专利名称：一种甲型h1n1病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种甲型Hmi病毒的恒温扩增检 测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
甲型Hmi流感于2009年爆发时，最初世界卫生组织使用了“猪流感”(swine flu) 的名称。现在，WHO已开始使用“甲(HlNl)型流感”代替“猪流感”来指代当前疫情，我国卫 生部公告中则将这一疾病称为“甲型Hmi流感”。甲型Hmi流感病毒是A型流感病毒，携 带有Hmi亚型猪流感病毒毒株，包含有禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的核糖核酸 基因片断，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。甲型Hmi的临床表现为潜伏期一般1至7天左右，较流感、禽流感潜伏期长。其 早期症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还 会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、突然 高热、体温超过39°C，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细 胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及Reye综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡。若患 者原有的基础疾病亦可加重。面对甲型Hmi流感，保护自己和他人在预防方面，没有必要扎堆去接种人流感疫苗， 因为预防季节性流感疫苗对预防甲型Hmi流感并无效果。正确的做法是养成良好的个人卫生 习惯，充足睡眠、勤于锻炼、减少压力、足够营养；勤洗手，尤其是接触过公共物品后要先洗手再 触摸自己的眼睛、鼻子和嘴巴；打喷嚏和咳嗽的时候应该用纸巾捂住口鼻；室内保持通风等。卫生部2009年4月30日印发的《人感染猪流感诊疗方案(2009版)》中 指出，人感染猪流感的诊断主要结合流行病学史、临床表现和病原学检查等，临床上 早发现、早诊断是治疗的关键。近年来的发展起来针对甲型Hmi病毒的荧光定量 PCR(FluorescenceQuantitative PCR, FQ-PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优 点在甲型Hmi病毒的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前甲型Hmi检测的主要方法， 目前国内市场上已经有了关于甲型Hmi核酸定量检测试剂盒。FQ-PCR虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器，且容易造 成假阳性等问题。交叉引物扩增法是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区 域设计6种(三对)特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件 即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、多次温度循环等过程，此交叉引物恒温扩增 靶核苷酸序列的方法及其应用本申请人之前已申请专利(申请号=200810134583. 1)。在此 方法的基础上制备了本发明的甲型Hmi病毒的恒温扩增检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种甲型Hmi病毒的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒特异性好，灵敏度高，步骤简单，反应速度快。本发明所提供的甲型Hmi病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒，包括下列组成 (1) RNA提取液RNA提取试剂盒；(2)恒温扩增反应液包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、 IX ThermoIbuffer、MgSO4、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中所述的外围引物分别为正向外围引物序列为5，-AATAACATTCGAAGCAACTGG-3，(SEQ ID N01)；反向外围引物序列为5，-AAATAGGCCTCTAGATTGAAT-3，(SEQ ID N02)；所述的两条探针的序列分别为正向5，端 Biotin 标记探针 5，-biotin-ATAATACCAGATCCAGCATT-3，(SEQ IDN03)；反向3，端异硫氰酸荧光素 FitC 标记探针 5，-AAAAGCACAAAATTGAGAC-FitC-3，(SE Q ID N04)；所述的扩增交叉引物分别为扩增反向引物5， -GATATGCATTCGCAATGGAATTCCTCAATCCTGTDGCCA-3， (SEQ IDN05)；扩增正向引物5， -TTCCTCAATCCTGTDGCCAGATATGCATTCGCAATGGAA-3， (SEQ IDN06)；(3)阳性对照模板为含有甲型Hmi病毒HA基因片段的转录产物。(4)阴性对照无菌双蒸水。恒温扩增反应液中所述的IXThermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、 IOmM 的KCl、10mM 的(NH4) 2S04、2mM 的MgSO4 以及质量浓度为 0. 的 Triton X_100，pH 8.8。本发明试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特 性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。本发明提供的甲型Hmi病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件 进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试 纸条检测系统相结合，建立了甲型Hmi病毒核酸恒温扩增定性检测的方法。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种应用本发明试剂盒的甲型Hmi病毒 核酸恒温扩增定性检测方法，包括如下步骤(1)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA ；(2)将步骤⑴提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中， 在60°C下扩增反应90分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板；(3)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置(申请号200610109620. 4)中 进行检测，15分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有甲型Hmi
病毒核酸。本发明的试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测 甲型Hmi病毒的要求。本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复 性。对样本的检测仅仅需要2个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要 1个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。 故本发明与现有技术相比，具有以下有益效果1.特异性好，灵敏度高步骤简单，可重复性高；2.反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；3.整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；4.可同时满足高通量和低通量的样品检测；5.整个反应过程不需要复杂的仪器。
图1实施例3的检测甲型Hmi病毒核酸的特异性；图中从左至右依次为甲型H3N2、甲型H5W、甲型H9N7、甲型Hmi流感、季节性流 感B、禽流感H5m、人季节性流感Hmi ；图2实施例4的检测甲型Hmi病毒核酸的灵敏度；图中从左至右分别表示IO4拷贝/微升、IO3拷贝/微升、IO2拷贝/微升、10拷贝 /微升、阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1试剂盒的组成与配制a) RNA提取试剂RNA提取试剂盒b)反应液两条外围引物(0.05μπιΟ1)，两条探针(0. δμπιο )，和两条交叉引物 (0. 5 μ mol)，1 X Thermol buffer, MgSO4 (6mmol)，dNTPs 溶液(0. 4mmol)，Bst DNA 聚合酶 (IOU)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为16 μ 1。其中外围引物分别为正向外围引物序列为5，-AATAACATTCGAAGCAACTGG-3，(SEQ ID Ν01)；反向外围引物序列为5，-AAATAGGCCTCTAGATTGAAT-3，(SEQ ID Ν02)；两条探针的序列分别为正向5，端 Biotin 标记探针 5，-biotin-ATAATACCAGATCCAGCATT-3，(SEQ IDN03)；反向3，端异硫氰酸荧光素 FitC 标记探针 5，-AAAAGCACAAAATTGAGAC-FitC-3，(SE Q ID N04)；扩增交叉引物分别为扩增反向引物5， -GATATGCATTCGCAATGGAATTCCTCAATCCTGTDGCCA-3，， (SEQ IDN05)；扩增正向引物5， -TTCCTCAATCCTGTDGCCAGATATGCATTCGCAATGGAA-3，， (SEQ IDN06)；
IXThermol buffer 的组成20mM Tris-HCl (pH 8. 8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4,0. 1% Triton X-IOO0所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。
c)阳性对照含有甲型 HlNl HA 基因[NCBI gene bank number CY058832. 1 (768-1041)]的RNA片段。阳性对照为含有长274bp的甲型Hmi病毒HA基因 序列，序列如下AATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAA TGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCAAGGGTGCTA TAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAA TTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTT, (SEQ ID N07)；阳性对照的制备步骤利用一条外围引物和带有T7启动子的另一条外围引物以 甲型Hmi病毒的基因组RNA模板进行RT-PCR扩增获得目的基因；用Promega的PCR纯化 试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过Promega的RiboMAX Large ScaleRNA Production Systems转录出目的的RNA片段。用分光光度计测A28tl定量并稀释 至IO6拷贝/ μ 1，_20°C保存。d)阴性对照无菌双蒸水。实施例2用本发明试剂盒检测甲型Hmi病毒核酸的具体方法a)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA。b)取标本RNA作为模板加入到装有反应液的PCR管中，在60°C进行扩增反应90 分钟，其中标本RNA 4μ 1，反应液16μ 1 ；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照 模板。c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结 果。当样本中含有甲型Hmi病毒核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测 结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性 好，且对样本的检测仅仅需要2个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要 1个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的 浪费。实施例3用本发明试剂盒检测甲型Hmi病毒的专一性按照实施例2的方法检测甲型Η3Ν2、甲型H5W、甲型Η9Ν7、甲型Hmi流感、季节性 流感B、禽流感H5m、人季节性流感Hmi。其结果如表1，见图1。表1甲型Hmi病毒的专一性检测结果
~ 注‘‘ _ ”表示阴性，‘‘ + ”表示阳性从表1测试结果可见，用本发明试剂盒检测甲型Hmi病毒核酸具有很强的专一 性。实施例4用本发明试剂盒检测甲型Hmi病毒核酸的灵敏度提取培养的甲型Hmi病毒病毒的RNA，对其进行定量，分别稀释至浓度为IO4拷贝 /微升、IO3拷贝/微升、IO2拷贝/微升、IO1拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定 本发明试剂盒用于检测甲型Hmi病毒核酸的灵敏度。结果如图2所示，可以发现该试剂盒 可在每个反应体系中检出10个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测甲型Hmi病毒 的要求。
权利要求
一种甲型H1N1病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于包括下列组成(1)RNA提取液RNA提取试剂盒；(2)恒温扩增反应液包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO4、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中所述的外围引物分别为包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO4、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中所述的外围引物分别为正向外围引物序列为5’-AATAACATTCGAAGCAACTGG -3’，SEQ ID NO1；反向外围引物序列为5’-AAATAGGCCTCTAGATTGAAT -3’，SEQ ID NO2；所述的两条探针的序列分别为正向5’端Biotin标记探针5’-biotin- ATAATACCAGATCCAGCATT -3’，SEQ IDNO3；反向3’端异硫氰酸荧光素FitC标记探针5’-AAAAGCACAAAATTGAGAC-FitC-3’，SEQ ID NO4所述的扩增交叉引物分别为扩增反向引物5’-GATATGCATTCGCAATGGAATTCCTCAATCCTGTDGCCA-3’，SEQ ID NO5；扩增正向引物5’-TTCCTCAATCCTGTDGCCAGATATGCATTCGCAATGGAA-3’，SEQ ID NO6；(3)阳性对照模板为含有甲型H1N1病毒HA基因片段的转录产物；(4)阴性对照无菌双蒸水。
2.根据权利要求1所述的甲型Him病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述 的恒温扩增反应液中lXThermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KC1、 10mM 的(NH4)2S04、2mM 的 MgS04 以及质量浓度为 0. 的 Triton X-100，pH 8. 8。
3.根据权利要求1所述的甲型Him病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述的 阳性对照为含有长274bp的甲型Hmi病毒HA基因序列，序列如下AATAACATTCGAAGCAACT GGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACC AGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATC CGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCG TCTATTCAATCTAGAGGCCTATTT, SEQ ID N07。
4.根据权利要求1所述的甲型Hmi病毒的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述的 阳性对照通过下列步骤制备利用一条外围引物和带有T7启动子的另一条外围引物以甲型Hmi病毒的基因组 RNA模板进行RT-PCR扩增获得目的基因；用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将 纯化后的扩增产物转录出目的的RNA片段，用分光光度计测k280定量并稀释至106拷贝/ u 1，-20°C保存。
5.一种应用权利要求1试剂盒的甲型Hmi病毒恒温扩增定性检测方法，包括如下步骤(1)用RNA提取试剂盒从待检测的标本中提取RNA；(2)将步骤(1)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60°C下扩增反应90分钟；对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板；(3)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果， 当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有甲型Hmi病毒核酸。
6.根据权利要求5所述的甲型Him病毒的恒温扩增检测方法，其特征在于所述的反 应液中两条外围引物为0. 05 i! mol，两条探针为0. 5 i! mol，两条交叉引物为0. 5 y mol，MgS04 为 6mmol, dNTPs 溶液为 0. 4mmol, Bst DNA 聚合酶为 10U。
7.根据权利要求6所述的甲型Him病毒的恒温扩增检测方法，其特征在于标本RNA 4u 1，总反应液16ii 1。
全文摘要
本发明涉及一种甲型H1N1病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。本发明试剂盒包含RNA提取液、甲型H1N1病毒核酸恒温扩增反应液、甲型H1N1病毒阳性对照、阴性对照。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需2小时；可同时满足高通量和低通量的样品检测，且整个反应过程不需要复杂的仪器。
文档编号C12Q1/70GK101864494SQ20101014571
公开日2010年10月20日 申请日期2010年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者叶魏, 周娴, 孟成艳, 尤其敏, 尤见, 张宏, 张晓航, 张琳, 徐高连, 李克胜, 王健, 王宏莹, 简大钊, 阎俊, 陆晔 申请人:上海国际旅行卫生保健中心;杭州优思达生物技术有限公司