专利名称：：用于检测大豆疫霉的引物、试剂盒及方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于检测大豆疫霉的引物、试剂盒及方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：由大豆疫霉菌PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann侵染大豆弓|起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，也是我国对外公布的一类检疫对象(许志刚，2003)。大豆疫霉菌可以在大豆生长的各个时期侵染大豆，在潮湿多雨的季节病害发生尤其严重，由于大豆疫霉以同宗配合的方式进行有性生殖，在发病植株上可以产生大量的卵孢子，植物收获后残留在土壤中的卵孢子就成为大豆疫霉的初侵染源，据报道大豆疫霉的卵孢子可以在土壤中存活5年以上(许修宏等，2003)。因此大豆疫霉根腐病一旦发生将很难消除(朱振东等，1999)。传统的检测大豆疫霉的方法是进行大豆叶碟诱捕和平板培养或者将二者相结合(CanadayandSchmitthenner,1982；Oudemans,1999；朱振东等，2003；王子迎等，2005)。传统方法在大豆疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验(Tsao，1990;Dobrowolskiand0，Brien，1993)，所以很难在生产中推广运用。PCR技术具有快速和灵敏的优点，在病原物的鉴定和检测中的地位越来越重要。近年来，一些疫霉菌的PCR检测方法被开发出来。这些方法中设计的引物的来源主要都是转录间隔区(ITS)(Cookeetal.，1995a，b；Bonantsetal.，1997；Tooleyetal.，1997；Troutetal.,1997；Liewetal.,1998；Tooleyetal.,1998；Schubertetal.,1999；Bonantsetal.,2000；JudelsonandTooley,2000；ffinton&Hansen,2001；Groteetal.,2002；Ippolitoetal.,2002)或者elicitin基因(Coelhoetal.,1997；LacourtandDuncan,1997；Kongetal.,2003b)0这些区域或者基因在基因组中都是高拷贝的，所以很容易被检测到。但是越来越多的研究发现，部分疫霉种的ITS序列差异很小，以此为靶标设计的引物难以将这些疫霉菌与其近缘种区分开来。Wang等(2006)根据ITS序列设计大豆疫霉特异性引物时发现，大豆疫霉与P.melonis的ITS序列的相似性高达97%，大豆疫霉的特异性引物3’末端仅仅与P.melonis的相应序列相差1个碱基，需要将退火温度提高到660C以上才能将这两种疫霉区分开来，但是过高的退火温度会降低PCR反应的灵敏度。而且提高退火温度并不能彻底解决此问题，当P.melonis的浓度较高时仍然会造成假阳性的现象。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测大豆疫霉的引物、包含该引物的检测试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测大豆疫霉准确性高、特异性强、灵敏性尚ο本发明提供的技术方案是一种用于检测大豆疫霉的引物，即TrapFl/TrapRl，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述。一种检测大豆疫霉的试剂盒，包含上述的引物。所述的试剂盒，还包含4种dNTP，10XPCR反应缓冲液，2mMMg2+，1%BSA和Taq酶。本发明还提供了一种检测大豆疫霉的方法提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果，如果存在分子量约为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。为提高检测的灵敏度，本发明还提供了另一种用于检测大豆疫霉的引物，其包括两对引物，第一对引物即TrapFl/TrapRl，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述，第二对引物，即TrapF2/TrapR2，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所述。本发明还提供了另一种检测大豆疫霉的试剂盒，其包含上述的第一对引物和第二对引物。上述的试剂盒，还包含4种dNTP，10XPCR反应缓冲液，2mMMg2+，1%BSA,吐温-20和Taq酶。本发明还提供另一种检测大豆疫霉的方法，其具体过程是提取待测样品的DNA，进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第一对引物(TrapFl/TrapRl)，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第二对引物(TrapF2/TrapR2)，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，电压为50_100V，30分钟后在紫外光下检测结果，如果存在分子量约为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。同时，本发明还提供了一种利用所述引物建立的PCR反应体系。PCR反应的混合液总体积为25μ1，包括相应浓度的模板DNA，0.5μM引物，4种dNTP各50μM，2.5μ110XPCR反应缓冲液，2mMMg2+，2.5μ11%BSA,1.25单位Taq酶(TaKaRa)，在PTC200(MJ公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为94°C预变性5min；然后进入循环，94°C变性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸30sec，共35个循环；最后72°C延伸7min。反应结束后取7μ1扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。为了提高检测灵敏度，本发明进一步建立了套式PCR反应体系。以TrapFl/TrapRl作为第一轮反应引物与引物TrapF2/TrapR2分别组合进行套式PCR。第一轮PCR反应的混合液总体积为25μ1，包括:0.5μΜ引物，4种dNTP各50μΜ，2.5μ110XPCR反应缓冲液，2mMMg2+，2.5μ11%BSA,0.5μ1吐温-20，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，模板DNA若干，在PTC200(MJ公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为94°C预变性5min；然后进入循环，94°C变性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸30sec，共35个循环；最后72°C延伸7min。取1μ1第一轮PCR反应产物作为模板进行第二轮反应，反应体系和反应程序同1.5.2中所述。反应结束后取7μ1扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。本发明具有如下优点在进行大豆疫霉基因组的研究过程中，本发明人发现了一段大豆疫霉的类转座子序列，在对这一序列进行生物信息学的分析过程中发现该序列高度重复且只存在于大豆疫霉中，因此非常适合做为大豆疫霉分子检测的靶标。特异性试验结果证实该引物具备种的特异性。本发明人根据大豆疫霉的类转座子序列设计了大豆疫霉的特异引物TrapFl/TrapRl，利用该对引物对26种疫霉、29种其它真菌共232个菌株进行特异性验证。试验结果证明，该引物只能从大豆疫霉菌株中扩增得到一条267bp的条带。其它菌株，特别是ITS序列与大豆疫霉十分近似的疫霉菌P.melonis以及亦可侵染大豆造成根腐症状的Fusariumsolanif.sp.glycines,Rhizoctoniasolani,Pythiumaphanidermatum禾口Colletotrichumglycines等无扩增条带出现。本发明人利用该引物对来自不同地区和国家的大豆疫霉100余株大豆疫霉菌株进行了PCR扩增，结果从这些来源不同的大豆疫霉菌株中都能扩增出一条267bp的条带，表明该类转座子序列适合作为大豆疫霉分子检测的靶标，基于该序列设计的特异引物可对大豆疫霉引起的根腐病进行准确地诊断和检测。引物灵敏度的验证结果证实，仅仅经过单轮PCR，该引物即可检测出IOpg的的大豆疫霉基因组DNA。为了提高检测的灵敏度，本发明人又在TrapFl/TrapRl扩增的片段内设计另一对引物TrapF2/TrapR2，用作套式PCR的第二轮扩增引物。引物TrapFl/TrapRl和TrapF2/TrapR2组合进行的套式PCR反应可以使检测灵敏度提高1000倍，能够检测到IOfg的大豆疫霉基因组DNA。在游动孢子和卵孢子的检测过程中，仅仅通过单轮PCR，就可以分别检测到1个卵孢子和1个游动孢子。。大豆疫病是大豆生产上的一种毁灭性病害，同时也是我国口岸检疫中的重要检疫对象，在目前尚无有效防治药物的前提下，控制其传播是减少危害的主要措施之一。本发明人发现了一个新的大豆疫霉分子检测靶标，并根据此序列为靶标设计了大豆疫霉检测特异引物，建立大豆疫霉普通PCR分子检测体系。该体系可对大豆疫霉的各种形态的繁殖体例如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，整套技术快速、灵敏、准确。因此，无论在防止外来大豆疫霉入侵，还是对国内疫区病原菌监测及国际贸易交往等方面均具重要意义。图1为大豆疫霉类转座子序列。图2为引物TrapFl/TrapRl的PCR扩增电泳图，其中，M为2000bpDNAmarker；1为标准大豆疫霉菌株6497；2-18为其他疫霉种菌株；19阴性对照。图3为引物TrapFl/TrapRl的PCR扩增电泳图其中，M为2000bpDNAmarker；1为标准大豆疫霉菌株6497；2-18为其他真菌菌株；19为阴性对照。图4为引物TrapFl/TrapRl的PCR扩增电泳图，其中，M为2000bpDNAmarker；1为标准大豆疫霉菌株6497；2-22为来自不同国家和地区的大豆疫霉菌株；23为阴性对照。图5为引物TrapFl/TrapRl扩增大豆疫霉不同浓度基因组DNA的灵敏度的检测结果，其中，M为2000bpDNAmarker；1-9为25μ1的反应体系中分别含有lng、lOOpg、10pg、lpg、100fg、10fg、lfg、100ag、10agDNA的扩增结果；10为阴性对照。图6为引物TrapFl/TrapRl和引物TrapF2/TrapR2组合套式PCR扩增大豆疫霉不同浓度基因组DNA的灵敏度的检测结果，其中，M为2000bpDNAmarker；1-8为25μ1的反应体系中分别含有lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、lfg、100agDNA的扩增结果；9为阴性对照。图7为引物TrapFl/TrapRl扩增大豆疫霉不同浓度卵孢子的灵敏度检测结果，其中，M为2000bpDNAmarker；1为阳性对照；211为25μ1的反应体系中分别含有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个卵孢子DNA的扩增结果；12为阴性对照。图8为引物TrapFl/TrapRl扩增大豆疫霉不同浓度游动孢子的灵敏度，其中，M为2000bpDNAmarker；1为阳性对照；2-11为25μ1的反应体系中分别含有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个游动孢子DNA的扩增结果；12为阴性对照。图9为接种大豆植株中大豆疫霉的PCR检测结果，其中，M为2000bpDNAmarker；1为阴性对照；2-11为接种大豆中大豆疫霉的扩增结果；12为提取健康大豆组织DNA的扩增结果；13为阳性对照。图10为大豆病田土壤中病原物的套式PCR检测结果，其中，M为2000bpDNAmarker；1-5为感病大豆田块中土样；6为阳性对照；7为健康田块土样；8为阴性对照。具体实施例方式下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。实施例1设计、合成引物并建立大豆疫霉检测试剂盒的PCR反应体系一、引物设计与合成根据大豆疫霉类转座子序列(见图1)设计一对用于大豆疫霉分子检测的特异引物TrapFl/TrapRl(具体见核苷酸序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)，为了提高检测的灵敏度，本发明基于该序列设计另一对引物TrapF2/TrapR2(具体见核苷酸序列表SEQIDN0.3和SEQIDNO.4)，作为套式PCR的第二轮扩增引物。所有引物均委托上海生工公司合成。二、建立常规PCR反应体系PCR反应的混合液总体积为25μ1，包括相应浓度的模板DNA，0.5μMTrapF1/TrapRl引物，4种dNTP各50μΜ，2.5μ110XPCR反应缓冲液，2mMMg2+,2.5μ11%BSA,1.25单位Taq酶(TaKaRa)，在PTC200(MJ公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为94°C预变性5min；然后进入循环，94°C变性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸30sec，共35个循环；最后72°C延伸7min。反应结束后取7μ1扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。三、建立套式PCR反应体系为了提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以TrapFl/TrapRl作为第一轮反应引物与引物TrapF2/TrapR2分别组合进行套式PCR。第一轮PCR反应的混合液总体积为25μ1，包括0.5μΜ引物，4种dNTP各50μΜ，2.5μ110XPCR反应缓冲液，2mMMg2+，2.5μ11%BSA,0.5μ1吐温-20，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，模板DNA若干，在PTC200(MJ公司)PCR仪上进行扩增反应。反应程序为94°C预变性5min；然后进入循环，94°C变性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸30sec，共35个循环；最后72°C延伸7min。取1μ1第一轮PCR反应产物作为模板进行第二轮反应，反应体系和反应程序同所述的常规反应体系及程序。反应结束后取7μ1扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照，如果存在分子量约为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。实施例2制备DNA模板提取各类样品的DNA作为PCR反应的模板，具体过程如下一、菌丝粉DNA的抽提参考Sambrook等(1989)方法稍加改进。取少量菌丝粉，加900μ12%CTAB提取液和90μ110%SDS，漩涡混勻，于55°C水浴lh，中间每IOmin上下颠倒几次。12000rpm离心lOmin，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25241)，颠倒混勻，12000rpm离心IOmin；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混勻，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3MNaAc(pH5.2)，-20°C沉淀(>Ih)。12000rpm离心lOmin，倾去上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH8.0)溶解沉淀(含20μg/mlRNase)，37°C处理Ih后，_20°C保存备用。二、卵孢子悬浮液的制备和DNA的提取参见郑小波(1997)略有改动。将含有卵孢子的培养基转移到灭菌容器中，加水IOOml左右(视容器大小而定)，5000转/分勻浆2分钟，以破碎培养基并使卵孢子与菌丝和琼脂脱离。勻浆液依次经200、300、600目筛网过滤，用水反复冲洗各目筛网，最后用少量灭菌水洗下600目筛网上收集到的卵孢子，制备成卵孢子悬浮液。在显微镜下对悬浮液中卵孢子的数目进行计数，将卵孢子的浓度调整为100个/μ1，用FastDNA试剂盒(Q-BiogeneLtd,USA)提取DNA，提取步骤参见试剂盒说明书。三、游动孢子悬浮液的制备和DNA的提取参考郑小波(1997)方法诱导大豆疫霉释放游动孢子，滤去菌丝块，得到游动孢子悬浮液。在显微镜下对悬浮液中卵孢子的数目进行计数，将游动孢子的浓度调整为1000/μ1。将游动孢子悬浮液加入到1.5ml的印pendorf(EP)管中，12000g离心lOmin，弃上清液，取沉淀物，按方法1.4.1提取DNA。将提取的DNA用灭菌超纯水溶解，_20°C保存备用。四、活体组织中病原菌DNA的提取参考Wang等(1993)NaOH法并稍加改进。取一段发病的植株组织，每毫克组织加Λ10μ10.5ΜNaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的EP管中，12000rpm离心5min，取5μ1上清液加入495μ10.ImMTris(pH8.0)，混勻后取1μ1直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无PCR抑制物存在，用本方法提取健株组织DNA后经通用引物ITS1/ITS4扩增ITS片段作为空白对照。五、土壤中病原菌DNA的提取所有的土壤样品采用FastDNASPIN试剂盒(Q-BiogeneLtd,USA)进行DNA的提取。土壤DNA提取步骤参见试剂盒说明书。用作对照的土样采自没有发病的健康田块。下面用上述实施例1检测引物、试剂盒及方法和实施例2制备的模板进行大豆疫霉的检测。实施例3检测引物的特异性分别用真核生物通用引物ITS1/ITS4和特异引物TrapFl/TrapRl对26个疫霉种、29个其它种的菌株共计232株进行了PCR扩增，试验所用大豆疫霉菌株寄主、来源及数量见表1，试验中所有菌株均为单孢菌株，保存于南京农业大学植物病理系。结果表明真核生物通用引物ITS1/ITS4能够从所有供试菌株中扩增出一条大约700bp的条带(见表1)。证明本研究所提的DNA可用于PCR扩增，排除了DNA质量对扩增结果造成的影响。特异性引物TrapFl/TrapRl只能从供试的120个P.sojae菌株中特异地扩增出一267bp的条带(请见表1，图2-4)。表明根据大豆疫霉转座子序列(见图1)设计的引物具有种的特异性，可以将P.sojae和其它疫霉种和真菌区分开。表1用于检测引物TrapFl/TrapRl特异性的真菌和卵菌菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上表中+表示具有引物ITS1/ITS4或TrapFl/TrapRl的特异性扩增条带；-表示无扩增产物。实施例4检测引物的灵敏度1、大豆疫霉基因组DNA的灵敏度检测将大豆疫霉菌株6497的基因组DNA从Ing/μ1开始10倍向下稀释至IOag/μ1，每浓度梯度取1μ1为模板用特异引物TrapFl/TrapRl进行PCR扩增。结果表明在25μ1的反应体系中含有IOpg的基因组DNA时该对引物仍然可以扩增得到267bp的特异性条带(请见图5)。先以引物TrapFl/TrapRl对上述不同浓度的基因组DNA进行PCR扩增的产物为模板，再以大豆疫霉特异引物TrapF2/TrapR2进行套式PCR扩增。结果表明，套式PCR产物量与单独进行特异性引物扩增的PCR产物量相比有明显提高，能够使原来条带亮度非常微弱或者不可见扩增条带的样品产生明显的条带(请见图_6)，表明以引物TrapFl/TrapRl和所设计的TrapF2/TrapR2引物组合进行的套式PCR反应可以使检测灵敏度提高1000倍，能够检测到IOfg的基因组DNA。2、大豆疫霉卵孢子DNA的灵敏度检测将浓度为100个卵孢子/μ1按10倍的梯度稀释到1个卵孢子/μ1，分别以1μ1各个浓度的DNA为模板进行引物TrapFl/TrapRl的PCR扩增。结果显示，在25μ1反应体系中含有1个卵孢子的DNA量时可检测到特异性的扩增条带(请见图7)。3、大豆疫霉游动孢子DNA的灵敏度检测将浓度为1000个游动孢子/μ1按10倍的梯度稀释到1个游动孢子/μ1，分别以1μ1各个浓度的DNA为模板进行单轮PCR扩增。结果显示，在25μ1反应体系中含有1个游动孢子的DNA量时可检测到特异性的扩增条带(请见图8)。实施例5感病大豆植株的PCR检测以NaOH裂解法提取接种大豆疫霉的大豆植株的DNA，将其作为模板用于PCR扩增。结果是接种大豆疫霉的大豆植株接种点附近组织均能扩增出267bp条带，而健康植株只能以真核生物ITS区通用引物ITS1/ITS4扩增出一700bp的条带，而用TrapFl/TrapRl扩增无条带出现(请见图9)。表明NaOH法及特异引物TrapFl/TrapRl可用于感病大豆植株的快速PCR检测。实施例6土壤中病原物的检测采用套式PCR检测采自不同地区田间的病土中的病原物，所有采自大豆病田的土样均扩增到了与阳性对照相同大小的条带，而作为阴性对照的土样则没有扩增出任何条带(请见图10)，说明采自这些病田的土样含有P.sojae。采用大豆叶片诱捕法的结果也证实了本发明人的PCR扩增结果。所有PCR扩增呈阳性的土样采用叶碟诱捕法均诱出了大豆疫霉，而作为阴性对照的土样则没有诱出，证明本发明设计的特异引物可以用来检测土壤中是否携带大豆疫霉。权利要求一种用于检测大豆疫霉的引物，其特征在于其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述。2.一种检测大豆疫霉的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包含4种dNTP，10XPCR反应缓冲液，2mMMg2+,1%BSA禾口Taq酶。4.一种利用权利要求1所述的引物检测大豆疫霉的方法，其特征在于提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。6.一种用于检测大豆疫霉的引物，其特征在于包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所述。7.—种检测大豆疫霉的试剂盒，其特征在于包含权利要求6所述的引物。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于还包含4种dNT，10XPCR反应缓冲液，2mMMg2+，1%BSA,吐温-20和Taq酶。9.一种利用权利要求6所述的引物检测大豆疫霉的方法，其特征在于提取待测样品的DNA进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第一对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第二对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。全文摘要本发明提供一种用于检测大豆疫霉的引物、试剂盒及方法，利用该引物及检测方法检测大豆疫霉准确性高、特异性强、灵敏性高，可对大豆疫霉的各种形态的繁殖体例如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，整套技术快速、灵敏、准确，对防止外来大豆疫霉入侵、国内疫区病原菌监测及国际贸易交往等方面均具重要意义。文档编号C12N15/11GK101805796SQ201010145429公开日2010年8月18日申请日期2010年4月13日优先权日2010年4月13日发明者孟军,王源超,董莎萌,郑小波申请人:南京农业大学