具有改变特性的α-淀粉酶突变体的制作方法

专利名称：具有改变特性的α-淀粉酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及亲本Termamyl样(Termamyl-like) a -淀粉酶的变体(突变体)，变体 具有a-淀粉酶的活性，并且相对于所述亲本a-淀粉酶其显示出下述性质中至少一种性 质的改变例如，高温和/或低PH条件，尤其是低钙浓度下的稳定性。本发明的变体适合于 淀粉转化，制备乙醇，洗衣冲洗剂，餐具冲洗剂，硬表面清洗剂，纺织品退浆，和/或制备增 舌甘剂(sweetner)。
背景技术：
a (-淀粉酶(a-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3. 2. 1. 1)构成这样一组酶，它 们催化淀粉和其他线性及分枝1，4_葡萄糖苷寡-糖和多糖的水解。发明简述本发明的目的是提供亲本Termamyl样a -淀粉酶的变体，与相应的亲本a -淀粉 酶即未成熟的淀粉酶相比，具有淀粉酶的活性，并且相对于所述亲本淀粉酶其 显示出下述性质中至少一种性质的改变稳定性，例如在高温和/或低PH条件，尤其是低钙 浓度下。本发明具体涉及如下方面1) 一种亲本Termamyl样a -淀粉酶的变体，所述变体包含一个或多个选自下述位 点的改变49,60,104，132，161，170，176，179，180，181，183，200，203，204，207，212，237， 239，250，280，298，318，374，385，393，402，406，427，430，440，444，447，482，其中(a)所述改变分别是(i)占据该位点的氨基酸下游的氨基酸插入，(ii)占据该位点的氨基酸的缺失，或(iii)以不同的氨基酸取代占据该位点的氨基酸，(b)变体具有a -淀粉酶活性，和(c)每个位点相应于具有SEQ ID NO 8所示的 氨基酸序列的亲本Termamyl样a -淀粉酶的氨基酸序列的位点。2)项1所述的变体，其中该变体具有一个或多个下述的突变T49I ；D60N ；N104D ；E132A, V, P；D161N；K170Q ；K176R ；G179N ；K180T ；A181N D183N ；D200N ；X203Y ；D204S ；D207V, E, L, G ；X212I ；K237P ；S239W ；E250G, F ；N280S ；X298Q L318M ；Q374R ；E385V ；Q393R ；Y402F ；H406L, W ；L427I D430N ；V440A ；N444R, K ；E447Q, K Q482K，使用 SEQ ID NO 8 的编号。
3)项1或2所述的变体，其中该变体具有下述的突变K170Q+D207V+N280S ；E132A+D207V ；D207E+E250G+H406L+L427I ；D207V+L318M ； D60N+D207V+L318M ；T49I+E132V+V440A ；T49I+K176R+D207V+Y402F ；Q374R+E385V+Q393R ； N190F+A209V+Q264S ；G48A+T49I+G107A+I201F ；T49I+G107A+I201F ；G48A+T49I+I201F ； G48A+T49I+G107A ；T49I+I201F ；T49I+G107A ；G48A+T49I ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D43 0N+N444K+E447Q+Q482K ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+N44 4K+E447Q+Q482K ；D161N+A181N+D 183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+N444K+E447Q+Q4 82K ；D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+E447Q+Q482K ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D43 0N+E447Q+Q482K ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+E44 7Q+Q482K ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D43 ON ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H 406W+D430N ；H406W+D430N ；N444K+E447Q+Q482K ；E447Q+Q482K ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D43 0N+N444R+N444K+E447K+Q482K ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+N44 4R+N444K+E447K+Q482K ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W ；H406W+D430N ；N444K+E447K+Q482K ；E447K+Q482K ；N104D+D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W ；N104D+D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P ；N104D+D161N+A181N+D183N+D200N+D204S ；D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W ；D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P ；D161N+A181N+D183N+D200N+D204S ；K237P+S239W，使用 SEQ ID NO 8 的编号。4)项1-3中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a -淀粉酶衍生于地衣芽孢 杆菌(SEQ ID NO :8)，解淀粉芽孢杆菌(SEQ ID NO 10)，嗜热脂肪芽孢杆菌(SEQ ID NO 6) 的菌株。5)项1-4中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a -淀粉酶是LE174 ； LE174+G48A+T49I+G107A+I201F ；LE174+M197L ；或 LE174+G48A+T49I+G107A+M197L+I201F。6)项1中所述的变体，其中该变体在下述一或多个位点发生突变T51I ；D62N ；
5N106D ；D134A, V, P ；D163N ；X172Q ；K179R ；G184N ；K185T ；A186N ；D188N ；D205N ；M208Y ； D209S ；X212V, E, L, G ；L217I, K242P, S244W, N255G, F, N285S, S303Q, X323M ；D387V, N395R ；Y404F ；H408L, W ；X429I ；D432N ；V442A ；X446R, K ；X449Q, K ；X484K，使用 SEQ ID NO 4(SP722)的编号。7)项1或6中所述的变体，该变体具有下述的突变E212V+N285S ；D134A+E212V ； N255G+H408L+X429I ；E212V+X323M ；D62N+E212V+X323M ；T51I+D 134V+V442A ； T51I+K179R+E212V+Y404F ;D387V+N395R ;N195F+X212V+K269S，使用 SEQ ID NO :4(SP722)
的编号。8)项1-7中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a -淀粉酶选自SP690(SEQ ID NO 2) ； SP722(SEQ ID NO 4 ； AA560 (SEQ ID NO 12) ；#707 a-淀粉酶(SEQ ID NO 13)； KSM-AP1378。9)项1-8中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a -淀 粉酶是下述任何一种SP722+D183*+G184* ；SP722+D183*+G184*+N195F ； SP722+D183*+G184*+M202L ；SP722+D183*+G184*+N195F+M202L ；BSG+1181*+G182* ； BSG+I181*+G182*+N193F ；BSG+1181*+G182*+M200L ；BSG+I181*+G182*+N193F+M200L ； AA560+D183*+G184* ；AA560+D183*+G184*+N195F ；AA560+D183*+G184*+M202L ； AA560+D183*+G184*+N195F+M202L。10)项1-9中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a -淀粉酶具有与SEQ ID NO 8有至少60%相同的氨基酸序列，优选70%，更优选至少80%，甚至更优选至少约 90 %，甚至更优选至少95 %，甚至更优选至少97 %，甚至更优选至少99 %。11)项1-10中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a -淀粉酶由核酸序列编 码，该核酸序列与SEQ ID NO :7的核酸序列可在低严谨度条件下，优选中度严谨度条件下， 更优选高严谨度条件下杂交。12)项1-11中任一项所述的变体，其中变体具有改变的稳定性，尤其在70-120°C 高温下和/或pH 4-6的低pH下。13) 一种DNA构建体，包含编码项1_12中任一项所述的a -淀粉酶变体的DNA序 列。14) 一种重组表达载体，其携带项13的DNA构建体。15) 一种由项13的DNA构建体或项14的载体转化的细胞。16)项15的细胞，其是微生物，优选是细菌或真菌。17)项16的细胞，该细胞是革兰氏阳性细菌，比如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、 迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢 杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌。18) 一种组合物，其包含项1-12中任一项所述的a -淀粉酶变体。19)项18的组合物，进一步包括嗜热脂肪芽孢杆菌(BSG) a-淀粉酶，尤其是 SP961，尤其比例为1 10-10 1，优选1 2。20)项18或19的组合物，其中组合物进一步包括葡糖淀粉酶，支链淀粉酶和/或
植酸酶。21) 一种洗涤剂组合物，包含项1-12中任一项所述的a -淀粉酶变体。
22)项21的洗涤剂组合物，还包含另一种酶，例如蛋白酶、脂酶、过氧化物酶，另一 种淀粉分解酶、葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、CGTase、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、和/或纤维 素酶。23)项1-12中任一项所述a -淀粉酶变体或项18_20中任一项所述的组合物在淀 粉液化中的用途。24)项1-12中任一项所述a -淀粉酶变体或项18_20中任一项所述组合物在乙醇 生产中的用途。25)项1-12中任一项所述a -淀粉酶变体或项18_20中任一项所述组合物在冲洗 和/或餐具清洗中的用途。 26)项1-12中任一项所述a -淀粉酶变体或项18_20中任一项所述组合物在纺织 品退浆中的用途。命名法则在本说明书和权利要求书中，使用了氨基酸残基的常规单字母和三字母编码。为 了便于参考，采用以下命名法则来描述本发明的a-淀粉酶变体原氨基酸位点取代氨基酸根据这一命名原则，例如在第30位丙氨酸到天冬酰胺的取代应表示为Ala30Asn 或 A30N在同一位点的丙氨酸缺失表示为Ala30* 或 A30*添加的氨基酸残基，比如赖氨酸插入表示为Ala30AlaLys 或 A30AK连续的氨基酸残基片段，比如30-33位氨基酸残基缺失表示为(30-33)*或 A (A30-N33)。当特定a-淀粉酶与其他a-淀粉酶相比含有一个“缺失”，并且在该位点做了一 个插入，这种情况表示为(对于36位插入了一个天冬氨酸)*36Asp 或 *36D多重突变用加号隔开，即Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S代表在30和34位分别将丙氨酸和谷氨酸取代为天冬氨酸和丝氨酸。当在一个给定位点可以插入1或多个可选择的氨基酸残基时，将其表示为A30N, E 或A30N 或 A30E另外，当本文中确定了一个适合进行修饰的位点而没有建议具体的修饰方式，应 当理解为可以用任何氨基酸残基来取代该位点的氨基酸残基。因此，例如，如果提及30位 的丙氨酸修饰，但没有具体化，应当理解可以将该丙氨酸缺失或用任何其他氨基酸来取代 它，即下列之一的氨基酸:R> N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。而且，“A30X”表示下述的任何一个取代:A30R, A30N, A30D, A30C ；A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y，或 A30V ；或简写 为:A30R, N, D, C, Q, E, G, H, I，L, K, M, F, P, S, T, ff, Y, V。
若所用编号的亲本酶已经含有在该位置取代的所研究氨基酸残基，则用下面的命 名这种情况中〃 X30N〃或〃 X30N，V"其中例如一或N或V表示野生型。因此，其它相应的亲本酶在位点30被取代为〃 Asn"或〃 Val 〃。附图简述

图1是5个亲本Termamyl样a -淀粉酶的氨基酸序列对比。最左端的数字代表 下列各氨基酸序列1 :SEQ ID NO :4(SP722)2 :SEQ ID NO :2(SP690)3 :SEQ ID NO 10 (BAN)4 :SEQ ID NO :8(BLA)5 :SEQ ID NO :6(BSG)发明详述本发明的目的是提供Termamyl样a -淀粉酶，该变体具有a -淀粉酶的活性，并 且其在高温和/或低PH条件，尤其是低钙浓度下显示改变的稳定性。Termamyl 样 a -淀粉酶许多由芽孢杆菌类制备的a -淀粉酶在氨基酸水平上具有高度同源性(同一性)。 下表显示了许多表 1707AP1378BANBSGSP690SP722AA560Terma-myl例如，发现包含SEQ ID NO 8所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌a -淀粉酶(商品 名为Termamyl )与包含SEQ ID NO 10所示氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌a -淀粉酶大约 81%同源，与包含SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌a -淀粉酶(BSG)大 约65%同源。另外同源的a-淀粉酶包括公开于W0 95/26397的SP690和SP722，并进一 步分别在SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4中描述。本文中其它的淀粉酶有衍生于芽孢杆菌属 的AA560 a -淀粉酶并表示为SEQ ID NO :12，以及在SEQ ID NO 13中显示并由Tsukamoto 等(生物化学和生物物理研究通讯，151 (1988)，25-31页)描述过的衍生于芽孢杆菌的
已知的芽孢杆菌属a“淀粉酶的同一性
百分比 同一性
707 API37 BAN BSG SP690 SP722 AA560 Termamy
100. 08 86.466.966.587.686.295.51 68. 186. 410CI. 067.168.195.186.686.069. 466. 967.110CI. 065.667.168.866.980. 766. 568.165.610C).067.967.166.365. 487. 695.167.167.9100. 087.287.069. 286. 286.668.867.187.210CI. 086.870. 895. 586.066.966.387.086.8100. 068. 368. 169.480.765.469.270.868.3100. 0
8#707 a-淀粉酶。KSM AP1378 a -淀粉酶公开于 W 97/00324 (自 KAO Corporation)。其他同源a-淀粉酶包括EP0252666中描述的地衣芽孢杆菌菌株(ATCC27811) 产生的a-淀粉酶，以及W091/00353和W094/18314中鉴定到的a-淀粉酶。在产品 Optitherm 和 Takatherm (Solvay 有售)、Maxamyl (Gist-brocades/Genencor 有售)、 Spezym AA 和 Spezym Delta AATM(Genencor 有售)以及 Keistase (Daiwa 有售)，Dex lo，GC 521(Genencor 有售)和 Ultraphlow (得自 Enzyme Biosystems)中含有其他一些商 品Termamyl样a -淀粉酶。由于发现这些a-淀粉酶之间有极大的同源性，可以认为它们属于同类a-淀粉 酶，即“Termamyl样a -淀粉酶”类。因此，在本文中，术语“Termamyl样a -淀粉酶”意指一种a-淀粉酶，具体是芽孢 杆菌属a-淀粉酶，它在氨基酸水平上与Termamyl (即具有文中SEQ ID NO :8所示氨基酸 序列的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶)有极大的同源性。换句话说，以下所有具有SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12或13所示氨基酸序列的 a -淀粉酶都被认为是“Termamyl样a -淀粉酶”。其他的Termamyl样a -淀粉酶是这样 一些a-淀粉酶i)与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12和13所示氨基酸序列中的至少一个有至 少60 %、比如至少70 % (例如至少75 % )，或至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至 少97%，至少99%同源(同一性)，和/或由这样一种DNA序列编码，这些序列能与编码以 上的a-淀粉酶的DNA序列进行杂交，其很明显于SEQ ID NO :1、3、5、7、9和本说明书(分 别编码此处SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12和13所示的氨基酸序列)。同源性同源性可以测定为两序列间表示第一序列衍生自第二序列的同一性的程度。同源 性可以通过本领域已知的计算机程序诸如GCG程序包的GAP程序(上述)。因此，Gap GCGvS 可用用于同一性的默认得分矩阵(scoringmatrix)和下述默认参数对于核酸序列比较， 分别是GAP生成罚分为5. 0，GAP延伸罚分为0. 3，以及对于蛋白质序列比较分别是GAP生 成罚分为 3. 0，GAP 延伸罚分为 0. 1。GAP 用 Needleman 和 ffunsch, (1970)，J. Mol. Biol. 48， p. 443-453的方法进行序列对比并推断出同一性。可以利用Termamyl (SEQ ID NO 8)和，例如另一 a -淀粉酶之间的结构对比来鉴 定其他Termamyl样a _淀粉酶中的等同/相应位点。获得所述结构对比的一个方法是利 用GCG程序包中的Pile Up程序，该程序中GAP罚分采用默认值，即GAP生成罚分为3. 0， GAP延伸罚分为0.1。其他结构对比方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等，(1987)，FEBS快 报 224，149-155 页)和反相成丝技术(reverse threading) (Huber T，Torda，AE，蛋白质科 学，7 卷，1 期142-149 (1998))。^^基于所研究a-淀粉酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列，适当地制备上述 Termamyl样a -淀粉酶特征中所用到的寡核苷酸探针。检测杂交的适宜条件包括在5XSSC中预浸泡，于40°C在含有20 %甲酰胺、 5XDenhardt' s溶液、50mM磷酸钠(pH6. 8)以及50mg超声变性小牛胸腺DNA的溶液中预 杂交1小时，然后于40°C在补充有lOOmM ATP的同一溶液中杂交18小时，随之将滤膜洗3次，每次在2XSSC、0. 2% SDS中于40°C (低严谨性)，优选50°C (中等严谨性)，更优选 65°C (高严谨性)，还要优选的是75°C (极高严谨性)洗30分钟。有关杂交方法的其他细 节可见Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，Cold Spring Harbor，1989。在本文中，“衍生于”不仅是指由所研究的微生物菌株产生或能产生的a _淀粉酶， 也指分离自该菌株的DNA序列所编码的、并在用所述DNA序列转化的宿主微生物中产生的
淀粉酶。最后，该术语意指这样的淀粉酶，它由合成的和/或cDNA来源的DNA序列 编码并且具备所述a-淀粉酶的鉴定特征。该术语还用来表示亲本a-淀粉酶可以是天然 存在的a-淀粉酶的变异体，即由天然存在的a-淀粉酶的1或多个氨基酸残基经过修饰 (插入、取代、缺失)所产生的变体。亲本Termamyl样a -淀粉酶本发明所有上述的定义的Termamyl样a -淀粉酶可用作亲本(即主链)a -淀粉 酶。在本发明优选的实施方案中，亲本a-淀粉酶衍生于地衣芽孢杆菌，例如，上述所指的 其中之一诸如具有如SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌a-淀粉酶。亲本杂种a -淀粉酶亲本a -淀粉酶(即主链a -淀粉酶)可以是一种杂种a -淀粉酶，即包含组合 在一起的衍生于至少两个a-淀粉酶的部分氨基酸序列。亲本杂种a-淀粉酶可以是这样的酶，在氨基酸同源性(同一性)和/或DNA杂交 (如上所述)的基础上可以确定它属于Termamyl样a-淀粉酶家族。在这种情况中，杂种 a -淀粉酶通常包含Termamyl样a -淀粉酶的至少一部分和1或多个其他a -淀粉酶的1 个或多个部分，后者选自微生物(细菌或真菌)和/或哺乳动物来源的Termamyl样a-淀 粉酶或非Termamyl样a -淀粉酶。因此，亲本杂种a -淀粉酶可以包括来源于至少两个Termamyl样a -淀粉酶，或 者来源于至少一个Termamyl样a -淀粉酶和至少一个非Termamyl样细菌a -淀粉酶，或 者来源于至少一个Termamyl样和至少一个真菌a -淀粉酶的部分氨基酸序列的组合。部 分氨基酸序列衍生自的Termamyl样a -淀粉酶可以是，例如文中提到的那些特定Termamyl 样a-淀粉酶中的任何一个。例如，亲本a -淀粉酶可以包括衍生于地衣芽孢杆菌菌株的a -淀粉酶的C_末 端部分和来源于解淀粉芽孢杆菌菌株或嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的a "淀粉酶的N-末端部 分。例如，亲本a-淀粉酶可以包括地衣芽孢杆菌a-淀粉酶的C-末端部分的至少430个 氨基酸残基，还可以，例如，包括a)与具有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的解淀粉芽孢杆 菌a-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基相对应的氨基酸片段和与具有SEQ ID NO :8所 示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌a "淀粉酶的445个C-末端氨基酸残基相对应的氨基酸片 段，或者与Termamyl序列(即SEQ ID NO 8所示的地衣芽孢杆菌a -淀粉酶)相同的杂种 Termamyl样a-淀粉酶，除了 N-末端(成熟蛋白质)的35个氨基酸残基被BAN (成熟蛋白 质)(即SEQ ID NO 10所示的解淀粉芽孢杆菌a -淀粉酶；)的N-末端33个残基(成熟 蛋白质)取代；或者b)与具有SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌a -淀粉 酶的68个N-末端氨基酸残基相对应的氨基酸片段和与具有SEQ ID NO :8所示氨基酸序列 的地衣芽孢杆菌a "淀粉酶的415个C-末端氨基酸残基相对应的氨基酸片段。另一合适的亲本杂种a -淀粉酶是先前在W096/23874(NOVO Nordisk申请)中描述的酶，该酶由BAN(解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶)的N-末端(成熟蛋白质的1-300位氨 基酸)和Termamyl的C-末端(成熟蛋白质的301-483位氨基酸)构成。本发明优选的实施方案中亲本Termamyl样a -淀粉酶是SEQ ID NO 8和SEQ ID NO: 10的a-淀粉酶的杂种。特别是，亲本Termamyl样a-淀粉酶的杂种可以是杂种a-淀 粉酶，该a-淀粉酶包含SEQ ID NO :8所示的地衣芽孢杆菌a -淀粉酶的445个C_末端氨 基酸残基和SEQ ID NO: 10所示的解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基， 其进一步适合含有下面的突变H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQ ID N0:8中的 编号)。后面所提到的杂种用在下述的实施例中，并指定为LE174。其它需要特定考虑的亲本a-淀粉酶包括具有较少突变的LE174，即恰 上述的具有下面突变的杂种A181T+N190F+A209V+Q264S ；N190F+A209V+Q264S ； A209V + Q264S ； Q264S ；H 1 56Y + N190F+A209V + Q264S ； HI56Y+A209V + Q264S ； H156Y+Q264S ；H156Y+A181T+A209V+Q264S ；H156Y+A181T+Q264S ；H156Y+Q264S ； H156Y+A181T+N190F+Q264S ；H156Y+A181T+N190F ；H156Y+A181T+N190F+A209V。这些杂交也 被认为是本发明的部分。在优选的实施方案中，亲本Termamyl样a -淀粉酶是LE174，SP722， 或 AA560 包括任何 LE174+G48A+T49I+G107A+I201F ；LE174+M197L ；LE174+G48A+ T49I+G107A+M197L+I201F, or SP722+D183*+G184* ；SP722+D183*+G184*+N195F ； SP722+D183*+G184*+M202L ；SP722+D183*+G184*+N195F+M202L；BSG+1181*+G182* ； BSG+I181*+G182*+N193F；BSG+1181*+G182*+M200L ；BSG+I181*+G182*+N193F+M200L ； AA560+D183*+G184* ；AA560+D183*+G184*+N195F ；AA560+D183*+G184*+M202L ； AA560+D183*+G184*+N195F+M202L。其它要考虑的亲本a -淀粉酶包括LE429，其是具有I201F的附加取代的LE174。 基于本发明LE335是这样的a-淀粉酶，其与LE429相比，在T49I+G107A中有附加的取代； LE399 是 LE335+G48A，即 LE174，具有 G48A+T49I+G107A+I201F。改变特性以下讨论存在于本发明的变体中的突变与可能由该突变导致的希望的性质变化 (相对亲本Termamyl样a -淀粉酶的这些性质)之间的关系。如上所述本发明涉及具有改变特性(上述)的亲本Termamyl样a -淀粉酶，尤其是在高温和/或在低pH下，特别是低钙浓度下。本发明中“高温”指的是70-120°C，优选80_100°C，尤其是85_95°C。本发明中“低pH”指的是pH的范围为4-6，优选4. 2-5. 5，尤其是4. 5_5。本发明中“高pH”指的是pH的范围为8-11，优选8. 5-10. 6。本发明中“低钙浓度”指的是低于60ppm的游离钙的水平，优选40ppm，更优选 25ppm,尤其 5ppm。特别值得研究的亲本Termamyl样a -淀粉酶具有经过特别研究的改变特性，是上 述所提到的亲本Termamyl样a -淀粉酶和亲本杂种Termamyl样a -淀粉酶。Termamyl a -淀粉酶用作起始点，但在例如 SP722，BS G, BAN, AA560, SP690, KSM AP1378，和#707中的相应位点应被理解为公开的并特别考虑的。在优选的实施方案中，本发明的变体尤其在具有高温和/或低pH下。
本发明一方面涉及具有上述的改变特性的变体。第一方面亲本Termamyl样a -淀粉酶包含在选自下述的一或更多的位点改变 (采用 SEQ ID NO :8 用于氨基酸编号)49，60，104，132，161，170，176，179，180，181，183， 200，203，204，207，212，237，239，250，280，298，318，374，385，393，402，406，427，430，440， 444，447，482，其中(a)改变分别是(i)在占据该位点的氨基酸下游的氨基酸插入，(ii)占据该位点的氨基酸的缺失，或(iii)以不同的氨基酸取代占据该位点的氨基酸，(b)变体具有a -淀粉酶活性(c)每个位点相应于具有SEQ ID NO 8中所示的氨基酸序列的亲本Termamyl样a -淀粉酶氨基酸序列的位点。在Termamyl (SEQ ID NO :8)，所述相应的位点是T49 ；D60 ；N104 ；E132 ；D161 ；K170 ；K176 ；G179 ；K180 ；A181 ；D183 ；D200 ；Y203 ； D204 ；D207 ；1212 ；K237 ；S239 ；E250 ；N280 ；Q298 ；L318 ；Q374 ；E385 ；Q393 ；Y402 ；H406 ； L427D430 ；V440 ；N444 ；E447 ；Q482。SP722 (SEQ ID NO 4)中相应的位点是:T51 ；D62 ；N106 ；D134 ；D163 ；Q172 ；K179 ； G184 ；K185 ；A186 ；D188 ；D205 ；M208 ；D209 ；X212 ；L217, K242, S244, N255, N285, S303, M323 ； D387, N395 ；Y404 ；H408 ；1429 ；D432 ；V442 ；K446 ；Q449 ；K484。通过如上所述的序列对比和在图1所示的排列发现其它亲本a -淀粉酶相应的位
点o在优选的实施方案中，本发明的变体(用SEQ ID NO 8 (Termamyl )编号)具有下 述的一或多个取代T49I ；D60N ；N104D ；E132A, V, P；D161N；K170Q；K176R ；G179N ；K180T ；A181N ； D183N ；D200N ；X203Y ；D204S ；D207V, E, L, G ；X212I ；K237P ；S239W ；E250G, F ；N280S ；X298Q ； L318M ；Q374R ；E385V ；Q393R ；Y402F ；H406L, W ；L427I D430N ；V440A ；N444R, K ；E447Q, K ； Q482K.在优选的实施方案中，本发明的变体(使用SEQ ID N0:4(SP722)编号)具有下述 的一或多个取代T51I ；D62N ；N106D ；D134A, V, P ；D163N ；X172Q；K179R ；G184N ；K185T ；A186N ； D188N ；D205N ；M208Y ；D209S ；X212V, E, L, G ；L217I，K242P，S244W, N255G, F, N285S, S303Q, X323M ；D387V, N395R ；Y404F ；H408L, W ；X429I ；D432N ；V442A ；X446R, K ；X449Q, K ；X484K，使 用 SEQ ID NO :4(SP722)编号。优选的是，二重，三重或多重突变-使用SEQ ID NO :8作为编号基础-所述突变选 自T49I+D60N ；T49I+D60N+E132A ；T49I+D60N+E132V ；T49I+D60N+E132V+K170Q ；T49I+D60N+E132A+K170Q ；T49I+D60N+E132V+K170Q+K176R ；T49I+D60N+E132A+K170Q+K176R ；T491+D60N+E132V+K170Q+K176R+D207V ；T491+D60N+E132A+K170Q+K176R+D207V ；T49I+D60N+E132V+K170Q+K176R+D207E ；
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Q393R+Y402F+H406L+L427I+V440A ；Y402F+H406L ；Y402F + H406L + L427I ； Y40 2F + H40 6 L + L4 2 7 I+V440 A ；H406L + L427I ； H406L+L427I+V440A ；L427I+V440A ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D43 0N+N444K+E447Q+Q482K ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+N44 4K+E447Q+Q482K ；D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+N444K+E447Q+Q482K ；D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+E447Q+Q482K ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D43 0N+E447Q+Q482K ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+E44 7Q+Q482K ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N ； H406W+D430N ；N444K+E447Q+Q482K ；E447Q+Q482K ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D43 0N+N444R+N444K+E447K+Q482K ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+D430N+N44 4R+N444K+E447K+Q482K ；N104D+D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W ；H406W+D430N ；N444K+E447K+Q482K ；E447K+Q482K ；N104D+D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W ；N104D+D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P ；N104D+D161N+A181N+D183N+D200N+D204S ；D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W ；D161N+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P ；D161N+A181N+D183N+D200N+D204S ；K237P+S239W，使用 SEQ ID NO 8 编号。优选的实施方案中变体具有下述取代K170Q+D207V+N280S ；E132A+D207V ； D207E+E250G+H406L+L427I ；D207V+L318M ；D60N+D207V+L318M ；T49I+E132V+V440A ； T49I+K17 6R + D20 7V + Y40 2F ； Q374R + E385V + Q393R ； N 1 90F + A209V + Q264S ； G48A+T49I+G107A+I201F；T49I+G107A+I201F ；G48A+T49I + I201F ；G48A+T49I+G107A ； T49I+I201F ；T49I+G107A ；G48A+T49I ；D161N+G179N+K180T+A181N+D183N+D200N+D204S+K237P+S239W+H406W+ D430N+N444K+E447Q+Q482K 使用 SEQ ID NO :8 编号。特定的变体包括LE399 ； LE174+G48A+T49I+G107A ；LE174+G48A+T49I + I201F；LE174+G48A+G 107A+I201F ； LE174+T49I+G 107A+I201F ；LE 174+G48A+T49I ；LE174+G48A ；LE174+G107A+I201F； LE174+I201F，是本发明具体考虑的变体。
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稳定性本发明中，重要的突变(包括氨基酸)以达到改变的稳定性，尤其是改进的稳定性 (即高或低)，尤其是高温(即70-120°C)和/或极端pH(即低或高pH，即分别为pH4-6或 PH8-11)，尤其是在游离的(即未结合的，在溶液中)低于60ppm钙浓度，包括“改变特性”那 节所列的任何突变。稳定性可按照“材料和方法”那节所述进行测定。本发明变体的一般突变本发明的变体在一实施方案中可包括除了上述那些之外的一或多个突变。因此， 将被修饰的a-淀粉酶变体某部分存在的1或多个脯氨酸取代为非脯氨酸残基可能是有益 的，所述非脯氨酸可以是任何可能的、天然非脯氨酸残基，优选是Ala、Gly、Ser、Thr、Val或 Leu。类似地，可以优选将亲本a -淀粉酶被修饰的那些氨基酸残基中存在的1或多个 Cys残基取代为非半胱氨酸残基，比如Ser、Ala、Thr、Gly、Val或Leu。另外，可以将本发明的变体进行修饰一作为唯一的修饰或者结合上面概括的任何 修饰一以便将与SEQ ID NO: 10中的185-209位氨基酸片段所对应的氨基酸片段中存在的 1或多个Asp和/或Glu分别取代为Asn或Gin。同样有意义的是在Termamyl样a -淀粉 酶中，将与SEQ ID NO :10中的185-209位氨基酸片段所对应的氨基酸片段中存在的1或多 个Lys残基取代为Arg。应当明白，本发明涵盖了含有两个或多个上述修饰的变体。另外，向此处描述的一或多个位点导入突变可能是有益的(使用SEQ IDN0 8 (Termamyl)编号)。M15, V128, Alll, H133, W138, T149, M197, N188, A209, A210, H405, T412，尤其是下 述的单一的，两重或三重或多重突变 M15X,尤其是 M15T, L ；V128X，尤其是 V128E ；H133X,尤其是 H133Y ；N188X,尤其是 N188S, T, P ；M197X,尤其是 M197T，L ；A209X,尤其是 A209V ；M197T/W138F ；M197T/W138Y ；M15T/H133Y/N188S ；M15/ V128E/H133Y/N188S ；E119C/S130C；D124C/R127C；H133Y/T149I ；G475R, H133Y/S187D ； H133Y/A209V.制备本发明a-淀粉酶变体的方法几种将突变导入基因的方法是本领域已知的。简要讨论a -淀粉酶_编码DNA序 列之后，将讨论在a -淀粉酶-编码序列中的特定位点产生突变的方法。克隆编码a -淀粉酶的DNA序列可以利用多种本领域的公知方法，从任何能产生目的a _淀粉酶的细胞或微生物 中分离编码亲本a-淀粉酶的DNA序列。首先，应当利用得自能产生目的a-淀粉酶的有 机体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果a -淀粉酶 的氨基酸序列是已知的，可以合成并合成并用同源的、标记的寡核苷酸来由从目的有机体 制备的基因组文库鉴定a-淀粉酶-编码克隆。另外，可以使用标记的寡核苷酸探针(该探针含有与已知a-淀粉酶基因同源的序列)作为探针，采用低严谨性杂交和洗涤条件来 鉴定a-淀粉酶-编码克隆。另一种鉴定a-淀粉酶-编码克隆的方法包括将基因组DNA片段插入表达载体 (比如质粒)，用所得基因组DNA文库转化a -淀粉酶阴性的细菌，以及随后将转化细菌铺 到含有a-淀粉酶底物的琼脂上，从而能鉴定表达a-淀粉酶的克隆。或者，可以通过已确立的标准方法来合成制备编码酶的DNA序列，例如 S. L. Beaucage 禾口 M. H. Caruthers, Terahedron Letters, 22,1981，PP. 1859-1869 描述的磷 酸脒方法或Matthes等The EMBO J. 3，1984，pp. 801-805描述的方法。在磷酸脒方法中，在 例如自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，将其纯化、退火、连接和克隆到合适的载体中。最后，DNA序列可以是基因组和合成来源混合的、合成和cDNA来源混合的，或者 基因组和cDNA来源混合的，其是依照标准技术，将合成的、基因组或cDNA来源的片段连 接在一起而制备的(在合适时，对应完整DNA序列各部分的片段)。还可以如US4683202 或R. K. Saiki等Science 239，1988，pp. 487-491描述的，使用特异引物通过聚合酶链反应 (PCR)来制备DNA序列。定点突变一旦分离出a-淀粉酶编码的DNA序列，利用合成的寡核苷酸引入突变，鉴定用于 突变的所希望的位点。这些寡核苷酸包含侧接目的突变位点的核苷酸序列。将突变的核苷 酸在寡核苷酸合成期间插入。在特定方法中，DNA单链缺口，连接(bridging) a-淀粉酶编 码序列，在携带有a-淀粉酶基因的载体中产生。然后含有目的突变的合成核苷酸退火至 单链DNA的同源部分。所保留的缺口利用DNA聚合酶I(Klen0W片段)填充，利用T4连接 酶连接构建体。该方法的特异性实施例在Morinaga等(1984)中描述。US4760025公开了 通过实施较小改变盒寡编码多重突变核苷酸。然而，由于多数各种长度的寡核苷酸可被引 入甚至更多的突变可通过Morinaga等方法在任何时候引入。将突变引入编码a-淀粉酶的DNA序列的另一种方法在Nelson和Long (1989)中 描述。其涉及PCR片段的3-步产生(3-st印generation)，该PCR片段含有导入的目的突 变，利用化学合成的DNA链作为PCR反应中的之一引物。PCR生成的片段，通过限制性内切 酶的切割分离出携带突变的DNA片段并将其重新插入到表达质粒。本发明提供变体的可选的方法，例如，如W0 95/22625 (自AffymaxTechnologies N. V.)或W096/00343 (Novo Nordisk A/S)或其它相应的技术导致包含该要研究的突变 例如取代和/或缺失的杂交酶，包括基因改组。亲本a-淀粉酶变体的实施例可以合适 地用于提供具有所述突变的杂交，根据本发明包括的在EP1022334中公开的KSM-K36和 KSM-K38 a -淀粉酶(在此引入作为参考)。表达a -淀粉酶变体根据本发明，可以利用表达载体将通过上述方法，或者通过本领域已知的任何替 代方法制备的编码变体的DNA序列表达为酶的形式，载体通常包括调控序列，该序列编码 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地，阻遏子基因或各种激活子基 因。携带编码本发明所述a -淀粉酶变体之DNA序列的重组表达载体可以是任何能方 便地进行重组DNA操作的载体，且载体的选择通常取决于它将要导入的宿主细胞。因此，载
21体可以是自主复制的载体，即以染色体外个体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例 如质粒、噬菌体或染色体外元件、微小染色体或人工染色体。可选择地，载体可以是这样的， 当被导入宿主细胞时，它会整合到宿主基因组中，并与所整合到其中的染色体一起复制。在所述载体中，DNA序列应当可操纵地连接到合适的启动子序列。该启动子可以 是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并可以来源于编码宿主细胞的同源或 异源蛋白质的基因。适于引导编码本发明所述a-淀粉酶变体的DNA序列进行转录(特别 是在细菌宿主中)的启动子的例子是大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖 酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌a-淀粉酶(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖 淀粉酶(maltogenic amylase)基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌a -淀粉酶(amyQ) 的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。在真菌宿主中进行转录时，有用的 启动子的例子是来源于这样一些基因的启动子，所述基因编码米曲霉TAKA淀粉酶、米赫氏 根霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸稳定a-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉 酶、米赫氏根霉脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。本发明的表达载体还可以包含合适的转录终止子以及，在真核细胞中时的多腺苷 酸化序列，它们与编码发明所述a-淀粉酶变体的DNA序列可操纵地连接在一起。终止和 多腺苷酸化序列可以适当地来自与启动子相同的来源。载体还可以包含能使载体在目的宿主细胞中进行复制的DNA序列。这类序列的例 子是质粒 pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl 和 pIJ702 的复制原点。载体还可以包含选择标记，例如一个其产物能补偿宿主细胞缺陷的基因，比如来 自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因；或者赋予抗生素抗性(比如氨苄青霉素、卡那 霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。另外，载体可以包含曲霉选择标记，比如amdS、argB、 niaD和sC，产生潮霉素抗性的标记，或者可以通过共转化(例如W091/17243中描述的)来 实现选择。胞内表达在某些方面可能是有益的，例如用某种细菌作为宿主细胞时，但通常优 选表达是胞外的。总之，此处提及的芽孢杆菌a-淀粉酶包含一个允许被表达的蛋白酶分 泌到培养基中的前导区。如果需要，可以方便地通过取代编码该前区的DNA序列来将该前 区替换为不同的前导区或信号序列。用于分别将编码a-淀粉酶变体、启动子、终止子和其他元件的本发明所述DNA 构建体连接在一起，并将其插入合适的包含复制所用的必要信息之载体的步骤是本领域 技术人员所熟知的(参考，例如，Sambrook等，分子克隆实验指南，第2版，Cold Spring Harbor,1989)。本发明的细胞，它包含如上所述的本发明DNA构建体或表达载体，可以有效地作 为重组制备本发明a-淀粉酶变体的宿主细胞。可以用本发明编码变体的DNA构建体，方 便地通过将该构建体(以1或多拷贝)整合到宿主染色体中来转化所述细胞。通常认为整 合是有益的，因为这样DNA序列更可能稳定地保持在细胞中。可以依照常规方法，例如通过 同源或异源重组将DNA构建体整合到宿主染色体中。可选择地，可以根据宿主细胞的不同 类型用上面描述过的表达载体来转化细胞。本发明的细胞可以是更高等的生物，比如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选是微生 物细胞，比如细菌或真菌(包括酵母)细胞。
合适的细菌的例子是革兰氏阳性细菌，比如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽 孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillcus alkalophilus)、解淀 粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆 菌，或者浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或者是革兰氏阴性细菌，比如大肠杆菌。可以通过例 如原生质体转化或利用竞争细胞以已知方式来实现细菌的转化。可以有利地从酵母属或裂殖酵母属中选择酵母微生物，例如酿酒酵母。丝状真菌 最好是属于曲霉属的种，例如米曲霉或黑曲霉。可以通过一个包括原生质体形成和转化，以 及随后以已知方式再生细胞壁的方法来转化真菌细胞。在EP238023中描述了转化曲霉宿 主细胞的适用步骤。再一方面，本发明涉及制备发明所述a-淀粉酶变体的方法，该方法包括在有助 于变体生产的条件下培养以上描述的宿主细胞，以及从细胞和/或培养基中回收变体。用于培养细胞的培养基可以是任何适合目的宿主细胞生长以及本发明所述 a-淀粉酶变体进行表达的常规培养基。可以从供应商那里获得合适的培养基或者可以根 据公开的配方(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所描述的)来制备。可以通过公知方法从培养基中方便地回收宿主细胞所分泌的a -淀粉酶变体，这 些方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，以及借助盐(比如硫酸铵)来沉淀培养 基中的蛋白类成分，然后利用层析操作，比如离子交换层析、亲合层析等。工业应用本发明的a-淀粉酶变体具备适合多种工业应用的有价值的特性。具体来说，本 发明的酶变体可以作为洗涤、餐具清洗和硬表面清洁的洗涤剂组合物的成分。本发明具有改变特性的变体可用于淀粉加工，尤其是淀粉转化，特别是淀粉液化 作用(参见，例如 US3912590, EP 专利 252730 和 63909, W099/19467, W096/28567 此处所有 的文献引入作为参考)。还要考虑的是用于淀粉转化的组合物，除了本发明的变体外还包括 AMG，支链淀粉酶和其它a-淀粉酶。而且，本发明的变体还在由淀粉生产增甜剂和乙醇(参见例如在此引入参考的美 国专利5231017)，例如燃料，饮料和工业乙醇，来自淀粉或全部谷物。本发明的变体还在纺织品退浆时有用(参见例如在此引入参考的，W095/21247, 美国专利 4643736，EP119920)。洗涤剂组合物如上所述，可以适当地将本发明的变体加入洗涤剂组合物中。涉及洗涤剂组合物 相关成分(如洗衣洗涤剂或餐具洗涤剂)的进一步的细节、在这类洗涤剂组合物中配制变 体的合适方法以及洗涤剂组合物的有关类型，可以参考例如，W096/23874和W097/07202。包含本发明变体的洗涤剂组合物可以另外含有一或多种其他酶，比如蛋白酶、脂 酶、过氧化物酶，另一种淀粉分解酶、葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、CGTase和/或纤维素酶、 甘露聚糖酶(如自Novozymes的Mannaway ，Denmark))，果胶酶，pectine裂解酶，角质酶、 漆酶，和/或另一种a淀粉酶。可以将本发明的a-淀粉酶变体以常规使用的浓度加入洗涤剂中。目前考虑 可以将本发明的变体以相当于每升使用常规剂量水平洗涤剂的洗涤/餐具清洗液中含 0. 00001-lmg a-淀粉酶的用量(以纯品计算，活性酶蛋白)加入。
组合物本发明还涉及包含本发明变体的组合物，在优选的实施方案中还有嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG)，特别是其变体。在另一实施方案中，组合物除了本发明葡糖淀粉酶变体，包括尤其是衍生于黑曲 霉的葡糖淀粉酶(例如公开于Boel et al. (1984)，Gl或G2黑曲霉AMG“衍生于黑曲霉的葡 糖淀粉酶Gl和G2合成自两种不同但很相关的mRNA"EMB0 J. 3 (5), P. 1097-1102，或其变体， 尤其公开于 WO 00/04136 或 WO 01/04273 或公开于 WO 99/28448Talaromyces emersonii AMG。特定组合是LE399和公开于WO 00/04136或WO 01/04273的变体，尤其是具有下 述一或更多个取代的变体N9A, S56A, V59A, S119P, A246T, N313G, E342T, A393R, S394R，Y402F，E408R，尤其是
具有所有突变的变体。在实施方案中，本发明的组合物还包括支链淀粉酶，尤其是芽孢杆菌属的支链淀 粉酶。材料和方法塵SEQ ID NO 8所示的地衣芽孢杆菌α -淀粉酶，也可从Novozyme获得。AA560 :SEQ ID NO 12 ；公开于 WO 00/60060 ；于 1999 年 1 月 25 日在 DSMZ 保 藏并且保藏号为DSMZ. 12649。本发明人将AA560保藏于国际承认用于专利程序的微生 物保藏布达佩斯条约下的德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutshe Sammmlung von Microorganismen und ZelIkulturenGmbH (DSMZ)), Mascheroder Weg lb, D-38124Braunschweig DE0LB培养基(1 升H2O 中10g bacto-胰蛋白胨e，5g bactoyeast 提取物，IOg NaCl, pH调为7. 0w. NaOH,高压灭菌)。TY 琼脂板(1 升 H20 :16g bacto-胰蛋白胨，IOg bacto-yeast 提取物，5gNaCl，pH 调为7. 0w. NaOH，和高压灭菌前添加15g bacto-agar)。10% Lugol溶液(碘/碘化钾溶液；通过储藏的H20稀释(dil. ) 10倍制备=Sigma Cat. no. L6146)。枯草芽孢杆菌SHA273 见 WO 95/10603质粒pDN1528包含编码Termamyl的完整基因，amyL，其自身启动子指导其表达。而且， 该质粒还包含来自质粒PUBl 10的复制原点，ori，以及来自质粒pUC194的cat基因，赋予对 氯霉素的抗性。ρ·1528在WO 96/23874的图9中显示。方法低pH滤膜检测将芽孢杆菌文库铺在含有10yg/ml氯霉素的TY琼脂板上的醋酸纤维素 (0E67, Schleicher&Schuell, Dassel, Germany)和硝酸纤维素滤膜(Protran_Ba85， Schleicher&Schuell, Dassel, Germany)夹心上，于37°C保持至少21小时。将醋酸纤维素 层放在TY琼脂板上。
铺板之后，但要在保温之前用针将每个滤膜夹心特异地标记，以便能够确定阳 性变体在滤膜上的位置，并将结合了变体的硝酸纤维素滤膜转移到盛有柠檬酸盐缓冲液 (pH4. 5)的容器中，于80°C温育20分钟(筛选野生型主链变体时)或85°C 60分钟(筛选 LE399主链变体时)。将带有菌落的醋酸纤维素滤膜于室温保存在TY平板上待用。温育后， 在含有琼脂糖、0.2%淀粉的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的平板上检测残存的活性。用与 滤膜夹心相同的方式标记带有硝酸纤维素滤膜的检测平板，并于50°C培养2小时。移去滤 膜后，用10% Lugol溶液将检测平板染色。降解淀粉的变体检测为深蓝色背景上的白色斑 点，然后在保存平板上鉴定。在与第一次筛选相同的条件下将阳性变体重筛两次。次级筛选将在筛选后的阳 性转化体自储藏板中挑起并在次级板试验中检测。阳性转化体在 5ml LB+氯霉素于37°C生长22小时。芽胞杆菌属每个阳性转化体和作为对照的表达相应 主链的克隆在柠檬酸盐缓冲液，PH 4.5中90°C培养，样品于0，10，20，30，40，60和80分钟 时取出。3微升样品在试验板上点样。试验板用10% Lugol溶液染色。观察到改进的变体 具有比主链高的残留活性(试验板上检测为晕圈)。通过核苷酸测序测定改进的变体。未纯化变体的稳定试骑要分析的表达变体的芽孢杆菌属培养物在IOml LB+氯霉素中37°C生长21小时。 800微升培养物与200微升柠檬酸盐缓冲液pH 4. 5混合。相应于大量样品时间点的多个 70微升等分试样在PCR管中制备，并于PCR仪器70°C培养((wt主链(backbone)变体)或 900C (对于LE399的变体)各时间点(通常5，10，15，20，25和30分钟)培养。0分钟样品 未在高温培养。样品的活性通过转移20微升到200微升α -淀粉酶PNP-G7底物MPR3的 (BoehringerMannheim Cat. no. 1660730)，如下“ α -淀粉酶活性的试验”所述。结果显示为 百分比活性(相对与0时间点)对时间作图，或表述为培养一段时间之后百分比剩余活性。α -淀粉酶变体的发酵和纯化携带相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株在自-80°C储藏的有10微克/ml卡那霉素 的LB-琼脂板上接种，将菌斑转移到100ml PS-I添有chloamphinicol IOmicro g/ml培养 基的500ml摇瓶中。PS-I培养基组合物Pearl sugar 100g/lSoy Bean Meal 40g/lNa2HPO4,12H20 10g/lPluronicTM PE 6100 0.lg/1CaCO3 5g/l培养物在37°C于270rpm振荡5天。通过4500rpm离心20-25分钟从发酵液中除去细胞或细胞碎片。然后将上清过滤， 以获得彻底清晰的溶液。浓缩滤液并在UF-过滤器(lOOOOcut off膜)冲洗。缓冲液变为 20mM醋酸盐pH 5. 5。将UF-滤过液应用到S_s印harose F. F.上并且通过用0. 2M NaCl的 相同缓冲液进行分步洗脱。lOmMTris，pH 9. 0透析洗脱液并应用到Q_s印harose F. F.，用 线性梯度0-0. 3M NaC16柱体积洗脱。含有活性的(由Phadebas试验测定)级分被汇集， 调PH到pH 7. 5通过5分钟内0. 5% ff/vol.活性炭处理除去剩余的颜色。
纯化变体的稳定件测定全部纯化变体稳定性实验使用相同的设置进行。方法是在相应条件(1-4)下温育酶。于不同时刻取样品，例如0、5、10、15和30分钟后， 将样品在检测缓冲液(0. 1M 50mM Britton缓冲液pH7.3)中稀释25倍(所有取样稀释度 相同)，并采用Phadebas检测法(Pharmacia)在标准条件(pH7. 3，37°C )下测量活性。以温育前(0分钟)测量的活性作为对照(100% )。将下降的百分比作为温育时 间的函数来计算活性。表中显示在温育例如30分钟后的残存活性。比活件测定采用Phadebas检测法(Pharmacia)将比活性确定为活性/mg酶。测定依照产品 说明书进行(还可见以下“ a -淀粉酶活性检测”)。a -淀粉酶活件检测法1. Phadebas 检测法通过一种采用Phadebas 片剂作为底物的方法来测定《 _淀粉酶的活性。 Phadebas 片剂(Phadebas Amylase Test，由 Pharmacia Diagnostic 提供)含有一种交联 的不溶性兰色淀粉聚合物，该聚合物与牛血清白蛋白和缓冲物质混合在一起并做成片剂。进行每次测量时，将一个药片悬浮于含有5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液 (50mM醋酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0. ImM CaCl2、用NaOH调至所需pH)的试管中。于所需温 度在水浴中进行实验。将待测a-淀粉酶在xml 50mM Britton-Robinson缓冲液中进行稀 释。将1ml该a -淀粉酶溶液加入5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液中。a -淀粉酶水 解淀粉产生水溶性兰色碎片。在620nm比色测定到的所得兰色溶液的吸光度是a -淀粉酶 活性的函数。重要的是温育10或15分钟后测量的620nm吸光度应在0. 2到2. 0吸收单位内。 在这样的吸光度范围内，活性和吸光度是线性关系(Lambert-Beer定律)。因此，必须调节 酶的稀释度以便符合该法则。在特别设置的条件(温度、PH、反应时间、缓冲液条件)下， lmg给定a-淀粉酶将水解一定量的底物并产生兰色。在620nm测量色度。在给定条件下， 所测得的吸光度与受测a-淀粉酶的特异活性直接成比例(活性/毫克纯a-淀粉酶蛋白 质)。2.替代方法通过一种采用PNP-G7作为底物的方法来确定a -淀粉酶的活性。PNP-G7 (邻-硝 基苯-a，D-麦芽庚糖苷的缩写)是一种被封闭的寡糖，可以被内-淀粉酶切割。切割之 后，试剂盒中包含的a "葡糖苷酶消化底物释放出游离的PNP分子，它呈现黄色，因此可以 在人=405nm(400-420nm)的可见光处比色测量。包含PNP-G7底物和a-葡糖苷酶的试 齐[Jifi Boehringer-Mannheim cat. No. 1054635) $[Jit。按照生产商所推荐将10ml底物/冲液加入50ml酶/缓冲液来制备试剂缓冲液，该 试验是通过下述进行的将20 u 1酶溶液转移到一个96孔微量滴定板上并于25°C温育来 进行检测。加入200 u 1试剂溶液(25°C )。将溶液混勻，预保温1分钟，并在ELISA reader 上4分钟内每30秒测量一次0D405nm处的吸光度。在给定条件设置下，随时间变化的吸光度曲线的斜率与受测a -淀粉酶活性(活 性/毫克酶)成正比。
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实施例实施例1与亲本酶相比，在高温和低钙离子浓度，低pH下具有在改进稳定性的地衣芽孢杆 菌a “淀粉酶变体通过易错RCR诱变构建。易错PCR诱变和文库构建为改进在高温和低钙离子浓度，低pH下地衣芽孢杆菌a -淀粉酶变体的稳定性， 实施易错PCR诱变。利用编码野生型地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因的质粒PDW528作为 模板，以用下面引物在PCR条件下扩增该基因，22149 5' -CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG3' (SEQID NO 14)和 24814 5' -GAT CAC CCG CGA TAC CGT C-3' (SEQ ID NO 15)。 其中升高的错率导致引入随机点突变。所用的PCR条件是10mM Tris-HCl, pH 8. 3,50mM KCl,4mM MgC12，0. 3mM MnC12，0. ImM dGTP/dATP，0. 5mMdTTP/dCTP，和每 100微升(micro 1) 反应液2. 5单位的Taq聚合酶。所得的PCR片段在胶上纯化，并在基于PCR多聚化步骤中使用，通过下述引物 的pDm528PCR扩增产生的胶纯化载体片段，#24 :5 ‘ -GAA TGTATG TCG GCC GGC AAA ACG CCG GTG A_3' (SEQ ID NO 16)和 #27 :5_GCC GCC GCT GCT GCA GAA TGA GGC AGC AAG-3' (SEQ ID NO :17)，由此形成重叠以插入片段。多聚化反应随后被引入枯草芽孢杆 菌(Shafikhaniet al.，Biotechniques,23(1997)，304 310)。筛选上述易错文库在低pH滤膜试验中筛选(见"材料与方法")。对重筛选阳性的克 隆检测进行“材料与方法”的液体试验中其稳定性次级筛选。结果在pH 4. 5，5ppm钙下于90°C温育升高的稳定性 1) “ + ”表示相对于野生型(wt)稳定性显著升高在pH 4. 5，5ppm钙下于90°C温育升高的稳定性 1) “ + ”表示相对于野生型稳定性显著升高在pH4. 5，5ppm钙下于90°C温育升高的稳定性 1) “ + ”表示相对于野生型稳定性显著升高实施例2通过定点诱变，与亲本酶从实施例1到新(非野生型)主链的进行选择以改进在 低PH和低钙离子浓度稳定性。定点诱变将自LE493 (K176R+D207V+Y402F)突变转移到LE399生产的LE495。这是通过重叠 PCR 方法(Kirchhoff 禾口 Desrosiers，PCR Methods andApplications，2 (1993)，301—304)。 通过下述引物及LE399模板产生2个重叠PCR片段，片段A :#312Mutl765' -CCC GAAAGC TGAACC GCA TCT ATAGGT TTC AAG GGA AGA CTT GGG ATT-3' (SEQ ID NO 18)(粗体表示 突变密码子)和 #290D207 重叠 5 ‘ -AGG ATG GTC ATA ATC AAA GTC GG-3 ‘ (SEQ ID NO 19)；片段B :#313Mut2075' -CCG ACT TTG ATT ATG ACCATC CTG TTG TCG TAG CAG AGA TTA AGA GAT GGG G_3' (SEQ ID NO 20)和 #314Mut4025' -CGA CAA TGT CAT GGT GGT CGA AAA AAT CATGCT GTG CTC CGT ACG-3' (SEQ ID NO :21)。片段A和B等克分子的比例混合并接 着用下面外引物扩增全长片段，#312Mutl76和#314Mut402。该片段用下述引物产生的载体 PCR片段用于多聚化反应。#296Y402multi5' -TTT CGA CCA CCA TGA CAT TGT CG_3' (SEQ ID NO 22)和 #305399Multil765' -TAT AGA TGC GGT TCA GCT TTC GGG-3' (SEQ ID NO 23)，用上述的模板LE399。接着用多聚化反应转化入枯草芽孢杆菌。对于上述试验中的稳 定性筛选克隆。一些克隆中具有改进稳定性自LE493的突变存在通过测序证实。以相似的方式通过采用利用引物#312Mutl76和#314Mut402扩增LE399编码模 板获得LE 497，并在采用载体片段多聚化反应中使用所得PCR片段，而载体片段是通过 LE399PCR 扩增，采用引物 #296Y402multi 和 #305399Multil76 获得。结果
LE399变体在pH4. 5，5ppm钙于90°C培养升高的稳定性 1) “ + ”表示相对于主链稳定性显著升高
权利要求
一种亲本Termamyl样α-淀粉酶的变体，所述变体包含位点207的改变其中(a)所述改变分别是(i)在紧邻该位点的氨基酸下游的氨基酸插入，(ii)占据该位点的氨基酸的缺失，或(iii)以不同的氨基酸取代占据该位点的氨基酸，(b)变体具有α-淀粉酶活性，和(c)每个位点相应于具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的亲本Termamyl样α-淀粉酶的氨基酸序列的位点。
2.权利要求1所述的变体，其中该变体具有下述的突变D207V，L，G ；使用 SEQ ID NO 8 的编号。
3.权利要求1或2所述的变体，其中该变体具有下述的突变K170Q+D207V+N280S； E132A+D207V ；D207V+L318M ；D60N+D207V+L318M ；T49I+K176R+D207V+Y402F ；使用 SEQ ID NO 8的编号。
4.权利要求1-3中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a-淀粉酶具有SEQ ID NO 8所示氨基酸序列且衍生于地衣芽孢杆菌的菌株，亲本Termamyl样a -淀粉酶具有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列且衍生于解淀粉芽孢杆菌的菌株，亲本Termamyl样a -淀粉酶 具有SEQ ID NO :6所示氨基酸序列且衍生于嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株。
5.权利要求1-4中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a-淀粉酶是LE174 ； LE174+G48A+T49I+G107A+I201F ；LE174+M197L ；或 LE174+G48A+T49I+G107A+M197L+I201F。
6.权利要求1中所述的变体，其中该变体在下述位点发生突变X212V，L，G；使用SEQ ID NO 4的编号。
7.权利要求1或6中所述的变体，该变体具有下述的突变E212V+N285S； D134A+E212V ；E212V+X323M ；D62N+E212V+X323M ；T51I+K179R+E212V+Y404F ；或 N195F+X212V+K269S，使用 SEQ ID NO 4 的编号。
8.权利要求1-7中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a-淀粉酶选自 SP690 (SEQ ID NO 2) ； SP722(SEQ ID NO 4) ；AA560 (SEQ ID NO: 12) ；#707 a -淀粉酶(SEQ ID NO 13)；和 KSM-AP1378。
9.权利要求1-8中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a-淀 粉酶是下述任何一种SP722+D183*+G184* ；SP722+D183*+G184*+N195F ； SP722+D183*+G184*+M202L ；SP722+D183*+G184*+N195F+M202L ；BSG+1181*+G182* ； BSG+I181*+G182*+N193F ；BSG+1181*+G182*+M200L ；BSG+I181*+G182*+N193F+M200L ； AA560+D183*+G184* ；AA560+D183*+G184*+N195F ；AA560+D183*+G184*+M202L ；禾P AA560+D183*+G184*+N195F+M202L。
10.权利要求1-9中任一项所述的变体，其中亲本Termamyl样a-淀粉酶由核酸序列 编码，该核酸序列与SEQ ID NO :7的核酸序列可在低严谨度条件下、中度严谨度条件下或高 严谨度条件下杂交。
11.权利要求1-10中任一项所述的变体，其中变体在70-120°C高温和/或pH4-6的 低PH条件下具有改变的稳定性。
12.—种DNA构建体，包含编码权利要求1-11中任一项所述的a -淀粉酶变体的DNA 序列。
13.一种重组表达载体，其携带权利要求12的DNA构建体。
14.一种由权利要求12的DNA构建体或权利要求13的载体转化的细胞。
15.权利要求14的细胞，其是微生物。
16.权利要求15的细胞，其是细菌或真菌。
17.权利要求16的细胞，其是革兰氏阳性细菌。
18.权利要求17的细胞，所述革兰氏阳性细菌是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽 孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、 环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌。
19.一种组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的a-淀粉酶变体。
20.权利要求19的组合物，其中所述a-淀粉酶是SP961。
21.权利要求19-20中任一项所述的组合物，其中组合物进一步包括葡糖淀粉酶、支链 淀粉酶和/或植酸酶。
22.一种洗涤剂组合物，包含权利要求1-11中任一项所述的a-淀粉酶变体。
23.权利要求22的洗涤剂组合物，还包含另一种酶。
24.权利要求23的洗涤剂组合物，其中所述另一种酶是脂酶、过氧化物酶、另一种淀粉 分解酶、葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、环糊精糖基转移酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、和/或 纤维素酶。
25.权利要求1-11中任一项所述a-淀粉酶变体或权利要求19-24中任一项所述的组 合物在淀粉液化中的用途。
26.权利要求1-11中任一项所述a-淀粉酶变体或权利要求19-24中任一项所述组合 物在乙醇生产中的用途。
27.权利要求1-11中任一项所述a-淀粉酶变体或权利要求19-24中任一项所述组合 物在清洗和/或餐具清洗中的用途。
28.权利要求1-11中任一项所述a-淀粉酶变体或权利要求19-24中任一项所述组合 物在纺织品退浆中的用途。
全文摘要
本发明涉及具有改变特性的α-淀粉酶突变体，具体地涉及亲本Termamyl样α-淀粉酶的变体(突变体)，其中相对于亲本α-淀粉酶该变体具有α-淀粉酶的活性并且显示改变的稳定性，尤其是在高温和/或低pH条件，和/或低Ca2+浓度下。
文档编号C12N9/28GK101857858SQ20101014564
公开日2010年10月13日 申请日期2001年7月12日 优先权日2000年8月1日
发明者克劳斯·C·富格尔桑, 卡斯滕·安德森, 托马斯·西斯特德, 索伦·杰鲁尔夫 申请人:诺维信公司