专利名称：一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测 试剂盒及其检测方法。
背景技术：
沙门氏菌，属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。沙门氏菌病是公共卫生病学上具有 重要意义的人畜共患病之一，是主要的肠道致病菌之一，易引起食物中毒，人畜感染后可呈 无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动 物的繁殖生产力。在我国，以沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位。沙门氏 菌通常是通过摄取受到动物粪便污染的食物进入人的体内。而一般容易受污染的食品主要 是动物性食品，如牛肉、禽肉、牛奶、鸡蛋及其制品等，食品也可能被已感染沙门氏菌的食品 加工人员污染。受到沙门氏菌污染的食物在外形与味觉上与正常食物没什么两样，因此准 确、快速地检测食品中的沙门氏菌具有十分重要的意义。志贺氏菌属也是一类革兰氏阴性菌，形态与其它肠杆菌科的种类似，是人类细菌 性痢疾最为常见的病原菌。人类对痢疾杆菌有很高的易感性在幼儿可引起急性中毒性菌痢 死亡率甚高。据国内综合资料志贺氏菌属在我国感染性腹泻病原菌中居首位志贺氏菌既可 通过水也可通过食品传播腹泻及痢疾等疾病。据报道国际上每年都有由志贺氏菌引起的疾 病的暴发与流行根据WHO年度报告亚(不包括中国)非拉各洲仅小于5岁的儿童每人每年 发生腹泻2. 2次细菌性腹泻的病例多达1. 5到2. 5亿人，我国广大农村地区由于卫生条件 差，经常有由于水源或食品受到志贺氏菌污染而引起痢疾腹泻等疾病流行的报道。因此，快 速检测与鉴定水或食品中志贺氏菌不仅为及时有效地预防治疗和控制水或食源性传染病 提供依据，同时也是保障人民身体健康的必要手段。传统沙门氏菌，志贺氏菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁 多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原 核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门 的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反 应(realtime PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需 要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反 应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便 成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检 测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提 高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病 原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)具有很多的优越性。因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的沙门氏菌的检测试剂盒及 志贺氏菌的检测试剂盒及其使用方法以解决上述问题。
基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简 称LAMP)快速检测沙门氏菌与志贺氏菌的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列 设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的 六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补 序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎_环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即 可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C )条件下45 90分钟内完成。 这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检 测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求 较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选 体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技 术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围 等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通 量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养 和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定 需2 3天，完 成鉴定报告需10 15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系 中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。一般的食源性致病菌的检测都包括沙门氏菌，志贺氏菌等菌株的检测。而本发明 可同时检测沙门氏菌、志贺氏菌，从而更节省检测时间与成本。更适用于食品从业人员体检 中沙门氏菌，志贺氏菌的快速检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是克服现有技术中耗时长，漏检率高的不足提供 检测效果更全面、特异性高、漏检率低的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒。搜集GeneBank已公布沙门氏菌AgfA基因与志贺氏菌的ipaH基因序列。通过用 GeneTool软件进行比对，并在GeneBank上BLAST证明与其它菌高度特异。本发明所提供的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒包括下列组成以沙门氏菌 AgfA基因，志贺氏菌的ipaH基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物 内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，Bst DNA聚合酶，缓冲液，dNTPs，甜菜碱，硫酸镁，显色液， 稳定液和阳性对照。所述的沙门氏菌，志贺氏菌的两对内外引物分别为沙门氏菌属AgfA-9-F3 :AGTTTCTGGCAGTGCTGTG (SEQ ID NO 1)AgfA-9-B3 :AGTACTGTTATCCGCACCCT (SEQ ID NO 2)AgfA-9-FIP :ATCCGGGCCGGAACTATTGCTTTTCTGGCGTCGTTCCACAAT (SEQ ID NO 3)AgfA-9-BIP :CGCTTGCTCTGCAAAGCGATGTTTTACCATAACCGCTCTGGGT(SEQ ID NO 4)或AgfA-56-F3 CCCGGATTCCACGTTGAG (SEQ ID NO 5)AgfA-56-B3 :TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA(SEQ ID NO 6)
AgfA-56-FIP :CCGCTCTGGGTAATGGTCGTTTTTTCTAACGCTGCGCTTGCTC (SEQ ID NO 7)AgfA-56-BIP :ATGTAGGCCAGGGTGCGGATATTTTTGGTCGATGGTGGCATTG(SEQ ID NO 8)或AgfA-19-F3 :AGTTTCTGGCAG TGCTGTG(SEQ ID NO 9)AgfA-19-B3 :AGTACTGTTATCCGCACCCT (SEQ ID NO 10)AgfA-19-FIP :ATCCGGGCCGGAACTATTGC CTGGCGTCGTTCCACAAT(SEQ ID NO 11)AgfA-19-BIP CGCTTGCTCTGCAAAGCGATG ACCATAACCGCTCTGGGT(SEQ ID NO 12)或AgfA-156-F3 CCCGGATTCCACGTTGAG (SEQ ID NO 13)AgfA-156-B3 :TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA (SEQ ID NO 14)AgfA-156-FIP :CCGCTCTGGGTAATGGTCGT TCTAACGCTGCGCTTGCTC(SEQ ID NO 15)AgfA-156-BIP :ATGTAGGCCAGGGTGCGGATAT GGTCGATGGTGGCATTG(SEQID NO 16)志贺氏菌属ipaH-69-F3 :ACATGAAGAGCAYGCCAACA 其中 Y 代表 C 或 T (SEQ ID NO 17)ipaH-69-B3 :TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 18)ipaH-69-FIP :CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA(SEQ ID NO 19)ipaH-69-BIP :GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT (SEQ ID NO 20)或ipaH-169-F3 :ACATGAAGAGCAYGCCAACA 其中 Y 代表 C 或 T (SEQ ID NO 21)ipaH-169-B3 :TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 22)i paH-169-FIP CGGAATCCGGAGGTATTGCGTG CCTTTTCCGCGTTCCTTGA (SEQ ID NO 23)ipaH-169-BIP GGTCGCTGCATGGCTGGAAA GCAGCAACAGCGAAAGACT(SEQ ID NO 24)所述的Bst DNA聚合酶酶浓度7-10U/ μ L，优选为酶浓度8U/ μ L。所述的缓冲液含0·18-0. 25mol/L Tris-HCl，0· 10-0. 15mol/L KCl， 0. 07-0.15mol/L (NH4)2SO4,15-30mmol/L MgSO4,1-2 % TritonX-IOO ；优选为 0. 2mol/L Tris-HCl,0. lmol/L KC1，0. Imo 1/L(NH4)2S04, 20mmol/L MgSO4,1% TritonX-100。所述的dNTPs 每种核苷酸浓度10-20mmol/L，优选每种核苷酸浓度lOmmol/L。所述的甜菜碱浓度3-6mol/L，优选浓度5mol/L。所述的硫酸镁浓度100-200mmol/L，优选浓度150mmol/L所述的显色液为SYBR Green I 或 Eva Green ；所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为沙门氏菌，志贺氏菌基因组DNA。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测方法， 包括如下步骤(1)将待测样品增菌，得到样品增菌液；(2)将样品增菌液提取样品模板DNA ；(3)在反应容器中加入本发明联合检测试剂盒中的Bst DNA聚合酶1. 8 2. 4体 积份数、缓冲液10体积份数、dNTPs 15 20体积分数、甜菜碱15 20体积分数、硫酸镁15 20体积分数、稳定液25 35体积份数、样品模板DNA 10体积份数、内引物FIP/BIP 各2体积份数、外引物F3/B3各4体积分数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相 同则为阳性，否则为阴性；步骤(3)中所述的恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的检测试剂盒只需一个恒 定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试 剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高 特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高； 4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断 试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物—— 焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证 率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的沙门氏菌AgfA基因与志贺氏菌的ipaH基 因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测沙门氏菌与志贺氏菌的准确率更 闻；
图1实施例4采用本发明方法进行特异性试验结果；图中1为阳性对照；2为阴性对照；3为ATCC29004 ；4为V405 ；5为EC102 ； 6 为 CMCC54002 ；7 为 ATCC13048 ；8 为 ATCC1307 ；9 为 ATCC13182 ；10 为 ATCC12022 ；11 为 CMCC51334 ；12 为 CMCC51263(2) ；13 为 CMCC(B)50071 ；14 为 S334 ；15 为 S217 ；16 为 CMCC51376(2)；图2实施例4沙门氏菌不同稀释浓度LAMP检测结果；图中1为阴性对照；2为阳性对照；3-12分别为IO910°稀释度；图3实施例4志贺氏菌不同稀释浓度LAMP检测结果；图中1为阳性对照；2为阴性对照；3-12分别为10°-—109稀释倍；
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物沙门氏菌属AgfA-9-F3 :AGTTTCTGGCAGTGCTGTG (SEQ ID NO 1)AgfA-9-B3 :AGTACTGTTATCCGCACCCT (SEQ ID NO 2)AgfA-9-FIP :ATCCGGGCCGGAACTATTGCTTTTCTGGCGTCGTTCCACAAT (SEQ ID NO 3)
AgfA-9-BIP :CGCTTGCTCTGCAAAGCGATGTTTTACCATAACCGCTCTGGGT(SEQ ID NO 4)志贺氏菌属ipaH-69-F3 :ACATGAAGAGCAYGCCAACA Y 代表 C 或 T(SEQ ID NO 17)ipaH-69-B3 :TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 18)ipaH-69-FIP :CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA(SEQ ID NO 19)ipaH-69-BIP :GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT (SEQ ID NO 20)(2)购置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制缓冲液缓冲液按 0. 18mol/L Tris_HCl，0. 10mol/L KC1，0. 07mol/ L(NH4)2S04,15mmol/L MgS04,1 体积％ TritonX-100 配制，置于容器；(4)配制dNTPs 每种核苷酸浓度按lOmmol/L配制，置于容器；(5)配制甜菜碱甜菜碱浓度按3mol/L配制，置于容器；(6)配制硫酸镁溶液硫酸镁浓度按lOOmmol/L配制，置于容器；(7)购置稳定液石蜡油，置于容器；(8)购置显色液SYBR Green I，置于容器；(9)提取阳性对照提取沙门氏菌与志贺氏菌基因组DNA，置于容器；(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；制备工艺简述如下1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质 检；2、将反应液[即上述(2)-(6)步骤配制的液体]无菌分装，并按照实验用进行浓 度确定，抽样质检；3、将稳定液分装，抽样质检；4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、组装试剂盒。实施例2试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物沙门氏菌属AgfA-56-F3 CCCGGATTCCACGTTGAG(SEQ ID NO 5)AgfA-56-B3 :TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA (SEQ ID NO 6)AgfA-56-FIP :CCGCTCTGGGTAATGGTCGTTTTTTCTAACGCTGCGCTTGCTC (SEQ ID NO 7)AgfA-56-BIP :ATGTAGGCCAGGGTGCGGATATTTTTGGTCGATGGTGGCATTG (SEQ ID NO 8)志贺氏菌属ipaH-69-F3 :ACATGAAGAGCAYGCCAACA Y 代表 C 或 T(SEQ ID NO 17)ipaH-69-B3 :TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 18)ipaH-69-FIP :CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA(SEQ ID NO 19)ipaH-69-BIP :GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT (SEQ ID NO
820)(2)购置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制缓冲液缓冲液按 0. 25mol/L Tris_HCl，0. 15mol/L KC1，0. 15mol/ L(NH4)2S04，3(kimol/L MgS04，2 体积％ TritonX-100 配制，置于容器； (4)配制dNTPs 每种核苷酸浓度按20mmol/L配制，置于容器；(5)配制甜菜碱甜菜碱浓度按6mol/L配制，置于容器；(6)配制硫酸镁溶液硫酸镁浓度按200mmol/L配制，置于容器；(7)购置稳定液石蜡油，置于容器；(8)购置显色液Eva Green,置于容器；(9)提取阳性对照提取沙门氏菌与志贺氏菌基因组DNA，置于容器；(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；其他同实施例1。实施例3试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物沙门氏菌属AgfA-19-F3 :AGTTTCTGGCAGTGCTGTG(SEQ ID NO 9)AgfA-19-B3 :AGTACTGTTATCCGCACCCT (SEQ ID NO 10)AgfA-19-FIP :ATCCGGGCCGGAACTATTGC CTGGCGTCGTTCCACAAT(SEQ ID NO 11)AgfA-19-BIP CGCTTGCTCTGCAAAGCGATG ACCATAACCGCTCTGGGT(SEQ ID NO 12)志贺氏菌属ipaH-69-F3 :ACATGAAGAGCAYGCCAACA Y 代表 C 或 T(SEQ ID NO 17)ipaH-69-B3 :TCCTCACAGCTCTCAGTGG(SEQ ID NO 18)ipaH-69-FIP :CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA(SEQ ID NO 19)ipaH-69-BIP :GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT (SEQ ID NO 20)(2)购置DNA聚合酶Bst DNA聚合酶置于容器；(3)配制缓冲液缓冲液按 0. 2mol/L Tris_HCl，0. lmol/L KC1，0. lmol/ L(NH4)2S04，2(kimol/L MgS04,1 体积％ TritonX-100 配制，置于容器；(4)配制dNTPs 每种核苷酸浓度按lOmmol/L配制，置于容器；(5)配制甜菜碱甜菜碱浓度按5mol/L配制，置于容器；(6)配制硫酸镁溶液硫酸镁浓度按150mmol/L配制，置于容器；(7)购置稳定液石蜡油，置于容器；(8)购置显色液Eva Green，置于容器；(9)提取阳性对照提取沙门氏菌，志贺氏菌基因组DNA，置于容器；(10)将上述9个容器装成试剂盒，封装；其他条件与实施例1相同。实施例4沙门氏菌与志贺氏菌检测试剂盒的应用
本方法的主要技术要点是1)样品的制备和选择性增菌依据GB/T 4789. 4-2003《食品微生物学检验沙门氏 菌检验》与GB/T 4789.5-2003《食品微生物学检测志贺氏菌检验》的方法进行样品制备和 选择性增菌。2)提取增菌液模板DNA进行环介导等温扩增后进行快速筛选，沙门氏菌与志贺氏 菌LAMP扩增反应体系见表1。3)阴性结果可以直接出报告，阳性结果采用传统方法分离鉴定后确认。表1沙门氏菌与志贺氏菌LAMP扩增反应体系 1、室内验证1.1特异性小批量特异性试验采用菌株见表2。采用的LAMP方法为1)、提取细菌DNA模板直接取该增菌液lmL加到1. 5mL无菌离心管中，10000r/ min离心2min，尽量吸弃上清；加入80 y L DNA提取液，混勻后沸水浴lOmin，置冰上lOmin ； 10000r/min离心2min，上清即为核酸模板。2)、按研制的体系配制反应液，对上述模板进行LAMP反应，判断引物特异性。反应管中加入22 ii L的反应液+0. 5 ii L的DNA聚合酶+30 u L的稳定液+2. 5 y L待 检模板；65°C环介导等温反应60min ；往反应管中加入2 u L显色液，封管后轻轻摇勻观察， 反应管液体呈绿色，为沙门氏菌，志贺氏菌阳性，呈橙色则为阴性。反应液的主要成分dNTP，Tris-HCl [pH 8. 8]，MgS04, Triton X-100，Betaine,内 /外引物。表2小批量特异性试验采用菌株 其中 ATCC 为 American Type Culture Collection 的标准菌，CMCC 为中国医学细 菌保藏管理中心的标准菌。
0157]采用本发明方法对上述菌株的检测结果见表3，如图1。0158]表3采用本发明方法进行特异性试验结果0159]0160]编号检测结果0161]0162]阳性对照阳性0163]阴性对照阴性0164]ATCC 29004阴性0165]V405阴性0166]EC102阴性0167]CMCC 54002阴性0168]ATCC 13048阴性0169]ATCC 1307阴性0170]ATCC13182阳性0171]ATCC12022阳性0172]CMCC51334阳性0173]CMCC51263⑵阳性0174]CMCC(B)50071阳性0175]S334阳性0176]S217阳性0177]CMCC51376(2)阳性0178]0179]1.2灵敏度/检测低限
1)、分别接种沙门氏菌，志贺氏菌各5株于5支装有增菌液培养基的小试管中，生 长至约 1 X 108CFU/mL (测定 0D6QQ 值约 0. 4)。2)、分别取一定量的菌液，加入生理盐水以10倍稀释，分别标记为109，108，107，
06，
105，104，103，102，101，10°10°阳性_
权利要求
一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，包括Bst DNA聚合酶，缓冲液，dNTPs，甜菜碱，硫酸镁，显色液，稳定液和阳性对照，其特征在于还包括以沙门氏菌AgfA基因，志贺氏菌的ipaH基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根据权利要求1所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于所述的 沙门氏菌，志贺氏菌的两对内外引物序列分别为沙门氏菌属AgfA-9-F3 :AGTTTCTGGCAGTGCTGTG SEQ ID NO 1 AgfA-9-B3 :AGTACTGTTATCCGCACCCT SEQ ID NO 2 AgfA-9-FIP :ATCCGGGCCGGAACTATTGCTTTTCTGGCGTCGTTCCACAAT AgfA-9-BIP :CGCTTGCTCTGCAAAGCGATGTTTTACCATAACCGCTCTGGGT AgfA-56-F3 :CCCGGATTCCACGTTGAG SEQ ID NO 5 AgfA-56-B3 TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA SEQ ID NO 6 AgfA-56-FIP :CCGCTCTGGGTAATGGTCGTTTTTTCTAACGCTGCGCTTGCTC AgfA-56-BIP :ATGTAGGCCAGGGTGCGGATATTTTTGGTCGATGGTGGCATTG AgfA-19-F3 :AGTTTCTGGCAGTGCTGTG SEQ ID NO 9 AgfA-19-B3 :AGTACTGTTATCCGCACCCT SEQ ID NO 10 AgfA-19-FIP :ATCCGGGCCGGAACTATTGC CTGGCGTCGTTCCACAAT SEQ ID NO 11 AgfA-19-BIP CGCTTGCTCTGCAAAGCGATG ACCATAACCGCTCTGGGT SEQ ID NO 12 或 AgfA-156-F3 :CCCGGATTCCACGTTGAG SEQ ID NO 13 AgfA-156-B3 TCGGAGTTTTTAGCGTTCCA SEQ ID NO 14AgfA-156-FIP CCGCTCTGGGTAATGGTCGT TCTAACGCTGCGCTTGCTC SEQ ID NO 15 AgfA-156-BIP ATGTAGGCCAGGGTGCGGATAT GGTCGATGGTGGCATTG SEQ ID NO 16 志贺氏菌属ipaH-69-F3 :ACATGAAGAGCAYGCCAACA 其中 Y 代表 C 或 T SEQ ID NO 17 ipaH-69-B3 :TCCTCACAGCTCTCAGTGG SEQ ID NO 18ipaH-69-FIP :CGGAATCCGGAGGTATTGCGTGTTTTCCTTTTCCGCGTTCCTTGA SEQ ID NO 19 ipaH-69-BIP :GGTCGCTGCATGGCTGGAAATTTTGCAGCAACAGCGAAAGACT SEQ ID NO 20 或 ipaH-169-F3 :ACATGAAGAGCAYGCCAACA 其中 Y 代表 C 或 T SEQ ID NO 21 ipaH-169-B3 TCCTCACAGCTCTCAGTGG SEQ ID NO 22ipaH-169-FIP CGGAATCCGGAGGTATTGCGTG CCTTTTCCGCGTTCCTTGA SEQ ID NO 23 ipaH-169-BIP :GGTCGCTGCATGGCTGGAAA GCAGCAACAGCGAAAGACT SEQ ID NO 24
3.根据权利要求1所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于所述的 BstDNA聚合酶浓度7-10U/ u L。
4.根据权利要求3所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于所述的 BstDNA聚合酶酶浓度8U/ ii L。
5.根据权利要求1所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于所 述的缓冲液组成为0. 18-0. 25mol/L Tris_HCl，0. 10-0. 15mol/L KC1，0. 07-0. 15mol/ L(NH4)2S04,15-30mmol/L MgS04,1-2% TritonX-100。2SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 4 或SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 8
6.根据权利要求5所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于所述的 缓冲液组成为0. 2mol/L Tris-HCl,0. lmol/L KC1，0. lmol/L(NH4)2504，20mmol/L MgS04, 1% TritonX-100。
7.根据权利要求1所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于所述的 dNTPs每种核苷酸浓度10-20mmol/L，甜菜碱浓度3-6mol/L，硫酸镁浓度100-200mmol/L，显 色液为SYBR Green I或Eva Green，稳定液为石蜡油，阳性对照为沙门氏菌、志贺氏菌基因 组 DNA。
8.根据权利要求7所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒，其特征在于所述的 dNTPs每种核苷酸浓度lOmmol/L，甜菜碱浓度5mol/L，硫酸镁浓度150mmol/L。
9.一种根据权利要求1的试剂盒进行的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测方法，其特征在 于包括如下步骤(1)将待测样品增菌，得到样品增菌液；(2)将样品增菌液提取样品模板DNA；(3)在反应容器中加入权利要求1的检测试剂盒中的BstDNA聚合酶1. 8 2. 4体积份 数、缓冲液10体积份数、dNTPs 15 20体积分数、甜菜碱15 20体积分数、硫酸镁15 20体积分数、稳定液25 35体积份数、样品模板DNA 10体积份数、内引物FIP/BIP各2体 积份数、外引物F3/B3各4体积分数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则 为阳性，否则为阴性。
10.根据权利要求9所述的沙门氏菌与志贺氏菌联合检测方法，其特征在于步骤(3) 中所述的恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明涉及一种沙门氏菌与志贺氏菌联合检测试剂盒及其检测方法，本发明的试剂盒包括Bst DNA聚合酶，缓冲液，dNTPs，甜菜碱，硫酸镁，显色液，稳定液和阳性对照，还包括以沙门氏菌AgfA基因，志贺氏菌的ipaH基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的沙门氏菌与志贺氏菌检测试剂盒检测效果更全面、特异性高、漏检率低，适用于食品从业人员体检中沙门氏菌，志贺氏菌的快速检测。
文档编号C12Q1/10GK101864483SQ20101014571
公开日2010年10月20日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者张晓航, 张琳, 方筠, 曹以诚, 杜正平, 王传现, 王健, 田桢干, 章琪, 谭慧媚, 陆晔, 陈洵 申请人:广州华峰生物科技有限公司;中华人民共和国上海出入境检验检疫局