奶酪风味物质的生产及其在食品中的应用的制作方法

专利名称：奶酪风味物质的生产及其在食品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物学以及食品学领域；更具体地，本发明涉及奶酪风味物质的生产及其在食品中的应用。
背景技术：
奶酪风味(cheese flavor，也称乳酪或干酪风味)是一种多组分混合风味体系。 在奶酪中大约有超过3000多种不同的挥发性和不挥发性物质，风味由挥发性物质产生，也称风味挥发性物质。不同类型奶酪中的典型风味挥发性物质可分为6组脂肪酸类(如乙酸、丙酸、丁酸)、酮类(如2-庚酮、2-壬酮、2-丁酮)、酯类(如丁酸乙酯、癸酸乙酯)、醛类 (如3-甲基-正丁醛、2-甲基-正丁醛、苯甲醛)、醇类(如1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、苯基乙醇)和硫化物(如二硫化物、甲硫醇)。奶酪风味物质的产生途径，主要是乳脂原料中的脂肪、蛋白质在酶的作用下产生具有风味的产物(产物中通常还包含原料乳中自带的风味组合物)。一般较复杂的奶酪风味物质则是在微生物(实际上是微生物代谢产生的酶)的作用下产生的。奶酪风味物质的形成与原料底物以及生产时使用的发酵剂(微生物)有关。常见的几种奶酪风味物质，如应用最广的蓝纹奶酪(Blue Cheese，也称蓝纹乳酪、 蓝纹干酪等)风味物质，另外还有比然奶酪(Brie Cheese)，马苏里拉奶酪(Mozzarella Cheese)，车达奶酪(Cheddar Cheese)，帕尔玛奶酪(Parmesan Cheese)风味物质等。目前为止，利用霉菌进行发酵生产奶酪风味物质的研究仅限于蓝纹奶酪风味物质。US3100153 (1963/08/06)中公开的一种利用 penicillium roqueforti 及其突变株 penicillium camemberti液体深层发酵生产Blue Cheese风味物质的方法。经研究表明，产生典型的蓝纹奶酪风味的关键成分为甲基酮，参见文献JOHN Ε. KINSELLA and DAN HWANG. Biosynthesis of Flavors by Penicilliumroqueforti. BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. XVIII，PAGES927-938 (1976)，具体来说，霉菌孢子、菌丝体在生长代谢过程中分泌复杂酶系，这些酶系将乳制品中蛋白质，脂肪等大分子物质降解为风味前体物质和风味基料物质，如脂肪酶可将脂类分解为脂肪酸和甘油，而脂肪酸在β-氧化酶作用下通过经典β-氧化途径代谢为甲基酮。这些年来，技术人员对能够生产蓝纹奶酪风味物质的仅有的两种霉菌菌种体系 (娄地青霉 Penicillium roqueforti ；灰绿青霉 Penicillium glaucum)进行了补充和完善。然而随着人们对食品的各方面要求不断提高，尤其是口味日趋多样化，获得新型奶酪风味物质，或者筛选获得生产原有或新的奶酪风味物质的菌株/种一直是本技术领域的热门课题。然而随着人们对食品的各方面要求不断提高，尤其是口味日趋多样化，获得新型奶酪风味，或者筛选获得生产原有或新的奶酪风味物质的菌株一直是本技术领域的热门课题。

发明内容
本发明的目的在于提供新的生产奶酪风味物质的菌株。本发明的目的还在于提供奶酪风味物质的生产及其在食品中的应用。在本发明的第一方面，提供一种用于生产奶酪风味物质的菌株的筛选方法，该筛选方法包括从牦牛奶及其加工制品(例如天然酥油)中定向筛选出霉菌的步骤，所述的霉菌能够以含有乳、油、脂类的物质和/或其酶解产物为底物来发酵生产甲基酮类物质。天然酥油系从牦牛奶中提取得到的稀奶油(脂肪含量30-80% )、浓缩酥油(脂肪含量80-98%)、无水酥油(脂肪含量98-100%)等，诸如来自尼泊尔、蒙古、印度、中国(青海、甘肃、新疆、四川、西藏、云南、内蒙古)等地的牦牛奶。发明人首次发现可以从牦牛奶及其加工制品(例如天然酥油)筛选新的能够产生奶酪风味物质的微生物。在本发明的另一方面，提供爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)、光孢青霉(Penicillium glabrum)、瑞士木霉(Trichoderma reesei)、覃青霉(Penicillium paxilli)、鲜红青霉(Penicillium chermesinum)、曲霉(Aspergillus sp)、枝抱霉 (Cladosporiumsp)中任一菌株或其变体在生产奶酪风味物质方面的应用。在一个优选例中，所述的菌株或其变体筛选自含有乳、油、脂类的物质。在另一优选例中，所述的含有乳、油、脂类的物质为天然酥油。在本发明的另一方面，提供经分离的菌株，其是爪哇正青霉CFR0802，其保藏号为CGMCC NO. 3551 ；或其变体；光孢青霉CFR0801，其保藏号为CGMCC NO. 3552 ；或其变体；瑞士木霉CFR0803，其保藏号为CGMCC NO. 3553 ；或其变体。发明人从天然酥油中筛选出了上述三株能够生产典型奶酪风味的新菌株。在本发明的另一方面，提供前述任一经分离的菌株的用途，用于发酵生产奶酪风味物质。在本发明的另一方面，提供一种生产奶酪风味物质的方法，该方法包含采用前述任一经分离的菌株或任意几种的组合的孢子或菌丝体，以含有乳、油、脂类的物质和/或其酶解产物为发酵底物，经液体发酵或固体发酵，获得具有奶酪风味的发酵产物。在一优选例中，所述的菌丝体经2-3级扩大培养的菌丝体。在一个优选例中，所述的液体发酵包括先制备所述任一菌株或任意几种的组合的孢子悬浮液或菌丝体液，再将有效量的孢子悬浮液或菌丝体液接种到液态形式的发酵底物中，获得液态形式的发酵产物，发酵温度为25-35°C，发酵时间为24-48h。在另一优选例中，所述方法还包括收集所述液态形式的发酵产物或其浓缩液，作为风味物质产品；或者，对所述液态形式发酵产物进行除菌处理，收集处理后所得到的具有奶酪风味的液体，作为风味物质产品；或者，提取所述液态形式发酵产物中的挥发性物质作为风味物质产品；或者，对所述液态形式发酵产物进行干燥处理，收集处理后所得到的具有奶酪风味的固体，作为风味物质产品。在另一优选例中，所述的除菌处理采用离心、过滤任意一种或两种的组合。在另一优选例中，提取所述液态形式发酵产物中的挥发性物质采用蒸馏提取、吸附提取、萃取中的任意一种或几种的组合。在另一优选例中，所述的干燥处理采用冻干或喷雾干燥。在另一优选例中，所述的固体发酵包括先制备所述的任一菌株或其组合的孢子悬浮液或菌丝体液，再将有效量的孢子悬浮液或菌丝体液接种于固态形式发酵底物表面获得固态形式发酵产物的过程，发酵温度为 15-25°C，发酵时间为10-15天。在另一优选例中，所述方法还包括收集所述的固态形式发酵底物，作为风味物质产品；或者，提取所述固态形式发酵产物中的挥发性物质作为风味物质产品；或者，对所述固态形式发酵底物进行干燥处理，收集处理后所得到的具有奶酪风味的固体，作为风味物质产品。在另一优选例中，提取所述液态形式发酵产物中的挥发性物质采用蒸馏提取、吸附提取、萃取中的任意一种或几种的组合。在另一优选例中，所述的干燥处理采用冻干或喷雾干燥。在另一优选例中，所述的发酵产物中至少包含2-庚酮、2-戊酮和2-壬酮。在另一优选例中，所述的含有乳、油、脂类的物质选自乳制品、动植物油脂或微生物油脂。在本发明的另一方面，提供采用前述任一方法获得的奶酪风味物质。在本发明的另一方面，提供所述奶酪风味物质在食品领域的应用。在本发明的另一方面，提供一种食品制作方法，该方法包括将合适量的前述任一方法获得的奶酪风味物质加入食品基料中之前、同时或之后，对所述奶酪风味物质进行灭菌。在本发明的另一方面，提供真菌发酵产生的奶酪风味物质在油脂食品方面的应用。在另一优选例中，所述的油脂食品为人造奶油、酥油、酥皮油。在本发明的另一方面，提供油脂食品的制造方法，该方法包括将真菌发酵产生的奶酪风味物质与制造油脂食品的基料混合并灭菌的步骤。在一个优选例中，所述的制造方法是先将真菌发酵产生的奶酪风味物质进行均质后再与制造油脂食品的基料混合。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1、实施例1所获得的发酵产物中的风味挥发性物质的GC-MS检测结果图谱；图2、实施例2所获得的发酵产物中的风味挥发性物质的GC-MS检测结果图谱；图3、实施例3所获得的发酵产物中的风味挥发性物质的GC-MS检测结果图谱；
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上述各图谱中，横轴代表时间/min，纵轴代表丰度。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究和试验，找到了一种有效的筛选方法，筛选到可产生奶酪风味的新型微生物，该微生物以含有乳、油、脂类的物质等为底物发酵生产获得具有奶酪风味的物质；该奶酪风味物质可广泛地应用于食品、香精香料生产领域。菌株筛选方法本发明提供了一种用于生产奶酪风味物质的菌株的筛选方法，该筛选方法包括从牦牛奶及其加工制品(例如天然酥油)中定向筛选出霉菌的步骤，所述的霉菌能够以含有乳、油、脂类的物质和/或其酶解产物为底物来发酵生产甲基酮类物质。在本发明的一个具体实施方式
中，从市售的天然酥油(样品中心)取样，与添加了表面活性剂(通常为吐温-80)的无菌水混勻制备不同浓度的菌悬液(例如10_3、10_4、10_5、 10_6菌悬液)；再将不同浓度菌悬液均勻涂布于预先准备的霉菌选择性培养基(即添加了链霉素的PDA或孟加拉红固体培养基，仅霉菌能够存活下来)；经一段时间培养，挑取存活下来的不同形态的单菌落划线于PDA或孟加拉红斜面培养基上培养；再分别将各菌株接种于合适的发酵底物(含有乳、油、脂类的物质和/或其酶解产物，例如全脂奶粉溶液)中发酵一段时间(较佳的，24h-48h)，对获得的发酵产物进行风味感官评价测试和GC-MS检测，选取获得了奶酪风味的菌株，保藏备用。优选的，选取获得了典型奶酪风味(特别是酮类风味)的菌株，或者说筛选能够产生酮类风味挥发性物质的菌株；更优选的，选取获得了甲基酮风味(一种非常典型的奶酪风味)的菌株，即能够产生甲基酮风味挥发性物质的菌株。本发明提供了爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)、光孢青霉 (Penicilliumglabrum)、瑞士木霉(Trichoderma reesei)、覃青霉(Penicillium paxilli)、鲜红青霉(Penicillium chermesinum)、曲霉(Aspergillus sp)、枝抱霉 (Cladosporium sp)中任一菌株或其变体在生产奶酪风味物质方面的应用。较佳地，所述的微生物在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)的保藏号是CGMCC NO. 3551 (其命名为爪哇正青霉CFR0802 ；属于正青霉属，爪哇正青霉菌种)，CGMCC NO. 3552 (其命名为光孢青霉CFR0801 ；属于青霉属，光孢青霉菌种) 或 CGMCC NO. 3553 (其命名为瑞士木霉(Trichoderma reesei) CFR0803 ；属于木霉属，瑞士木霉菌种)。这三株菌株经上述的菌株筛选方法获得。菌株鉴定上述保藏的三株菌株送至广东省微生物分析检测中心(委托登记号粤微检 (2009) ZD0191号)进行形态和分子生物学方面的鉴定。鉴定依据《真菌鉴定手册》(魏景超遗著，上海科学技术出版社)，《真菌的形态和分类》(戴芳谰遗著，科学出版社)，《分子克隆实验指南》(第三版，金冬赝、黎孟枫等译，2002科学出版社)，对上述菌株的单菌落的显微镜图片进行形态分析，以及对提取的总DNA进行ITS分析，鉴定结果如下1、CGMCC NO. 3551菌体形态闭囊壳呈现球形或近球形，直径70 200 μ m,黄褐色；子囊单生，球形，近球形或近椭圆形，子囊孢子椭圆形；分生孢子梗发生于气生菌丝，孢梗茎50 120X2. 0 2. 5 μ m，壁光滑；帚状枝单轮生；瓶梗7. 0 11 X 2. 0 2. 5 μ m，瓶状；分生孢子球形或近球形，2. 5 3. 0X2. 1 2. 5 μ m，壁光滑。菌落形杰:①、察氏培养基培养菌落的形态描述菌落培养7天后，直径约为30 50mm，有放射性皱纹，质地绒状兼絮状和颗粒状； 分生孢子面蓝灰色，近于烟灰色，淡灰橄榄色，菌丝体淡黄色，紫红色；反面黄褐色，可溶性色素黄棕色。②、麦芽汁培养基菌落的形态描述菌落培养7天，直径约40 60mm，放射状皱纹较多，质地绒状，颗粒状；分生孢子面灰绿色，近于豆绿色；反面黄褐色，无可溶性色素。③、PDA培养基菌落的形态描述菌落培养7天后，直径约20mm，平坦，质地绒状至颗粒状；分生孢子面灰绿色，无渗出液；反面淡黄褐色，无可溶性色素。④、菌体在显微镜下形态描述闭囊壳呈现球形或近球形，直径70 200 μ m,黄褐色；子囊单生，球形，近球形或近椭圆形，子囊孢子椭圆形；分生孢子梗发生于气生菌丝，孢梗茎50 120X2. 0 2. 5 μ m，壁光滑；帚状枝单轮生；瓶梗7. 0 11 X 2. 0 2. 5 μ m，瓶状；分生孢子球形或近球形，2. 5 3. 0X2. 1 2. 5 μ m，壁光滑。综上，菌体、菌落形态与爪哇正青霉(Eupenicilliumjavanicum)的最相似。分子生物学鉴定结果CGMCC No.3551 &18S rDNA 序列与爪哇正青霉(EupeniciIlium javanicum) AFTOL-ID 429 的 18S rDNA 序列同源性达 98. 9% 2、CGMCC NO. 3552菌体形态孢梗茎壁平滑，顶端膨大；帚状枝单轮生，偶有梗基状分枝；瓶梗每轮8 16个； 8. 0 11 X 2. 5 3. 0 μ m，瓶状；分生孢子球形或近球形，2. 5 3. 5 μ m，壁光滑或近于平滑；分生孢子链通常呈现紧密的圆柱状。菌落形态①、察氏培养基培养菌落的形态描述菌落培养7天后，直径约为25mm，平坦，质地绒状兼絮状；分生孢子面灰橄榄色，菌丝体白色，无渗出液；反面淡黄褐色，无可溶性色素。②、麦芽汁培养基菌落的形态描述菌落培养7天后，直径35 55mm，中部有放射状皱纹，质地绒状兼絮状，分生孢子结构较多，分生孢子面橄榄色，菌丝体白色，无渗出液，反面浅黄褐色，无可溶性色素。③、PDA培养基菌落的形态描述菌落培养7天后，直径约20mm，平坦，质地绒状至颗粒状；分生孢子面灰绿色，无渗出液；反面淡黄褐色，无可溶性色素。④、菌体在显微镜下形态描述
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孢梗茎壁平滑，顶端膨大；帚状枝单轮生，偶有梗基状分枝；瓶梗每轮8 16个； 8. 0 11 X 2. 5 3. 0 μ m，瓶状；分生孢子球形或近球形，2. 5 3. 5 μ m，壁光滑或近于平滑；分生孢子链通常呈现紧密的圆柱状。综上，菌体、菌落形态与光孢青霉(Penicillium glabrum)的最相似。分子牛物学鉴定结果CGMCC No.3552 &18S rDNA 序列与光孢青霉(Penicillium glabrum) ALI218 的 18S rDNA序列同源性达99. 7 %。3、CGMCC NO. 3553菌体形杰分生孢子梗为菌丝的短侧枝，其上对生分枝，分枝角度几乎直角，对生瓶状小梗， 瓶梗锥形，5. 0 8X2. 5 3. 7 μ m，基部稍窄，中部较宽。分生孢子大多数为球形，亚球形，倒卵形，直径2. 0 3. 0 μ m，淡绿色；厚垣孢子间生或顶生于菌丝中，壁光滑，直径可达 12 μ m。菌落形杰:①、察氏培养基培养菌落的形态描述生长差，菌丝稀疏，细，培养10天后在培养基表面出现散落的产孢丛束区。②、麦芽汁培养基菌落的形态描述菌落生长迅速，培养7天，菌落铺满整个9cm培养皿，菌落表面为白色致密平坦的菌丝，棉絮状，产孢稍慢，培养9天后在培养基表面靠边缘处出现绿色的产孢丛束区，排成圆心轮纹；菌落反面无色。③、PDA培养基菌落的形态描述生长速度快，培养7天，菌落铺满整个9cm培养皿，菌落表面为白色致密平坦的菌丝，棉絮状；产孢稍慢，培养9天后在培养基表面出现绿色的产孢丛束区，菌落反面淡黄绿色。④、菌体在显微镜下形态描述分生孢子梗为菌丝的短侧枝，其上对生分枝，分枝角度几乎直角，对生瓶状小梗， 瓶梗锥形，5. 0 8X2. 5 3. 7 μ m，基部稍窄，中部较宽。分生孢子大多数为球形，亚球形，倒卵形，直径2. 0 3. 0 μ m，淡绿色；厚垣孢子间生或顶生于菌丝中，壁光滑，直径可达 12 μ m。综上，菌体、菌落形态与瑞士木霉(Trichoderma reesei)的最接近。分子生物学鉴定结果CGMCC No. 3553 的 18S rDNA 与红褐肉座菌 Hypocrea jecorina 同源性达 99. 9% (红褐肉座菌Hypocrea jecorina的无性阶段为瑞士木霉(Trichodermareesei)。生产奶酪风味物质的方法因此，本发明的生产奶酪风味物质的方法包括将选自爪哇正青霉 (Eupenicillium javanicum)、光抱青霉(Penicillium glabrum)、瑞士木霉(Trichoderma reesei)、覃青霉(Penicillium paxilli)、鲜红青霉(Penicilliumchermesinum)、曲霉 (Aspergillus sp)、枝孢霉(Cladosporium sp)中任一菌株或其变体(较佳地，选自CGMCC N0. 3551, CGMCC NO. 3552或CGMCC NO. 3553)加入到发酵底物中进行发酵生产，获得发酵产物，所述的发酵产物具有风味，所述的风味是奶酪风味。所述的发酵底物一般是提供含有乳、油、脂类的物质；或是经脂肪酶酶解上述物质后形成的酶解产物；或是两者的混合物。含有乳、油、脂类的物质包括但不限于乳制品、动植物油脂或微生物油脂。含有乳、油、脂类的物质优选，海洋生物油脂，例如藻油。在另一优选例中，所述乳制品为全脂奶粉溶液(较佳地为5-40%全脂奶粉溶液)、 奶油(cream)、黄油(Butter)、乳脂(milk fat)、哺乳动物(如牛、羊)奶等。在另一优选例中，所述植物油脂可以为椰子油、大豆油、玉米油、椰子油、菜油、豆油、红花油、高油酸红花油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、橄榄油、月见草油、棉籽油、米糠油、 葡萄籽油、亚麻籽油、花生油、杏仁油、胡桃油、麦芽油、芝麻油等。所述的动物油脂可以为牛油等。上述的动植物油脂、微生物油脂等也可以使用这类油脂经或不经物理或化学改性 (分提、氢化、酯交换)的混合物或单体；也可以是转基因油脂。所述的微生物可以以孢子形态加入到发酵底物中，也可以以菌丝体形态加入到发酵底物中；发酵底物可以是液态底物(进行液体发酵)或固态底物(进行固体发酵)。较佳地，所述的微生物在加入到底物前，经过种子培养，从而形成菌丝体。所述的种子菌培养基中培养，形成一级种子(菌丝体)；再将一级种子接种到种子培养基中，形成二级种子(菌丝体)；较佳地，还可进一步形成三级种子(菌丝体)。孢子或菌丝体加入(接种)到发酵底物中的用量是有效量。所述的有效量是足以产生发酵反应，足以产生有奶酪风味的发酵产物的用量。本领域技术人员可以根据发酵底物的多少以及菌株的特性来确定该有效量。在本发明的一个优选实施方式中，当孢子菌悬液的浓度为IO8-IO9或菌丝体的干重在15-25g/L时，孢子菌悬液或菌丝体液与液态型发酵底物的体积比为5-20% ；在本发明的另一优选实施方式中，当孢子菌悬液的浓度为IO8-IO9 或菌丝体的干重在15-25g/L时，每平方厘米固态型发酵底物的表面上涂抹0. 05-lml孢子菌悬液或菌丝体液。优选的，在固体发酵时，在固体发酵底物的表面制作多个凹孔，最好，凹孔外缘与相邻位置光滑连接。培养(发酵)的温度以及持续的时间基于游离脂肪酸(FFA)与奶酪风味的相关性而定。游离脂肪酸FFA含量与风味强度是密切相关的。本领域技术人员可以根据所需要的风味强度来确定培养持续的时间。较佳地，液体发酵温度为25-35°C，发酵时间为24_48h。较佳地，固体发酵温度为15_25°C，发酵时间为10-15天。除非另外说明，培养(发酵)的其它条件没有特别的限制，可以采用本领域技术人员培养霉菌(较佳的，木霉属、正青霉属或青霉属)微生物的常规的条件。本发明还包括采用上述方法获得的发酵产物，所述的发酵产物具有风味，所述的风味是奶酪风味。所述的发酵产物可用于制备具有风味的食品，所述的风味是奶酪风味。较佳地，收集所述液态形式的发酵产物或其浓缩液，作为风味物质产品；或者，对所述液态形式发酵产物进行除菌处理，收集处理后所得到的具有奶酪风味的液体，作为风味物质产品；或者，提取所述液态形式发酵产物中的挥发性物质作为风味物质产品；或者，对所述液态形式发酵产物进行干燥处理，收集处理后所得到的具有奶酪风味的固体，作为风味物质产品。所述的除菌处理可以采用本领域人员熟知的技术。例如，对发酵产物进行离心或过滤，去除其中的菌体，取清液作为风味物质。提取发酵产物中的风味挥发性物质也可以采用本领域技术人员所熟知的方式，例如蒸馏提取、吸附提取、萃取等。较佳地，萃取采用超临界萃取。蒸馏、吸附提取或萃取采用的溶剂采用本领域技术人员所熟知的能够提取挥发性风味物质的溶剂。所述的干燥处理可以采用本领域人员熟知的技术。较佳地，采用冻干或喷雾干燥。较佳地，可以收集所述的固态形式发酵底物，作为风味物质产品；或者，提取所述固态形式发酵产物中的挥发性物质作为风味物质产品；或者，对所述固态形式发酵底物进行干燥处理，收集处理后所得到的具有奶酪风味的固体，作为风味物质产品。提取发酵产物中的风味挥发性物质也可以采用本领域技术人员所熟知的方式，例如蒸馏提取、吸附提取、萃取等。较佳地，萃取采用超临界萃取。蒸馏、吸附提取或萃取采用的溶剂采用本领域技术人员所熟知的能够提取挥发性风味物质的溶剂。所述的干燥处理可以采用本领域人员熟知的技术。较佳地，采用冻干或喷雾干燥。在本发明的一个优选例中，所述的发酵产物中至少包含2-庚酮、2-戊酮和2-壬酮。即可以采用本发明的菌株生产具有甲基酮风味(一种非常典型的奶酪风味)物质。奶酪风味物质在食品领域的应用在一个优选例中，所述的奶酪风味物质应用于食品油脂的生产。优选的，制作家庭或食品工业用的调和油、人造奶油、无水酥油、酥皮油、液态酥油、黄油、餐桌奶油等，这些产品形式可为液态、块状、粉状、片状、颗粒状等。在另一优选例中，所述的奶酪风味物质被应用于烘焙食品用油脂，例如面包、蛋糕、饼干、奶糖、爆米花、植脂末、糖果、膨化食品等食品的烘焙用油脂。优选的，所述的奶酪风味物质应用于生产藏酥油、酥油茶、牦牛奶粉、藏粑、奶酒、 酸奶、奶酪。在另一优选例中，所述的奶酪风味物质可以作为香精香料添加到食品中。本发明的另一方面还提供一种制备具有风味的食品的方法，所述方法包括将合适量的奶酪风味物质加入食品基料中之前、同时或之后，对所述奶酪风味物质进行灭菌。所述的“合适量”是指当加入到食品基料中制成食品后，足以形成奶酪风味。例如，所述的培养产物在与食品基料混合后，占混合物总量的1-60% (w/w)；更佳地2-50% ；更佳地5-30%。 所述的食品基料也即制备食品的原料，其可以是但不限于牛奶、植物油等。所述的食品基料可以是固态、液态或乳状。在本发明的另一方面，提供真菌发酵产生的奶酪风味物质在制造油脂食品方面的应用。真菌包括霉菌和酵母，现有技术中已经披露了多种能够发酵产生奶酪风味物质的霉菌和酵母，例如生产白霉奶酪(White Mould Cheese)风味物质的常用霉菌，诸如白青霉 Penicillium candidum、白地霉 Geotrichum candidum、沙门柏干酪青霉 Penicillium camemberti)；生产蓝纹奶酪风味物质的中常用霉菌，诸如娄地青霉Penicillium roqueforti、灰绿青霄Penicillium glaucum ；例如生产Danisco cheese风味物质常用酵
11母,诸如汉逊德巴利酵母Debaryomyceshansenii、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis, 产朊假丝酵母Candida utilis等。现有技术中，为防止各食品原料之间的风味、香味串味或相冲，通常将霉菌和酵母产生的奶酪风味物质仅添加到奶酪或类似具有奶酪风味的原料物质中进行生产。发明人发现还可以将现有的奶酪风味物质以及本发明的奶酪风味物质应用于油脂食品中(作为风味剂添加到油脂食品中进行生产)。在一个优选例中，所述的油脂食品包括人造奶油、酥油、酥皮油。优选的，制作家庭或食品工业用的人造奶油、无水酥油、酥皮油、液态酥油、餐桌奶油等，这些产品形式可为块状、粉状、片状、颗粒状等。在另一优选例中，所述的奶酪风味物质被应用于烘焙食品用油脂及利用这些油脂加工而成的食品，比如面包、蛋糕、饼干、糖果，爆米花、膨化食品等。优选的，所述的奶酪风味物质应用于生产高原特色食品如牦牛奶粉、液体或固体饮料、藏酥油、奶渣、藏粑、酥油茶、奶酒、酸奶等。在本发明的另一方面，提供风味油脂食品的制造方法，该方法包括将真菌发酵产生的奶酪风味物质与制造油脂食品的基料混合并灭菌的步骤。在一个优选例中，所述的制造方法是先将真菌发酵产生的奶酪风味物质进行均质后再与制造油脂食品的基料混合。本发明的发明点主要在于(1)首次发现可以从天然酥油中筛选新的能够产生奶酪风味物质的微生物，与现有的仅从奶酪中筛选的思路不同。(2)从天然酥油中筛选出了三个新菌株，其作用于底物后能够生产奶酪风味特征的物质，该物质可以应用于食品工业领域。(3)发明人发现可以将真菌发酵产生的奶酪风味物质应用于油脂食品中，与现有的仅应用于奶酪中的思路不同。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、爪哇正青霉(Eupenicillium javanicium) CFR0802 (CGMCCNo. 3551)液体发酵生产奶酪风味物质第一步骤通过脂肪酶水解椰子油获得其酶解产物；(1)将200g精制椰子油放置于500ml的三角瓶中，置于震荡水浴锅中(40°C )震荡恒温水浴30分钟；(2)按照0. lg/100ml的添加量，添加脂肪酶(PALATASE 20000L)进行水解；水解过程中每2小时取样测定酸价(AV值)及游离脂肪酸含量(FFA)；(3)当AV值无明显变化时结束水解；再将水解产物升温至85°C，保温15分钟后进行灭活；灭活后的水解产物可置于4°C冰箱中贮藏备用。
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第二步骤将微生物接种于发酵底物，经液体发酵生产奶酪风味物质；从培养3-5 天的爪哇正青霉(Eupenicillium javanicium) CFR0802 新鲜 PDA 斜面上轻轻刮取孢子一环，接种于茄子瓶斜面，28°C静止培养3-5天后，吸取适量无菌水滴加于茄子瓶斜面，用接种环轻轻刮取斜面孢子，倒入无菌接种瓶中，配制孢子浓度为IO8-IO9个/ mL的悬浮液，按接种量为15%体积比(孢子悬浮液/发酵底物)接种于装载有3. 5L发酵底物(或称发酵培养基，其组成为175g上述第一步骤所得的椰子油酶解物，3325g新鲜牦牛奶)的 5L 发酵罐(购自 newbrunswick scientific，型号BI0FL0 110FERMENT0R)进行发酵生产；发酵生产的工艺条件如下培养温度28°C，搅拌转数200rpm/min，通风1 Iv/ ν,ρΗ自动，溶氧(D0% )自动，培养40-48小时；对发酵产物进行风味感官评价测试，风味感官评价结果获得的发酵产物具有典型的奶酪风味，风味品质好，异味强度低。具体的说，该风味主要是酮类物质(典型的奶酪风味挥发性物质)产生的，闻起来总体风味比较强烈，庚酮味比较明显，奶酪味(cheesy)浓郁，基本闻不到奶味(milky)、腐乳味，有略微脂肪酸味(fatty savory)，无其他异味。采用固相微萃取的方法对发酵产物中的风味挥发性物质进行提取，并对提取得到的样品进行GC-MS(气相色谱一质谱)检测；气相色谱一质谱联用仪购自安捷伦，型号为 6890-5973。实施例2、3中GC-MS检测皆采用该仪器。所获得的发酵产物中的风味挥发性物质的GC-MS测试结果图谱参见图1，从图1 中可以看出主要的挥发性物质为奶酪的典型风味挥发性物质甲基酮(2-庚酮、2-壬酮、 2_十一酮、2-戊酮)。实施例2、瑞士木霉(Trichoderma reesei) CFR0803 (CGMCC No. 3553)液体发酵生产奶酪风味物质从培养3-5天的瑞士木霉(Trichoderma reesei) CFR0803的PDA斜面上轻轻刮取孢子一环，接种于装有50mL的新鲜牦牛奶的250mL三角瓶中，往复震荡(28°C，120rpm/min) 培养40小时，获得一级种子液(即一级菌丝体液)。吸取2. 5mL 一级种子液，接种于装有IOOmL新鲜牦牛奶的500mL三角瓶中，往复震荡(28°C，120rpm/min)培养24-26小时，获得二级种子液(即二级菌丝体液)，菌丝体干重约为 15-25g/L。将获得的二级种子液，按接种量为10%体积比(二级种子液/发酵底物)接种于装载有35L发酵底物(其组成为新鲜牦牛奶)的50L发酵罐，发酵生产的工艺条件如下 培养温度28°C，搅拌转数200rpm/min，通风1 lv/v，罐压0. 02MPa，pH自动，D0%自动，培养23-30小时。对发酵生产获得的发酵产物进行风味感官评价测试，风味感官评价结果获得的发酵产物具有典型的奶酪风味，在风味品质好，异味强度低。具体的说，该风味主要是酮类物质(典型的奶酪风味挥发性物质)产生的，闻起来总体风味协调，均衡，奶酪味(cheesy) 清新，柔和，并且基本闻不到奶味(milky)、脂肪酸味(fatty savory)、腐乳味、酸败味，也无其他异味。采用固相微萃取的方法对发酵产物中的风味挥发性物质进行提取，并对提取得到的样品进行GC-MS (气相色谱一质谱)检测；所获得的发酵产物中的风味挥发性物质的GC-MS测试结果图谱参见图2，从图2
13中可以看出主要的挥发性物质为奶酪的典型风味挥发性物质甲基酮(2-庚酮、2-壬酮、 2_十一酮、2-戊酮)。实施例3、光孢青霉(Penicilliumglabrum)CFR0801 (CGMCC No. 3552)液体发酵生产奶酪风味物质取市售的新西兰安佳奶油500g，在无菌室内用无菌刀将奶油切成高为1cm，长宽均为5cm左右的片状物4个，放无菌盘中，用工具在片状物的上表面扎数个小孔(每个小孔直径约0. 5-lmm)；用接种环轻轻刮取培养3-5天的光孢青霉(Penicillium glabrum)CFR0801的PDA 斜面上成熟孢子，倒入无菌撒盐瓶，振动均勻，然后均勻洒落在安佳奶油表面。放置于25°C生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司，SHP-250)培养1_2天，酥油片状物的上表面布满白色菌丝体；培养10-15天，酥油片状物的上表面及内部都布满白色菌丝体，菌丝体中嵌有蓝绿色孢子。对发酵生产获得的发酵产物进行风味感官评价测试，风味感官评价结果获得的发酵产物具有典型的奶酪风味，在风味品质方面得分高，异味强度方面得分低。具体的说， 该风味主要是酮类物质(典型的奶酪风味挥发性物质)产生的，闻起来总体风味强烈，奶酪味(cheesy)浓郁，有略微酸味(acid taste)和奶味(milky)，无脂肪酸味(fatty savory)、 腐乳味、酸败味，及其他异味。采用固相微萃取的方法对发酵产物中的风味挥发性物质进行提取，并对提取得到的样品进行GC-MS(气相色谱一质谱)检测。所获得的发酵产物中的风味挥发性物质的GC-MS测试结果图谱参见图3，从图3 中可以看出主要的挥发性物质为奶酪的典型风味挥发性物质甲基酮(2-庚酮、2-壬酮、 2_十一酮、2-戊酮)。实施例4、奶酪风味物质的应用1、制作奶酪风味的酥油及酥油茶①、先将实施例1中所得的发酵产物0. 5kg进行均质，与Ikg牦牛奶一同加入到水相罐中，同时加入2g柠檬酸，9g山梨酸钾，加热至80°C，维持15分钟，边搅拌边灭菌。②、将8. 5kg新西兰无水乳脂加入到油相罐中，边加热边搅拌，同时加入68g单甘酯，IOg卵磷脂，0. 004g β -胡萝卜素，加热60°C，搅拌维持15分钟。③、将水相罐中料液通过袋式过滤器过滤，加入到油相罐，乳化15分钟，形成乳化液。④、乳化液再次经过袋式过滤器过滤后，经过板式换热器灭菌。⑤、急冷捏合乳状液由柱塞泵或齿轮泵在一定压强下泵入急冷机(A单元)，在结晶筒内迅速结晶，再进入捏合机(B单元)，B单元对物料剧烈搅拌捏合，并慢慢形成IOkg奶酪风味酥油。⑥、放置15 °C，熟化。也可以按上述的方法或基于上述方法的变形方式来制作诸如人造奶油的油脂产品。虽然人造奶油等油脂产品的基本制作方法是本领域技术人员所熟知的，然而真菌产生的奶酪风味物质无法直接用于生产油脂产品时，工艺上存在一定的问题(发酵产生的风味物质一般含有真菌菌丝球和菌丝体，在常规的制造人造奶油等油脂产品的工艺中，为确保杂质不进入加工系统，往往在进入加工系统前配置IO-IOOum的过滤袋，因此按常规的人造奶油成型工艺，发酵风味料中的菌丝体会被过滤袋截留，导致成品风味浓度大大降低)。本发明巧妙地采用了在进入加工系统前进行均质的方法，可以有效粉碎发酵风味中的菌丝体，从而确保风味料能顺利通过人造奶油等油脂产品的成型生产线，保证最终产品的风味达到设计要求。在本实施例中，将获得的奶酪风味物质加入到食品基料中之前对其进行均质操作。本实施例中，利用本发明的新菌株发酵生产获得的奶酪风味物质来制作具有风味的酥油；另外，也可以使用现有奶酪风味物质(如blue cheese风味物质)来制作具有风味的人造奶油等油脂产品(需要在将奶酪风味物质加入到食品基料中之前对其进行均质操作)。⑦、酥油茶制备在不锈钢锅中加入IOOOg水，在电磁炉上加热至沸，加入砖茶3g，食盐2. 5g，搅拌煮沸10分钟，用纱布过滤得茶水，取茶水500g，倒入高速均质机中，加入上述熟化的奶酪风味酥油20g，高速搅拌1. 5分钟即成酥油茶。2、用作烘培食品用油脂(制作饼干)将前述制备的奶酪风味酥油150g与鸡蛋45g充分搅拌均勻，再加入150g面粉和 120g糖粉，将上述混合物揉成团，刻模，放烘箱烘烤，获得风味饼干。3、制作奶酪取4L鲜牛奶，经63°C灭菌30分钟，冷却后按体积比10%添加实施例2所得的发酵产物(经灭菌，无需均质)，凝乳酶用10倍无菌水稀释添加到牛奶中，搅拌3-5分钟，凝乳时间约为45-60分钟，当凝乳粒达到适宜大小后开始搅拌，整个搅拌时间控制在20分钟以内，排掉乳清，4-8°C成熟保藏10-30天，获得具有典型奶酪风味的奶酪。4、用作食品香精香料取实施例3的发酵产物30kg (经灭菌，无需均质)进行喷雾干燥，控制水分蒸发量 5kg/h，进风温度150°C，出风温度80-100°C，获得2. 4kg粉末奶酪香料，其可以添加到各类食品中以获得奶酪风味特征。菌种保藏本发明的生产奶酪风味物质的爪哇正青霉(Eupenicillium javanicium)CFR0802 已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京)，保藏登记号为CGMCC No. 3551。本发明的生产奶酪风味物质的光孢青霉(Penicillium glabrum)CFR0801已于 2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京)，保藏登记号为CGMCC No. 3552。本发明的生产奶酪风味物质的瑞士木霉(Trichoderma reesei)CFR0803已于 2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京)，保藏登记号为CGMCC No. 3553。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种用于生产奶酪风味物质的菌株的筛选方法，其特征在于，该筛选方法包括从牦牛奶及其加工制品中定向筛选出霉菌的步骤，所述的霉菌能够以含有乳、油、脂类的物质和 /或其酶解产物为底物来发酵生产甲基酮类物质。
2.爪卩圭IE 青 β (EupeniciIlium javanicum) > jfe W β (Penicillium glabrum) > 瑞士木霉(Trichoderma reesei)、覃青霉(Penicillium paxilli)、鲜红青霉 (Penicilliumchermesinum)、曲霉(Aspergillus sp)、枝抱霉(Cladosporium sp)中任一菌株或其变体在生产奶酪风味物质方面的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的菌株或其变体筛选自含有乳、油、月旨类的物质。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的含有乳、油、脂类的物质为天然酥油。
5.经分离的菌株，其是爪哇正青霉CFR0802，其保藏号为CGMCC NO. 3551 ；或其变体； 光孢青霉CFR0801，其保藏号为CGMCC NO. 3552 ；或其变体； 瑞士木霉CFR0803，其保藏号为CGMCC NO. 3553 ；或其变体。
6.权利要求5中所述任一菌株的用途，用于发酵生产奶酪风味物质。
7.—种生产奶酪风味物质的方法，其特征在于，该方法包含采用权利要求2或5中所述任一菌株或任意几种的组合的孢子或菌丝体，以含有乳、 油、脂类的物质和/或其酶解产物为发酵底物，经液体发酵或固体发酵，获得具有奶酪风味的发酵产物。
8 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的液体发酵包括先制备权利要求2或5中所述任一菌株或任意几种的组合的孢子悬浮液或菌丝体液， 再将有效量的孢子悬浮液或菌丝体液接种到液态形式的发酵底物中，获得液态形式的发酵产物，发酵温度为25-35°C，发酵时间为24-48h。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括收集所述液态形式的发酵产物或其浓缩液，作为风味物质产品；或者， 对所述液态形式发酵产物进行除菌处理，收集处理后所得到的具有奶酪风味的液体， 作为风味物质产品；或者，提取所述液态形式发酵产物中的挥发性物质作为风味物质产品；或者， 对所述液态形式发酵产物进行干燥处理，收集处理后所得到的具有奶酪风味的固体， 作为风味物质产品。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的固体发酵包括先制备权利要求2或5中所述的任一菌株或其组合的孢子悬浮液或菌丝体液，再将有效量的孢子悬浮液或菌丝体液接种于固态形式发酵底物表面获得固态形式发酵产物的过程，发酵温度为15-25°C，发酵时间为10-15天。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，还包括收集所述的固态形式发酵底物，作为风味物质产品；或者， 提取所述固态形式发酵产物中的挥发性物质作为风味物质产品；或者， 对所述固态形式发酵底物进行干燥处理，收集处理后所得到的具有奶酪风味的固体， 作为风味物质产品。
12.如权利要求7-11任一所述方法，其特征在于所述的发酵产物中至少包含2-庚酮、2-戊酮和2-壬酮。
13.如权利要求7-11任一所述方法，其特征在于所述的含有乳、油、脂类的物质选自 乳制品、动植物油脂或微生物油脂。
14.采用如权利要求7-11任一所述方法获得的奶酪风味物质。
15.权利要求14所述奶酪风味物质在食品领域的应用。
16.一种食品制作方法，其特征在于，该方法包括将合适量的权利要求7-15任一所述方法获得的奶酪风味物质加入食品基料中之前、同时或之后，对所述奶酪风味物质进行灭菌。
17.真菌发酵产生的奶酪风味物质在油脂食品中的应用。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于所述的油脂食品为人造奶油、酥油、酥皮油。
19.风味油脂食品的制造方法，其特征在于该方法包括将真菌发酵产生的奶酪风味物质与油脂食品的基料混合并灭菌的步骤。
20.如权利要求19所述的制造方法，其特征在于先将真菌发酵产生的奶酪风味物质进行均质后再与油脂食品的基料混合。
全文摘要
本发明涉及奶酪风味物质的生产及其在食品中的应用。本发明人筛选到可产生奶酪风味的新型微生物，该微生物以含有乳、油、脂类的物质为底物发酵生产获得具有奶酪风味的物质；该奶酪风味物质可广泛地应用于食品领域。
文档编号C12N1/14GK102220243SQ201010145698
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者关惠琴, 吴学智, 常桂芳, 胡鹏 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司