专利名称：一种急性出血性结膜炎检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种与急性出血性结膜炎相关的肠 道病毒70型(EV70)和柯萨奇A24型病毒变异株(CA24v)的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
急性出血性结膜炎俗称红眼病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定报告的丙 类传染病之一。该病发病率高，传播迅速，波及范围广，传染性极强，潜伏期很短，接触传染 源后12 48小时内双眼即发病，给人们的生产和生活带来较大影响。人群普遍易感，成人 较儿童发病人数多。世界上很多地区都报道过急性出血性结膜炎的暴发和流行，在世界范围内暴发过的急性出血性结膜炎疫情，主要病原为EV70和CA24，继而 1970年在新加坡，急性出血性结膜炎首次被证实由CA24v(CA24病毒变异株)所引起。在我 国，急性出血性结膜炎曾经有两次大的流行，分别是1971年和1988年，其致病原均为EV70 和CA24v。由于该病极强的传染性，暴发后感染人数众多，给经济和医疗资源带来巨大的损 失。肠道病毒EV70和柯萨奇病毒都属于小核糖核酸病毒科，病毒呈球形，电子显微镜 观察直径为23 30nm，病毒衣壳呈二十面立体对称。一般鉴定病毒的方法主要有以下几种 方法(1)电子显微镜鉴定，病毒体的负染和超薄切片。该方法可以直接利用显微镜观察病 毒颗粒，但是对操作者要求比较高；(2)免疫荧光鉴定，该方法是利用荧光素特异性标记来 观察着色荧光，根据抗体特异性来判断病原体。免疫荧光法具有快速，特异的优点。(3)血 清学方法鉴定等手段，也是病毒鉴定的常规手段，通过血清学鉴定从而判断病毒的种属和 亚型。除了以上几种方法外，现在大多数实验室都采用聚合酶链式反应来进行病毒的鉴定。 EV70和CA24v病毒都是单链的RNA，因此采用逆转录聚合酶链式反应进行病毒核酸的扩增。实时荧光PCR技术是一种直接检测核酸并进行核酸定量的分子生物学技术，具有 灵敏度高，特异性好，简单，廉价等优点。它在一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号积累实时监测PCR反应进程，通过结果数据分析对起始模板进行定量。本发明采用 实时荧光PCR技术中的双色荧光PCR方法，即对两个目的病毒核酸(EV70和CA24v)进行扩 增，根据标记的双色荧光，判断病毒核酸扩增的情况。本发明涉及的试剂盒可广泛地运用于 由EV70和CA24v引起的急性出血性结膜炎的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种对与急性出血性结膜炎相关的肠道 病毒70型(EV70)和柯萨奇A24型病毒变异株(CA24v)进行检测的试剂盒，所述试剂盒灵 敏度高，特异性好，便于检测。本发明在对GENBANK上所有已知的EV70和CA24v病毒株的核酸序列进行比对的 基础上，寻找EV70和CA24v核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计EV70和CA24v的 靶核苷酸引物和探针。这些引物探针在含有耐热DNA聚合酶，高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg2+等的PCR反应缓冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现体外核酸的循环扩
+飽
+曰o本发明所提供的EV70和CA24v病毒株检测试剂盒，包括下列组成(1) RT-PCR反应缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KC1盐缓冲液组成；(2)引物探针混合液为PCR扩增时必需的特异正反向引物和荧光探针，序列选自 EV70和CA24v的高度保守区域，；荧光探针为双色标记；(3) RT-PCR反应酶系由dNTPs、热启动Taq酶和MMLV酶及稳定剂组成；(4) DEPC H20 ；(5)EV70和CA24v阳性质控品为MS2载体假病毒；(6)EV70和CA24v阴性质控品为生理盐水。RT-PCR 反应缓冲液优选由 Tris-HCl (50mmol/L, pH8. 0)、MgCl2 (8mmol/L)、 KC1 (250mmol/L)组成。EV70靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5’ -CAACAAGTACCTCATCCAT TCAAAAG-3，(SEQ ID NO 1)和 5，-GTAAACAATTCCATCTTCCTCCT-3，(SEQ ID NO :2)，所述的用 于荧光PCR扩增和检测体系的EV70寡核苷酸探针，其序列是5，-TTCTTCATCTGGACTTTGAACA CCAGAGAACT-3’ (SEQ ID NO :3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团 BHQ1 ；用于CA24v靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是 5‘-GAGTGCTTGCCCAGATTTTAG-3‘(SEQ ID NO 4)和 5，-ATAACGGTGTCAATGGTCTCCTC-3，(SEQI D NO 5)，用于荧光PCR扩增和检测体系的CA24v寡核苷酸探针，其序列是5，-CGTGCGTCTGT TGAGAGACACCAAC-3，(SEQ ID NO :6)，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭 基团BHQ1。组成(2)中所述的引物浓度均优选为0.2mmol/L，所述的探针浓度均优选为 0.lmmol/L0RT-PCR反应酶系是由热启动Taq酶、MMLV、dNTPs组成，可采用市售的热启动酶、 MMLV、dNTPs产品，如Qiagen公司产品，其中每人份试剂热启动Taq酶的用量为5U、MMLV用 量为 10U、dNTPs 为 lOmmolo本发明试剂盒中进行待检标本检测同时进行两种质控品的检测，仅当EV70、CA24v 阳性质控品检测呈阳性，阴性质控品检测呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种检测急性出血性结膜炎核酸的检测 方法，包括如下步骤(1)标本前处理；(2)核酸提取；(3)根据本发明的试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增及检测a.试剂准备按比例取相应量的引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶 系充分混勻后按30 u 1/管分装成PCR反应管，备用。b.加样向PCR反应管中，分别加入提取后的阴、阳性质控品、样本RNA溶液 20 yl，盖紧管盖，放入仪器样品槽。c. PCR 扩增；
(4)结果分析。本发明的PCR扩增的条件优选为50°C 15分钟，95°C 15分钟；94°C 15秒，55°C 45 秒，40个循环(55°C 45秒退火阶段收集荧光信号)。本发明与现有技术相比，具有如下优点①可对EV70和CA24v病毒核酸扩增水平 进行检测，可同时反映出患者体内EV70和CA24v病毒感染的状态，有助于疾病的早期诊断 和治疗，并可用于监测治疗效果和评估患者预后；②荧光PCR技术针对该病毒核酸特异性 序列设计引物、探针，具有更高的特异性，具有操作简便、价格低廉的优点，更适用于大多数 患者检测；③闭管检测不需PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环 境污染。本发明的试剂盒在扩增待检标本时，检测过程由市售的荧光定量PCR仪自动完 成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于由于EV70和 CA24v病毒引起的急性出血性结膜炎的检测、药物治疗及预后等多个领域研究。
图1实施例1中PCR扩增的反应条件；图2实施例2中试剂盒阴性质控品的扩增曲线；图中没有S型扩增曲线，说明检测样本中没有EV70和CA24v病毒核酸的扩增；图3实施例2中试剂盒阳性质控品的扩增曲线；图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明检测样本中有EV70病毒核酸的扩增；图4实施例2中试剂盒阳性质控品的扩增曲线；图中HEX通道的扩增曲线为S型，说明检测样本中有CA24v病毒核酸的扩增；图5实施例2中3例阴性样本的扩增曲线；图中没有S型扩增曲线，说明检测样本中无EV70和CA24v病毒核酸的扩增；图6实施例2中1例阳性眼结膜囊泪液样本的扩增曲线；图中FAM标记的扩增曲线为S型，说明检测样本中有EV70病毒核酸的扩增。表示 样本中存在EV70病毒感染；图7实施例中1例阳性眼结膜拭子样本的扩增曲线；图中HEX扩增曲线为S型，说明检测样本中有CA24v病毒核酸的扩增。表示样本 中存在CA24v病毒感染；图8实施例2中1例阳性样本的扩增曲线；图中FAM通道和HEX通道的扩增曲线均为S型，说明检测样本中有EV70和CA24v 病毒核酸的扩增。表示存在EV70和CA24v病毒的混合感染。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1
急性出血性结膜炎检测试剂盒及其使用1、制备包括下列组成成分的试剂盒引物探针混合液(25iU/管)1管EV70靶多核苷酸扩增的正向和反向引物 的序列分另IJ 是 5，-CAACAAGTACCTCATCCATTCAAAAG-3，(SEQ ID NO 1)禾P 5，-GTAAACAA TTCCATCTTCCTCCT-3，(SEQ ID NO :2)，EV70 寡核苷酸探针，其序列是 5，-TTCTTCATCTGG ACTTTGAACACCAGAGAACT-3，(SEQ ID NO 3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM 和荧光淬灭基团BHQ1 ；用于CA24v靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是 5，-GAGTGCTTGCCCAGATTTTAG-3，(SEQ ID NO 4)和 5，-ATAACGGTGTCAATGGTCTCCTC-3，(SEQ ID NO 5)，用于荧光PCR扩增和检测体系的CA24v寡核苷酸探针，其序列是5，-CGTGCGTCTG TTGAGAGACACCAAC-3，(SEQ ID NO :6)，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭 基团BHQ1 ；RT-PCR 反应缓冲液(250 ii 1/ 管)1 管由 Tris-HCl (50mmol/L，pH8. 0)、 MgCl2 (8mmol/L)、KC1 (250mmol/L)组成；RT-PCR反应酶系(75 ill/管)1管Taq酶、MMLV、dNTPs组成，其中每人份试剂热 启动Taq酶的用量为5U、匪LV用量为10U、dNTPs为lOmmol ；阳性质控品(200 ill/管)1管:MS2载体假病毒；阴性质控品(200 ill/管)1管生理盐水；DEPC H20 (2000 y 1/ 管)1 管。2、标本的采集、保存和运输2. 1适用标本类型眼结膜囊泪液、眼结膜拭子或刮取物。2. 2标本采集、保存和运送标本应在起病1 3天以内采集。具体方法用灭 菌棉拭子涂擦翻转的上、下睑结膜并拭取泪液立即投入装有灭菌生理盐水或Eagle液 或0.5%水解乳蛋白Hanks液2mL的小试管中，贴好标签，置冰壶内携至实验室或低温 (_20°C _70°C )冻存。标本长途运送采用干冰。3、核酸提取使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取试剂盒。按照 QIAamp Viral RNA Mini Kit 说明书进行，最后收集到50 yl RNA溶液，直接进行检测或保存于-20°C。4、实时荧光定量PCR扩增及检测4. 1试剂准备按比例取相应量的引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR反应 酶系(引物探针混合液1 P 1+PCR反应液10 u 1/人份+RT-PCR酶系3 ill/人份+DEPC H20 16ul),充分混勻后按30 u 1/管分装成PCR反应管，备用。4. 2加样向PCR反应管中，分别加入提取后的阴、阳性质控品、样本RNA溶液 20 yl，盖紧管盖，放入仪器样品槽。4. 3 编辑(ABI Prism 7500 荧光定量 PCR 仪)打开Setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在Name栏中 设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector，选择R印orter为FAM 和Quencher为BHQ1，再选择Importer为HEX和Quencher为BHQ1后关闭窗口。在 PassiveReference中选择(none)。打开instrument窗口设置循环条件50°C 15分钟， 95°C 15分钟；94°C 15秒，55°C 45秒，40个循环。(见附图1)。所有设置完成后保存文件，运行。4. 4结果分析反应结束后保存检测数据文件。在Results下打开Amp plot窗口。选择分析的目 的样品所在位置。将Baseline数值改为start :3，stop 10，并打开manual设定Threshold 1.5 士 100000。双击 Rn 坐标上数值打开 Graph settings 窗 口，将 Post Run Settings 中 Log 改为 Linear, OK 后打开 Analysis preferences 窗□,在 Analysis 菜单下选择 Analyze 自动分析结果。实施例2应用急性出血性结膜炎检测试剂盒检测临床样品选取3例经过血清学方法鉴定为EV70和CA24v病毒阴性，3例经过血清学方法鉴 定为EV70和CA24v病毒阳性的标本，标本核酸提取，PCR扩增及结果分析参照实施例1进 行，同时进行阴，阳性质控品的检测。检测结果解释阴性质控品的扩增曲线不规则或无CT值，(见附图2)阳性质控品 的扩增曲线为明显S型曲线(见附图3，4)，在试剂盒质控范围内，说明检测体系可以有效地 检测到EV70和CA24v病毒核酸的扩增(见附图5，6，7，8).阴阳性质控品在同以实验中均 符合试剂盒的质控要求。本次试验中6例标本的检测结果与血清学鉴定结果完全吻合，说明利用本试剂盒 检测标本中EV70和CA24v病毒核酸扩增水平是可行的。本试剂盒操作简便，检测时间短， 可实现高通量检测，加之其价格低廉，能够被大多数急性出血性结膜炎患者所承受。
权利要求
一种急性出血性结膜炎核酸检测试剂盒，其特征在于包括下列组成(1)RT-PCR反应缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl盐缓冲液组成；(2)引物探针混合液为PCR扩增时必需的肠道病毒70型(EV70)和柯萨奇A24型病毒变异株(CA24v)特异性正反向引物和荧光探针，序列选自EV70和CA24v的高度保守区域，荧光探针为双色标记；(3)RT-PCR反应酶系由dNTPs、热启动Taq酶和MMLV酶及稳定剂组成；(4)DEPC H2O；(5)EV70和CA24v阳性质控品为MS2载体假病毒；(6)EV70和CA24v阴性质控品为生理盐水。
2.根据权利要求1所述急性出血性结膜炎核酸检测试剂盒，其特征在于所述的 RT-PCR 反应缓冲液中 Tris-HCl 为 50mmol/L、pH8. 0，MgCl2 为 8mmol/L，KC1 为 250mmol/L。
3.根据权利要求1所述急性出血性结膜炎核酸检测试剂盒，其特征在于所述的 EV70PCR 扩增特异正向引物序列是 5，-CAACAAGTACCTCATCCATTCAAAAG-3，(SEQ ID NO 1), 反向引物序列是 5，-GTAAACAATTCCATCTTCCTCCT-3，(SEQ ID NO :2)。
4.根据权利要求1所述急性出血性结膜炎核酸检测试剂盒，其特征在于所述的EV70 荧光探针序列是 5，-TTCTTCATCTGGACTTTGAACACCAGAGAACT-3，(SEQ ID NO :3)，探针的两端 分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。
5.根据权利要求1所述急性出血性结膜炎核酸检测试剂盒，其特征在于所述的 CA24vPCR 扩增特异正向引物序列是 5，-GAGTGCTTGCCCAGATTTTAG-3，(SEQ ID N0:4)，反向 引物序列是 5，-ATAACGGTGTCAATGGTCTCCTC-3，(SEQ ID NO :5)。
6.根据权利要求1所述急性出血性结膜炎核酸检测试剂盒，其特征在于所述的CA24v 荧光探针序列是5，-CGTGCGTCTGTTGAGAGACACCAAC-3，(SEQ ID NO :6)，探针的两端分别结 合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。
7.根据权利要求1所述急性出血性结膜炎核酸检测试剂盒，其特征在于所述的PCR 扩增引物浓度为0. 2mmol/L，所述的探针浓度为0. lmmol/L。
8.根据权利要求1所述急性出血性结膜炎核酸检测试剂盒，其特征在于所述的 RT-PCR反应酶系中每人份试剂热启动Taq酶的用量为5U、MMLV用量为10U、dNTPs为 lOmmol。
9.一种检测急性出血性结膜炎核酸的检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)标本前处理；(2)核酸提取；(3)根据权利要求1的试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增及检测a.试剂准备按比例取相应量的引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系充 分混勻后按30 u 1/管分装成PCR反应管，备用；b.加样向PCR反应管中，分别加入提取后的阴、阳性质控品、样本RNA溶液20yl，盖 紧管盖，放入仪器样品槽；c.PCR扩增；(4)结果分析。
10.根据权利要求9所述急性出血性结膜炎核酸检测方法，其其特征在于所述的PCR扩增条件为50°C 15分钟，95°C 15分钟；94°C 15秒，55°C 45秒，40个循环。
全文摘要
本发明涉及一种与急性出血性结膜炎相关的肠道病毒70型(EV70)和柯萨奇A24型病毒变异株(CA24v)的检测试剂盒及其检测方法，本发明试剂盒包含RT-PCR反应缓冲液、为PCR扩增时必需的肠道病毒70型(EV70)和柯萨奇A24型病毒变异株(CA24v)特异性正反向引物和荧光探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O、EV70和CA24v阳性质控品、阴性质控品。本发明结果可靠稳定，操作简单，快速，能够迅速检测出由肠道病毒70型和柯萨奇A24型病毒变异株所引起的急性出血性结膜炎，从而做好早期防疫工作。
文档编号C12Q1/70GK101864496SQ20101014574
公开日2010年10月20日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者何宇平, 何琼, 张琳, 方筠, 曹敏, 王健, 田桢干, 章琪, 简大钊, 董瑞华, 陈华云, 高秀洁 申请人:中山大学达安基因股份有限公司;中华人民共和国上海出入境检验检疫局