诱导的植物广谱抗病性包括植物对各种病原性或致病原性的细菌、真菌、病毒和有害昆虫等的侵害或进一步侵害产生的过敏反应或系统获得抗性反应；其中，(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽可有效防治的细菌性植物病害包括：各种蔬菜、粮食和经济作物的软腐病、环腐病、黑腐病、黑斑病、黑胫病、黑星病、黑粉病、叶枯病、青枯病、斑枯病、蔓枯病、纹枯病、枯萎病、炭疽病、角斑病、褐斑病、褐纹病、紫斑病、疮痂病、菌核病、白叶枯病、白粉病、白斑病、白锈病、锈病等；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽可有效防治的真菌性植物病害包括：多种蔬菜、粮食和经济作物的霜霉病、灰霉病、叶霉病、煤霉病、疫霉病、早疫病、晚疫病、绵疫病等；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽可有效防治的病毒性植物病害包括：白菜孤丁病、蕃茄花叶病、烟草花叶病、白菜褪绿斑驳病毒病、白菜花叶斑驳病毒病以及由x-和y-病毒复合感染引起的马铃薯病毒病等；(3hrps-zn++)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽可有效防治的植物有害昆虫包括：蚜虫、菜蛾、菜粉蝶、棉铃虫、烟青虫、玉米钻孔虫、马铃薯瓢虫、甜菜甲虫、粉螨、金针虫、蝼蛄、蝇等。
此外，(3hrps)n-(c6h10o5)n(i-iv)双修饰共价三聚肽还有以下更多的应用范例：
四川省德阳市2个市县的5个镇村进行了20余批次大田的双修饰共价三聚肽试验和示范，实施面积总量360余亩，主要供试作物为土豆、黄瓜、玉米、辣椒、西红柿、晒烟、红油菜、花椰菜、水稻、桑树、油桃等，增产幅度为8％至36％，表现出对病虫害和逆境的显著诱抗作用，提高了产品品质和商品性，并延长了产品的保存期。
四川省成都市5个区县的7个村进行了三个生长季节10余批次大田的双修饰共价三聚肽试验和示范，实施面积总量280余亩，主要供试作物为土豆、黄瓜、辣椒、茄子、芹菜、白菜、茶叶(白茶)、草莓、果桑、葡萄、枇杷，薯蓣以及紫金花、仙客来、蝴蝶兰、三色堇、一品红、矮牵牛、非洲凤仙花、菊花、倒挂金钟、金鱼草、玻璃海棠等二十余种花卉、蔬菜和水果，蔬菜和水果增产幅度为12％至32％，表现出对病虫害和逆境的显著诱抗作用，提高了产品品质和商品性，并延长了产品的保存期；花卉表现出对病虫害和逆境的显著诱抗作用，塑型作用较强，提高了产品商品性，并延长了花期，增加了花数和色彩更为鲜艳；茶叶提高了品质，并可以多采摘1次，经济效益显著。
云南省1个县的花卉基地，60余亩多种花卉栽培种植中，示范使用双修饰共价三聚肽产品，结果表明，对病虫害和逆境具有显著驱避和诱抗作用，对花的株形，塑型作用较强，提高了产品商品性，并延长了花期，增加了花数和色彩更为鲜艳。
云南省玉溪市的2个村镇的蔬菜种植基地，在50余亩玉米、辣椒、茄子、西芹的种植中，示范使用了双修饰共价三聚肽产品，结果表明，收获时，除对病虫害和逆境具有显著驱避和诱抗作用外，产量提高15％至38％，并提高了产品的商品性。
山西省榆次的农科试验基地，在黄瓜、生菜、芹菜种植地示范使用和验证双修饰共价三聚肽产品的功效，经严格测产，黄瓜增产25％，每亩增产黄瓜900余公斤，芹菜增产10.8％，生菜增产7.6％，取得了良好的经济效益。
山西省运城1个县的棉花种植，第一年8亩，第二年60亩，在棉花种植地示范使用和验证双修饰共价三聚肽产品的功效，经有关部门专家亲自严格测产，棉花增产幅度达31.46％以上。
青海省三江源和牧区的草原植被保护和牧区的人工种植牧草，在30000亩草场上，大面积示范使用双修饰共价三聚肽产品，结果表明，采用拌种和喷施的使用方式，牧草的产量提高了27％至33％。
新疆建设兵团2个农场的棉花使用双修饰共价三聚肽产品的试验和示范，两个农场实施了120亩的试验和示范，结果表明，棉花植株明显驱避棉铃虫，并抗黄萎病，产量提高19％-20％，经济效益显著。
该技术及其制备相关产物可以广泛应用于农业领域的蛋白多肽类农肥、农药、生长调节剂产品生产，应用于医药领域的蛋白多肽类外用药、内服药、肌肉注射药和静脉注射药产品生产，以及食品业的有关蛋白多肽产品的生产加工。
hrps蛋白之间及功能多肽片段(domain)之间的比对
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<110>四川本原作物科技有限公司
<120>zn++和麦芽糊精双修饰的hrps共价三聚肽及其制备方法
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