专利名称：一种植物抗旱、耐盐相关蛋白ErNAC7及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白 ErNAC7及其编码基因和应用。
背景技术：
小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，在 我国干旱地区的耕地面积约为5. 7亿亩，盐碱地约为5. 54亿亩，每年因干旱、盐碱等逆境我 国对小麦造成的减产达700-800亿公斤，严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦 粮食生产的快速发展。随着现代分子生物学的发展，利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非 生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，为培育作 物抗逆新种质提供了理论基础。目前，通过基因工程技术已将许多抗旱、耐盐、耐低温相关 的基因导入到植物中，提高植物的抗逆性已有相关研究报道。近年来，通过转录因子的结构与功能分析来鉴定、阐明各种条件下基因表达调控 的机理得到了广泛关注。NAC转录因子是近年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转 录因子。1996年Aida等首先发现在矮牵牛NAM基因，拟南芥ATAF1/2和CUC2基因编码的蛋 白N端包含一个保守的氨基酸序列，约包含150个氨基酸残基，C端为高度变异的转录调控 区，CUC2基因的功能类似于NAM基因，与植物的发育相关；ATAF1/2基因与植物逆境应答相 关，取三基因首字母名为NAC (Aida et al.，1997)。NAC转录因子可与MYC-Iike元件结合， 该元件的核心序列(CATGTG)在拟南芥ERDl干旱诱导反应应答过程中起重要作用(Olsen et al.，2005)。作为一种重要的调控因子，NAC转录因子参与调节植物的生长发育、多种防 御反应、激素信号转导等各种重要的生理活动。此外，NAC类转录因子也受多种生物胁迫和 非生物胁迫的诱导表达，参与植物的逆境胁迫应答反应。目前，已从拟南芥、水稻、油菜、番 茄、玉米、花生等植物中分离鉴定了许多与抗逆相关的NAC类转录因子基因。拟南芥的3个不同的NAC基因(ANAC019、ANAC055和ANAC072)表达受干旱、高盐 和ABA的诱导，超量表达能显著增强转基因植株的耐旱能力。Tadashi等在水稻中鉴定了一 个抗旱、耐盐基因SNACl，干旱胁迫可诱导水稻气孔保卫细胞SNACl基因特异表达，促进气 孔关闭，但是并不影响光合速率，因而植株抗旱性大为提高，且过量表达SNACl基因的水稻 植株耐盐性明显增强(Tadashi et al，2008)。此后，在水稻IRAT109中分离到一个NAC基 因SNAC2，Northern-blot启动子活性分析证实SNAC2受干旱、高盐、低温、机械损伤、ABA诱 导表达，野生型与SNAC2过表达转基因植株同在4-8°C下低温处理5天后，野生型全部死亡， 转基因植株有50%的存活率，且转基因植株对ABA的敏感性也显著增强。Zhong等(Zhong et al,2007)从水稻中分离到一个0sNAC6，该基因受低温、干旱、高盐、稻瘟病诱导表达，利 用生物芯片方法分析过量表达0sNAC6基因可上调多个胁迫相关基因的表达如过氧化物酶 基因。过量表达0sNAC6转基因植株中抗旱和耐高盐能力得到了提高，抗稻瘟病能力增强， 但植株矮化和低产，通过诱导型启动子驱动下，可以有效减少植株发育负面效应，0sNAC6可
3以作为一种提高植物抗多种胁迫能力有效的工具。目前还未有NAC基因在小麦中研究的相 关报道。综上所述，NAC类转录因子在调节植物的逆境反应，提高植物的抗逆性中起着至关 重要的作用。过量表达NAC转录因子基因提高了植物的抗逆能力，转基因植株发育不产生 任何负面作用，这对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益。因此，利用抗逆 相关的NAC类转录因子基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要理论和实践意义。偃麦草属(Elytrigia)系禾本科小麦族(Triticeae)优良多年生根茎疏丛型草本 植物，具有十分重要的利用价值。其中，新疆偃麦草(E. repens)具有强抗旱、耐盐碱和抗寒 性、具长而发达的根茎，适应能力极强，是改良干旱、盐碱地的理想植物(谷安琳，2004)。同 时，新疆偃麦草属植物也是小麦(Triticum aestivum)的近缘种，具有相似的代谢途径，目 前已成为改良小麦重要的野生基因库(王洪刚，2000;吕伟东，2007)。目前，通过远缘杂交 技术、花粉管通道法将新疆偃麦草中抗旱、耐盐基因资源转入小麦等作物中，改良农作物的 抗逆性取得了一定效果。然而，通过基因工程手段，从新疆偃麦草中克隆抗旱、耐盐基因并 构建植物表达载体转化小麦等粮食作物的研究目前尚未见到相关报道。因此，利用强抗旱、 耐盐碱等特性的偃麦草属植物种质资源，挖掘、筛选出优良的抗旱、耐盐相关基因改良小麦 的抗逆性，为培育小麦等粮食作物抗旱、耐盐新品种提供重要的抗逆基因资源，对盐渍化土 地的治理与改良等方面均具有重要实际意义
发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗旱、耐盐相关蛋白ErNAC7。本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐相关蛋ErNAC7的编码基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的提供上述植物抗旱、耐盐相关蛋白ErNAC7及其基因的应用。本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白ErNAC7，来源于新疆偃麦草(其直接来源为 北京草业与环境研究发展中心，其原始来源植物的自然生长地或采集地一中国新疆)， 其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明的转录因子由298个氨基酸残基组成，是NAC类 转录因子。自SEQ ID NO. 1的氨基末端第10-133位氨基酸残基是保守的NAC结构，自SEQ ID NO. 1的氨基末端第142-145位氨基酸残基为核定位序列。SEQID NO. 1
1MSGGQELNLPPGFRFHPTDE
21ELVMHYLCRRCAGAPIAVPI
41ITEIDLYKFDPffQLPKMALY
61GEKEffYFFSPRDRKYPNGSR
81PNRAAGSGYffKATGADKPVG
101TPKPLAIKKALVFYAGKAPK
121GEKTNWIMHEYRLADVDRSA
141RKKNSLRLDDWVLCRIYNKK
161GGMEKPASVDRKPATVGGYG
181GPPGAMVSSPQEQKPVMGMN
201 ANGGGGVQPF PDFAAYYDRP221 SDSMPRLHAD SSCSEQVLSP241 DFPAGEVQSQ PKISEffERSF261 ASG⑶PVNPA AGSMLEPNGG281 FGGDPLLQDI LMYWGKPF*为了使蛋白ErNAC7便于纯化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白 质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2_10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-my c10EQKLISEEDL根据本发明所公开的SEQ ID NO. 1序列，本发明的转录因子ErNAC7可人工合成， 也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。根据本发明的ErNAC7编码基因具有如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列。ErNAC7的 表达受干旱、盐胁迫的诱导。SEQID NO. 2
1ATGAGCGGCGGACAGGAGCTGAATCTGCCGCCGGGCTTCCGGTTCCACCCGACGGACGAG
61GAGCTGGTGATGCACTACCTCTGCCGCCGCTGCGCCGGCGCGCCCATCGCCGTCCCCATC
121ATCACCGAGATCGACCTCTACAAGTTCGACCCCTGGCAGCTCCCAAAGATGGCGCTGTAC
181GGCGAGAAGGAGTGGTACTTCTTCTCCCCGCGGGACCGCAAGTACCCCAACGGGTCCAGG
241CCCAACCGGGCCGCCGGGTCCGGGTACTGGAAGGCCACCGGGGCCGACAAGCCCGTGGGC
301ACCCCCAAGCCGCTGGCCATCAAGAAGGCGCTCGTCTTCTACGCCGGCAAGGCCCCCAAG
361GGCGAGAAGACCAACTGGATCATGCACGAGTACCGCCTCGCCGACGTCGACCGCTCCGCC
421CGCAAGAAGAACAGCCTCAGGTTGGATGATTGGGTGCTGTGCCGCATCTACAACAAGAAG
481GGCGGCATGGAGAAGCCGGCGTCCGTGGACCGGAAGCCGGCGACAGTGGGCGGCTACGGG
541GGTCCTCCTGGGGCCATGGTGAGCTCCCCGCAGGAGCAGAAGCCCGTCATGGGGATGAAC
601GCCAACGGCGGCGGCGGCGTGCAGCCGTTCCCGGACTTCGCGGCGTACTACGACCGGCCG
661TCCGACTCGATGCCGCGGCTGCACGCCGACTCGAGCTGCTCGGAGCAGGTGCTGTCGCCG
721GACTTCCCGGCCGGGGAGGTGCAGAGCCAGCCCAAGATCAGCGAGTGGGAGCGCTCATTC
781 GCCTCCGGCG GCGACCCCGT GAACCCGGCG GCTGGCTCCATGCTCGAGCC CAACGGCGGG841 TTCGGCGGCG ACCCGCTCCT CCAGGACATC CTCATGTACTGGGGCAAGCC GTTCTGA含有ErNAC7基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明 的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有ErNAC7基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录 的非翻译区均具有类似功能。使用ErNAC7构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构 建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以 是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整 个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是 抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有ErNAC7基因的重组 表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的NAC转 录因子ErNAC7的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增 强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质 粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物 细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也 可以是双子叶植物，如烟草、小麦、新疆偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪 草、苜宿等。所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对或盐胁迫的耐逆性。本发明以抗旱、耐盐性较强的新疆偃麦草(Elytrigia repens L.)为实验材料，得 到了抗逆相关的 NAC 转录因子 ErNAC7 (Elytrigia repens NAM-ATAF1/2-CUC27)蛋白及其 编码基因，并将ErNAC7基因导入烟草，显著提高了植物的抗旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐 盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强烟草抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以 及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。
图1为抗旱、耐盐相关蛋白ErNAC7编码基因的cDNA克隆，以新疆偃麦草cDNA为 模板，PCR扩增含有NAC保守域的cDNA片段，1,2 新疆偃麦草片段；M :DL2000marker (100， 250，500，750，1000，2000bp)。图2为荧光定量PCR分析ErNAC7在干旱、盐胁迫处理下的表达特征，Α.干旱胁迫 处理下的表达特征；B.盐胁迫处理下的表达特征。图3为烟草农杆菌侵染、分化筛选培养、植株再生及PCR检测。Α.烟草经农杆菌侵 染后的筛选、分化培养；B.经筛选、分化后获得的再生植株生根培养；C. pBI35S-ErNAC7转 基因烟草植株的PCR检测。图4为转基因烟草耐旱性、耐盐鉴定。A. pBI35S-ErNAC7转基因烟草和W38在含有 200mM NaCl培养基上的生长情况；B. pBI35S_ErNAC7转基因烟草和W38在含有2% PEG培 养基的生长情况。
具体实施例方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例1 新疆偃麦草抗旱、耐盐相关ErNAC7基因的cDNA克隆。对生长45天左右的新疆偃麦草幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取新疆 偃麦草总 RNA。应用 5，RACE 试剂盒(5，RACE System for Rapid Amplification of cDNA EndsKit) (GIBCOBRL, CAT. NO. 18374-058)和 3，RACE 试剂盒(3，RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit) (GIBCOBRL, CAT. NO. 18373-019)获得 ErNAC7 基 因的全长序列894bp。用Trizol提取新疆偃麦草幼苗的总RNA，用superscript II (invitrogen)反转录 酶反转录获得到cDNA。根据ErNAC7基因编码区序列设计引物Pl和P2。以反转录得到的 cDNA为模板，用引物Pl和P2进行PCR扩增。引物Pl和P2的序列如下P1 5 ’ -ATGAGCGGCGGACAGGAGCT-3’，
P2 5 ’ -GAGATTGAACGGCTTGCCCCAGT-3’。对PCR产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为0. 8_lkb左右的条 带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与 pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69 :2110)，将连接 产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛 选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列 为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的ErNAC7基因的开放阅读框(ORF) 为SEQ ID No. 2的自5，末端第1至894位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No. 1 的蛋白质。将含序列SEQ ID No. 2所示ErNAC7基因的重组载体命名为pTE-ErNAC7，其cDNA 克隆结果如图1所示。ErNAC7基因的序列在Genabnk上进行比对，该基因与拟南芥中NAC类转录因子 具有较高同源性，而在新疆偃麦草中未发现同源蛋白基因，证明ErNAC7基因是一个新的基因。实施例2 逆境胁迫处理下新疆偃麦草ErNAC7基因的表达特征将新疆偃麦草种子种在盆中，生长3周后取幼苗进行如下胁迫处理1)干旱处理 将新疆偃麦草幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上；2)盐处理将新疆偃 麦草幼苗置于200mM NaCl溶液中；分别在上述各种处理后0、1、2、5、10、24小时取样，用液 氮速冻，-80°C保存备用。分别将干旱处理、盐处理后0、1、2、5、10、24小时的样品提取总RNA，以ErNAC7DNA 为探针，进行荧光定量分析。荧光定量分析结果见图2。A为干旱处理的样本；B为NaCl处理的样本。结果表明在干旱胁迫10小时ErNAC7基因表达达到高峰；在高盐(200mMNaCl)胁 迫1小时ErNAC7基因表达达到高峰，说明该基因受干旱、高盐胁迫诱导表达。实施例3 用ErNAC7基因增强植物的抗旱、耐盐性1、重组表达载体的构建1) 35S-ErNAC7重组表达载体的构建以新疆偃麦草的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和XbaI接头序 列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和XbaI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向 插入载体pBI121的CaMV 35S启动子之后的SmaI和XbaI酶切位点之间，得到重组载体 35S-ErNAC70引物序列如下ErNAC7 [SmaI] 5' -GCGCCCGGGATGAGCGGCGGACAGGAGCT-3’ErNAC7 [XbaI] 5 ’ -TGCTCTAGAGAGATTGAACGGCTTGCCCCAGT-3 ’2、转基因烟草的获得和鉴定1)转基因烟草的获得将上述构建的重组表达载体35S_ErNAC7分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105， 再用叶盘法分别将整合有35S-ErNAC7的根癌农杆菌EHA105转化烟草W38，用含100mg/L卡 那霉素的MS培养基进行2轮筛选，每轮筛选10-15天，得到阳性转基因植株(图3)。将筛 选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。P3 (上游引物)5，-GGCGCTGTACGGCGAGAAGGA-3，，P4 (下游引物)5，-CGCCGTTGGCGTTCATCCC-3，。对35S-ErNAC7转基因烟草进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得1Kb 左右条带，结果获得转35S-ErNAC7烟草40株。同时将pBI121空载体导入烟草W38，方法同上，作为对照，获得10个株系的转空载 体烟草(筛选获得的转基因烟草用Ttl代表示)。2)转ErNAC7基因植株耐旱、耐盐性鉴定将Ttl代转35S_ErNAC7基因烟草植株及Ttl代转空载体对照植株的3周龄苗的根系 分别移入含有200mM NaCl,2% PEG的培养基中进行盐、干旱胁迫处理35天，观察表型并拍 照。结果表明胁迫处理35天后，35S_ErNAC7转基因植株在干旱、盐胁迫条件下能够 正常生长，根系发达、叶片颜色深绿；所有空载体转基因植株叶片均萎蔫或失绿、发白而导
8致死亡。转基因烟草耐旱、耐盐性鉴定结果证明ErNAC7基因可以提高植物的耐旱及耐盐 性。 图4为转基因烟草耐旱、耐盐性鉴定，如图4A显示35S_ErNAC7转基因植株、空载 体转基因植株200mM NaCl培养基生长35天的照片；图4B为pBI35S_ErNAC7转基因烟草和 W38在含有2% PEG培养基上的生长35天的照片情况。
权利要求
一种植物抗旱、耐盐相关蛋白ErNAC7，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种植物抗旱、耐盐相关基因ErNAC7，其特征在于，编码权利要求1所述的植物抗 旱、耐盐相关蛋白ErNAC7。
3.如权利要求2所述的植物抗旱、耐盐相关基因ErNAC7，其特征在于，其碱基序列如 SEQ ID NO. 2。
4.包含权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因ErNAC7的重组载体。
5.权利要求1所述植物抗旱、耐盐相关蛋白ErNAC7的应用。
6.权利要求2所述植物抗旱、耐盐相关基因ErNAC7的应用。
7.一种培育耐逆植物的方法，所述方法包括将含有ErNAC7基因的重组表达载体导入 植物细胞中、得到耐逆植物的步骤。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白ErNAC7及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强烟草抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。
文档编号C12N15/63GK101906155SQ20101014571
公开日2010年12月8日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者唐益苗, 杨颖 , 赵昌平, 高世庆 申请人:北京市农林科学院