本发明涉及人工制备技术领域，具体涉及一种氟西汀人工抗原的制备方法。
背景技术：
氟西汀(fxt)是一种选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂(ssri)，临床上广泛用于成人抑郁症、强迫症和神经性贪食症的治疗。近年来有研究表明，氟西汀具有治疗肥胖的作用，每日服用氟西汀40～80mg，8周后体重可下降2～6kg，其效果明显超过普通安慰剂。在对包括600多例肥胖患者的研究中发现，体重下降幅度主要取决于氟西汀的每日用量。因其减肥效果明显，在利益的驱动下，不法商贩随意加大减肥药中该成分剂量甚至在各类减肥保健食品中滥用极有可能。故此，对减肥药及减肥保健食品中开展氟西汀的快速监测，可有效的控制该药物的违法滥用，对维护人民的健康安全非常必要。
目前对于减肥保健食品中的氟西汀以及氟西汀的血药浓度检测主要采用气相色谱法和高效液相色谱法等，但是存在仪器昂贵，检测费时，操作繁琐，不便于普及等问题。近年来，免疫分析法其简单、廉价、快捷、灵敏度高、适用于大批量样品检测等优点而成为主要的初步帅选分析方法，它是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质的分析方法，被广泛应用于农兽药残留分析、掺伪食品鉴定、血药浓度测定等领域。因此，有必要提供一种氟西汀人工抗原的制备方法，制备的人工抗原可用于免疫制备具有特异性的氟西汀抗体以及免疫检验试剂盒，进一步用于检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种氟西汀人工抗原的制备方法，制备方法简单。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种氟西汀人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)氟西汀半抗原中间体制备：
称取3g氟西汀盐酸盐，溶于50ml双蒸水，用1mol/lnaoh调节溶液ph值至7.5(1mol/lnaoh)，用乙酸乙酯萃取溶液3次，合并萃取液，减压蒸出乙酸乙酯，向残留物中依次加入50ml无水甲醇和0.8g丙烯酸甲酯，回流搅拌反应12h，反应结束后，将溶剂减压转干，将产物用硅胶柱层析纯化，提取得到氟西汀半抗原中间体；
2)氟西汀半抗原制备：
称取1.5g氟西汀半抗原中间体，加入10％的naoh溶液30ml，回流反应2h，然后用6mol/lhcl调节溶液的ph至5.0，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压蒸干，得到氟西汀半抗原；
3)氟西汀人工抗原制备
采用活泼酯法，将氟西汀半抗原与载体蛋白进行偶联，制备氟西汀免疫抗原和包被抗原。
优选地，所述步骤3)的具体制备步骤如下：称取20mg氟西汀半抗原、10mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，加入到2mln，n-二甲基甲酰胺中，磁力搅拌下，缓慢加入140mgn，n-二环己基碳二亚胺固体，遮光条件下搅拌反应8h，离心取上清液，在磁力搅拌下将上清液逐滴加入到8ml溶解有载体蛋白的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，室温下搅拌反应12h，在4℃下用磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)透析3d，分装，-20℃保存。
优选地，所述离心条件为5000rpm下离心5min。
优选地，所述载体蛋白为60mg牛血清蛋白或45mg卵血清蛋白。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明提供了一种氟西汀人工抗原的制备方法，首先制备出氟西汀的半抗原，并利用活泼酯法成功制备了氟西汀人工免疫原和氟西汀人工包被原，制备方法简单，产率高，容易工业化规模生产，制备的人工免疫原可进行动物免疫，取得相应的多克隆抗体，与制备的氟西汀人工包被原一起，用于建立新型免疫分析方法，为氟西汀的检测提供更加方便快速准确的途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为氟西汀半抗原的质谱图；
图2为氟西汀半抗原、载体蛋白bsa和ova、人工全抗原h-fxt-bsa和h-fxt-ova的紫光光谱图；
图3为氟西汀抗血清效价测定曲线。
图4为间接竞争elisa免疫分析方法检测氟西汀的标准工作曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：氟西汀半抗原制备和表征
称取3g氟西汀盐酸盐，溶于50ml双蒸水，用1mol/lnaoh调节溶液ph值至7.5(1mol/lnaoh)，用乙酸乙酯萃取溶液3次，合并萃取液，减压蒸出乙酸乙酯，向残留物中依次加入50ml无水甲醇和0.8g丙烯酸甲酯，回流搅拌反应12h，反应结束后，将溶剂减压转干，将产物用硅胶柱层析纯化，提取得到氟西汀半抗原中间体(m-fxt)。称取1.5gm-fxt，加入10％的naoh溶液30ml，回流反应2h，然后用6mol/lhcl调节溶液的ph至5.0，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压蒸干，得到氟西汀半抗原(h-fxt)；
利用质谱对制备的h-fxt进行分子结构鉴定表征，从图1中可以看出，反应物质谱图中确实存在m/z为382.3的质谱峰，由于本次质谱为加氢的分子离子峰[m+h]+，该产物相对分子质量与目标产物的相对分子质量381.4一致，结合反应路线，可以推断合成产物即为所需目标半抗原，说明该合成路线可以用于氟西汀半抗原的合成。同时可见，382.3的分子离子峰是最强峰，表明其为反应体系中的主要物质，说明反应产物具备相对较高的纯度。
实施例2：氟西汀人工抗原制备和表征
采用活泼酯法，将氟西汀半抗原与载体蛋白进行偶联，制备氟西汀免疫抗原。
氟西汀人工免疫原制备：称取20mg氟西汀半抗原、10mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，加入到2mln，n-二甲基甲酰胺中，磁力搅拌下，缓慢加入140mgn，n-二环己基碳二亚胺固体，遮光条件下搅拌反应8h，5000rpm下离心5min，取上清液，在磁力搅拌下将上清液逐滴加入到8ml溶解有60mg牛血清蛋白(bsa)的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中，室温下搅拌反应12h，在4℃下用磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)透析3d，得h-fxt-bsa。
氟西汀人工包被原制备：用45mg卵血清蛋白替代60mg牛血清蛋白，其它条件同上，制备氟西汀包被抗原h-fxt-ova。
用pbs缓冲液稀释h-fxt、载体蛋白bsa和ova、人工全抗原h-fxt-bsa和h-fxt-ova，利用紫外光谱法在波长200～400nm区间进行扫描鉴定，根据人工抗原紫外扫描光谱的叠加情况判断半抗原和载体蛋白是否偶联成功。从图2紫外光谱图中可以看出，h-fxt的特征吸收峰在370nm，载体蛋白bsa的特征吸收峰在320nm处，载体蛋白ova的特征吸收峰在360nm处，偶联物h-fxt-bsa和h-fxt-ova的特征吸收峰在280nm与290nm处，以上信息表明h-fxt-bsa和h-fxt-ova偶联成功。
根据公式计算人工抗原的偶联比，公式为：偶联比＝(ε偶联物-ε蛋白)/ε半抗原(ε：半抗原特征吸收波长处的摩尔吸光系数)。经计算，其结果为免疫原h-fxt-bsa和包被原h-fxt-ova的偶联比分别是14.5∶1和11.3∶1。
实施例3：多氟西汀克隆抗体的制备
选择4只月龄在3个月作用，体重1.5kg的雄性新西兰大白兔，在标准实验动物房对其进行饲养，经过连续3d的观察，在确定身体状况正常后对其进行免疫。具体过程如下：初次免疫，为提高抗原的免疫性，采用剂量为1mg/ml的由等体积的弗氏完全佐剂乳化的免疫原(h-fxt-bsa)，对大白兔进行背部多点注射免疫。加强免疫剂量相同，并用弗氏不完全佐剂乳化，分别于初次免疫后第2周、第4周、第6周、第8周加强免疫四次，并在第三次、第四次、第五次免疫完成后8～10d内，从兔子耳缘静脉中取血，并通过离心分离出血清，测定抗血清效价(图3)，可以看出随着免疫次数增加，血清效价都增大，明显4号兔子的血清效价最优，当抗血清效价值到达最高点时，采用最常用的颈动脉采血法采集兔子全血，采集到的血液在37℃下凝固2h，然后置4℃过夜，让血块收缩，于4℃离心(5000r/min)20min，取上清液-20℃保存。
实施例4：间接竞争elisa免疫分析方法对抗体特异性测定
利用间接竞争elisa对制备的血清(多克隆抗体)活性进行初步鉴定。包被原为h-fxt-ova，封闭液为0.5％的乳粉，fxt作为标准品。计算ic50值。间接竞争elisa步骤如下：
(1)包被抗原：在聚苯乙烯酶标板上用包被液h-fxt-ova(100μl/孔)，将包被好的酶标板在4℃下孵育过夜后弃去孔中包被液，并用pbst洗液洗板3次。
(2)封闭：在37℃下用封闭液封闭酶标板(150μl/孔)1h，然后弃去封闭液，并用pbst洗液洗板3次。
(3)加抗血清稀释液：用pbs缓冲液3倍梯度稀释抗血清，并在酶标板上加入不同浓度的抗血清稀释液(50μl/孔)或标准品和抗血清稀释液(各50μl/孔)，在37℃下反应1h，然后用pbst洗液洗板3次。
(4)加入酶标物：在酶标板上加入用pbs缓冲液稀释的酶标二抗(100μl/孔)，在室温下反应30min，然后用pbst洗液洗板3次。
(5)显色：在酶标板上加入底物液(100μl/孔)，在37℃下反应20min。
(6)终止：在酶标板上加入终止液(50μl/孔)，终止反应。
(7)读数：在双波长(450nm和650nm)方式下，用酶标仪读取吸光值(od)。
将fxt标准溶液稀释六个浓度，分别为3mg/ml、0.9mg/ml、0.09mg/ml、0.015mg/ml、0.005mg/ml、0.0009mg/ml，用间接竞争elisa法进行测定。根据吸光度值计算抑制率，以抑制率为纵坐标，标准样品浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，建立的标准工作曲线如图4所示。由四个点可得到一个线性回归方程y＝-9.4408ln(x)+91.091(r2＝0.998)，通过计算得到检测灵敏度(ic50值)为77.48ng/ml、检测限(ic15值)为1.91ng/ml，这一检测灵敏度可用于fxt残留的筛查。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个......”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。