本实用新型属于生物检测技术领域，具体涉及一种鹿流行性出血病检测试剂盒。
背景技术：
鹿流行性出血病(Epizootic hemorrhagic disease of deer，EHD)是一种引起鹿体温升高黏膜和浆膜面广泛出血并常处于昏迷状态下死亡为特征的严重致死性传染病，牛和羊也可以感染发病EHD。病原为鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus of deer，EHDV)，病原的检测主要通过病毒核酸的扩增进行，现已建立的方法有普通RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)检测方法和荧光RT-PCR检测方法，但此两种检测方法均需在有特殊仪器的实验室进行，难以在临床诊断中广泛推广应用。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来开发的一种新的核酸扩增方法，其原理是针对靶序列上的6个区域设计3对特异性引物，在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下发生DNA链的置换和环化，在等温条件下进行高效高灵敏度高特异性的扩增目的片段，反应不需要PCR仪等昂贵的仪器，其最低敏感检测极限是10个拷贝，比PCR高几个数量级。LAMP有极高的扩增效率，可在一小时内将靶序列扩增至109～1010倍，当反应液中加入核酸染料SYBR Green I后，在紫外灯或日光下通过肉眼即可进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变，该检测方法有利于在基层实验室进行推广。
技术实现要素：
本实用新型目的在于提供一种鹿流行性出血病RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒具有操作简便、灵敏、特异性高等优点，能够高效地检测鹿流行性出血病病毒。
根据本实用新型实施例的鹿流行性出血病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括盒体1、盒盖2和衬垫3，所述衬垫上设有：反转录酶容器孔4，内置反转录酶；10×Bst聚合酶缓冲液容器孔5，内置10×Bst聚合酶缓冲液；内引物容器孔6，内置内引物；外引物容器孔7，内置外引物；环引物容器孔8，内置环引物；dNTPs容器孔9，内置dNTPs；甜菜碱容器孔10，内置甜菜碱；Bst DNA聚合酶容器孔11，内置Bst DNA聚合酶；SYBR Green I染料容器孔12，内置SYBR Green I染料；DEPC水容器孔13，内置DEPC水；阳性对照物容器孔14，内置阳性对照物。
本实用新型选择编码EHDV群特异性结构蛋白VP7的cDNA为靶序列设计特异性引物。
(1)内引物：
FIP(Flc+F2)：5’-TCATGTTTACACCCCCCACGCAGCGGGTAATGCACAAG-3’
BIP(Blc+B2)：5’-GGTGTGATAATAGCTTATGATGGGCACTTCAATCTCGATCATACCTT-3’
(2)外引物：
F3：5’-GAATTGGGACTTTTTCGAATG-3’
B3：5’-TCATGGTTTTGTCTAAACTCAA-3’
(3)环引物：
Floop：5’-GTCACGCCCTGAGGTGTAT-3’
Bloop：5’-AAGCGCCGGTTAATGTGAAT-3’
本实用新型根据上述的引物组开发鹿流行性出血病RT-LAMP检测试剂盒。
本实用新型试剂盒还包括SYBR Green I荧光指示剂和显色液的应用。上述试剂盒在检测鹿流行性出血病中的应用所使用的反应体系如下：
反应体系为：10×聚合酶缓冲液(pH 8.8、25℃)2.5μL，内引物FIP和BIP各3μL，外引物F3和B3各1μL，环引物Floop和Bloop各2μL，dNTPs 3μL、甜菜碱2μL，反转录酶0.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、RNA模板2μL，用DEPC水补足25μL。每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。
RT-LAMP扩增结果判断：实验结果可以根据SYBR GREEN I显色液的颜色反应、1.5％琼脂糖糖凝胶电泳以及SYBR GREEN I荧光指示剂荧光信号收集情况判断。含有EHDV模板的扩增管底肉眼可见微量的白色沉淀，阴性对照无沉淀；加入染料后，含有EHDV模板的反应液呈现明显的翠绿色，而阴性对照则为淡橙色；将加入染料后的各反应管置于紫外灯下照射，含有EHDV模板的反应液发出强烈的绿色荧光，阴性不发光。琼脂糖凝胶电泳检测后，EHDV模板的反应液有特异性的梯状条带，阴性对照则无条带出现。
本实用新型为鹿流行性出血病检测提供了一种特异性好，敏感性高，快速，廉价，操作简单的试剂盒。
附图说明
图1：本实用新型鹿流行性出血病RT-LAMP检测试剂盒结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例描述本实用新型，所举实例只用于解释本实用新型，并非用于限定本实用新型的范围。
实施例1：一种鹿流行性出血病RT-LAMP检测试剂盒。
本实用新型试剂盒的结构如图1所示，包括盒体1、盒盖2和衬垫3，所述衬垫上设有：反转录酶容器孔4，内置反转录酶；10×Bst聚合酶缓冲液容器孔5，内置10×Bst聚合酶缓冲液；内引物容器孔6，内置内引物；外引物容器孔7，内置外引物；环引物容器孔8，内置环引物；dNTPs容器孔9，内置dNTPs；甜菜碱容器孔10，内置甜菜碱；Bst DNA聚合酶容器孔11，内置Bst DNA聚合酶；SYBR Green I染料容器孔12，内置SYBR Green I染料；DEPC水容器孔13，内置DEPC水；阳性对照物容器孔14，内置阳性对照物。
本实用新型选择编码EHDV群特异性结构蛋白VP7的cDNA为靶序列设计特异性引物。
(1)内引物：
FIP(Flc+F2)：5’-TCATGTTTACACCCCCCACGCAGCGGGTAATGCACAAG-3’
BIP(Blc+B2)：5’-GGTGTGATAATAGCTTATGATGGGCACTTCAATCTCGATCATACCTT-3’
(2)外引物：
F3：5’-GAATTGGGACTTTTTCGAATG-3’
B3：5’-TCATGGTTTTGTCTAAACTCAA-3’
(3)环引物：
Floop：5’-GTCACGCCCTGAGGTGTAT-3’
Bloop：5’-AAGCGCCGGTTAATGTGAAT-3’
本实用新型根据上述的引物组开发鹿流行性出血病RT-LAMP检测试剂盒。
本实用新型试剂盒还包括SYBR Green I荧光指示剂和显色液的应用。上述试剂盒在检测鹿流行性出血病中的应用所使用的反应体系如下：
反应体系为：10×聚合酶缓冲液(pH 8.8、25℃)2.5μL，内引物FIP和BIP各3μL，外引物F3和B3各1μL，环引物Floop和Bloop各2μL，dNTPs 3μL、甜菜碱2μL，反转录酶0.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、RNA模板2μL，用DEPC水补足25μL。每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。
RT-LAMP扩增结果判断：实验结果可以根据SYBR GREEN I显色液的颜色反应、1.5％琼脂糖糖凝胶电泳以及SYBR GREEN I荧光指示剂荧光信号收集情况判断。含有EHDV模板的扩增管底肉眼可见微量的白色沉淀，阴性对照无沉淀；加入染料后，含有EHDV模板的反应液呈现明显的翠绿色，而阴性对照则为淡橙色；将加入染料后的各反应管置于紫外灯下照射，含有EHDV模板的反应液发出强烈的绿色荧光，阴性不发光。琼脂糖凝胶电泳检测后，EHDV模板的反应液有特异性的梯状条带，阴性对照则无条带出现。
实施例2：鹿流行性出血病RT-LAMP检测试剂盒特异性测定。
用鹿流行性出血病RT-LAMP检测试剂盒对EHDV-1、2型、蓝舌病(BTV)、赤羽病(AKV)、水泡性口炎(VSV)进行检测，结果EHDV-1，2型呈明显阳性，而阴性对照、空白对照、AKV、BTV、VSV病毒则呈阴性反应，无交叉反应，说明该方法特异性强。