专利名称：一种兔出血症病毒“自杀性”dna疫苗及其构建方法
技术领域：
本发明涉及动物病毒学与动物传染病学技术领域，特别涉及一种兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗及其构建方法。
背景技术：
兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)俗称“兔痕”,是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种急性高致死性兔传染病。本病具有病死率高、死亡快，而且传播迅速等特点，对养兔业的健康发展造成了严重威胁，因而被国际兽疫局正式列为“国际动物保健编目” B类传染病，我国农业部也将之列为二类动物疫病。1984年初，刘胜江等在我国江苏无锡首次发现兔瘟以后，本病迅即蔓延到我国25省市、自治区，其后，世界各地如墨西哥及
欧洲的许多国家也有类似兔瘟流行，给养兔业造成了巨大经济损失。RHDV的衣壳蛋白为病毒的主要结构蛋白，称VP60。该蛋白是RHDV的主要结构蛋白，VP60构成的立体结构衣壳由180个完全相同的亚基组成，亚基之间相互作用然后形成具有三维构象的衣壳。该组装过程与各个亚基的N端序列有关，因为将该区段缺失后，VP60就再不能装配成空衣壳。RHDV在宿主细胞中完成一个复制周期后，由VP60组装的空衣壳将子代RNA包裹形成成熟的病毒粒，然后随着细胞的裂解释放出来，侵染其它的敏感细胞。大量研究结果证明RHDV的衣壳蛋白与病毒的致病性和免疫原性密切相关。国内外的学者使用不同的表达系统成功表达了 VP60，用表达产物接种兔子可以诱导产生较强的免疫应答，并能对抗RHDV的攻击。兔出血症病毒尚未建立体外组织细胞的培养方法，目前使用的疫苗主要为组织灭活苗。但随着家兔饲养成本的提高以及非免疫兔的减少，可用于制苗的肝组织日趋减少，使组织灭活苗的成本偏高，加之组织灭活苗可能导致散毒的缺点，近年来人们着眼于兔瘟新型疫苗的研究。Berglund 等(Berglund P, Smerdou C, Fleeton MN, et al. Enhancing immuneresponses usingsuicidal DNAvaccines. Nat Biotech, 1998 ;16 :562-565)于 1998 年率先提出了以甲病毒复制子为基础的“自杀性”DNA疫苗(suicidal DNAvaccine)的设想，即利用“自杀性’T)NA疫苗的甲病毒进入细胞后能表达出甲病毒的非结构蛋白(nSPs)，在nSPs的作用下甲病毒基因组RNA进行高效复制，在此过程中产生大量的双链RNA(dsRNA)中间体，最终可使转染的细胞凋亡，基于甲病毒复制子的DNA疫苗可引起转染的细胞凋亡，也称“自杀性"DNA疫苗，它比传统DNA疫苗更安全，无整合到宿主染色体的潜在危险性。自杀性DNA疫苗可引起高水平的体液免疫和细胞免疫，且可打破免疫耐受。在甲病毒基因组高效复制同时，目的抗原在亚基因组启动子的调控下获得高效表达，从而可以较低的免疫剂量引起较强的免疫反应。自杀性DNA疫苗的载体是以甲病毒复制子为基础的复制型DNA载体。病毒复制时结构基因拷贝数高达IO5之多，因此可以利用亚基因组的启动子使外源基因获得高效表达。自杀性DNA疫苗由于其具有RNA复制子，大量复制可导致感染细胞的凋亡。该凋亡可能是复制型载体在表达外源基因的过程中产生双链RNA (dsRNA)复制中间体介入的结果。dsRNA能在细胞和体液免疫中起强大的辅助作用。后来，研究者将RNA复制子载体系统改造成以DNA为基础的、RNA聚合酶依赖的系统。这种载体携带了甲病毒复制酶基因和外源基因的重组质粒DNA，缺失了病毒结构蛋白基因。它通过将人巨细胞病毒(CMV)早期增强子/启动子序列插入到SP6启动子的上游或替换SP6启动子启动转录。同时,在多克隆位点下游插入强转录终止信号SV40晚期聚A信号序列，正常终止转录。该质粒DNA转染宿主细胞后，利用宿主RNA聚合酶η在细胞核内转录，合成甲病毒复制酶，再合成亚基因组RNA及大量外源蛋白，从而大大提高表达效率。因此，从自杀性DNA疫苗的构建上我们可以看出其具有RNA疫苗和DNA疫苗的优点，能自主复制、大量表达。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗，以解决现有技术中现有的RHDV疫苗一般为弱毒苗或灭活苗，弱毒苗存在毒力返强的危险，而灭活苗往往需要多次免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败的技术问题。本发明的第二目的在于提供一种兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗的构建方法。本发明的技术方案如下一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗，该疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒复制子载体pSCA组成，其中，所述RHDV-VP60基因去掉了氨基端的31个氨基酸，其序列如SEQIDNO 1 所示。一种兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗的构建方法，包括如下步骤I)以发病兔内脏组织为原料进行RHDV病毒总RNA的提取；同时设计如下两个特异性引物PSCA-VP60F :5，ATTGGATCCfe^ dGCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，，PSCA-VP60R :5，AGACCCGGGmTCAGACATAAGAAAAGCC-3，；2)以病毒总RNA为模板，使用反转录方法，以PSCA-VP60R为反转录引物合成PSCA-VP60的cDNA第一链，用特异性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R进行PCR扩增，得到缺失氨基端31个氨基酸的VP60基因，并用试剂盒纯化回收；3)将扩增的RHDV-VP60基因片段重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达质粒中，即得到兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗。优选地，所述步骤I)中，RHDV病毒总RNA的提取方法为将RHDV病毒肌肉注射两月龄的新西兰大白兔，待新西兰大白兔死亡后，取其肝脏制备研磨液，按常规方法提取RHDV病毒总RNA。优选地，所述的反转录方法为用反转录试剂盒进行转录,反转录体系为=IOXBuffer 2 μ L、RNA/引物变性溶液
6μ L>2. 5mM dNTP Mixture 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L> RTaseM-MLV 0·5μ ,加灭菌蒸馏水9. 25 μ L，使反转录体系体积为20 μ L，其中所述的RNA/引物变性溶液制备方法为RNA模版5 μ L和特异性引物PSCA-VP60R I μ L在70°C水浴lOmin，冰上冷却2min ;反转录过程为将提取的RHDV-VP6042°C温浴Ih后，70°C水浴15min，最后置冰上2min，得到的样品_20°C保存备用；
PCR扩增方法为反应体系为2XPfuPCR MasterMix 12. 5 μ L、特异性引物 PSCA-VP60F O. 5 μ L、特异性引物PSCA-VP60R O. 5 μ L、模版cDNA 2 μ L，加灭菌蒸馏水9. 5 μ L，使反应体系体积为25 μ L ;将上述反转录方法得到的样品瞬间离心混合，采用热盖进行PCR扩增反应，过程为94°C预变性3min，然后94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min,30个循环，72°C延伸IOmin后，10°C终止反应，并用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP60cDNA片段。优选地，PCR扩增后获得的RHDV-VP60基因片段大小为1647bp。优选地，所述的步骤3)中，将扩增VP60cDNA片段重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达质粒中的过程具体如下A、将扩增RHDV-VP60基因片段和pSCA空载体用BamHI和SmaI进行双酶切，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收； B、将纯化回收的RHDV-VP60和pSCA空载体片段用T4DNA Ligase进行连接，连接体系为10 XBuffer I μ L、T4DNALigase I μ L、RHDV-VP606 μ L、pSCA I μ L，加灭菌蒸馏水I μ L，使连接体系总体积为10 μ L，16°C水浴连接4h，之后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，混匀，冰浴放置30min，42°C水浴中热激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨苄抗性平板中，12h后挑取菌落并摇菌；C、将得到的菌液利用AxyPrep DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒,经酶切鉴定和经Invitrogen公司测序显示，结果完全正确，从而成功构建成兔出血症“自杀性” DNA疫苗。一种兔出血症病毒“自杀性’DNA疫苗用于制备预防兔病毒性出血症的药物中的用途。与现有技术相比，本发明的有益效果如下I、提纯质粒DNA的工艺简便，因而生产成本较低，且适于大批量生产；2、DNA分子很稳定，可制成DNA疫苗冻干苗，使用时在盐溶液中可恢复原有活性，因而便于运输和保存；3、虽然DNA疫苗具有与弱毒疫苗相当的免疫原性，能激活细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免疫，但由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因，基本没有毒性逆转的可能，因此不存在减毒疫苗毒力回升的危险，而且由于机体免疫系统中DNA疫苗的抗原相关表位比较稳定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亚单位疫苗那样，会出现表位丢失，因此，本发明的“自杀性” DNA疫苗比传统疫苗更加安全、高效；4、本发明的“自杀性”DNA疫苗在动物体内一过性表达外源基因后，随细胞凋亡而被机体清除，从而可避免DNA质粒可能整合到宿主细胞染色体或可能造成免疫耐受等隐
串
■/Qi、O当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
图I为本发明实施例用RT-PCR方法扩增VP60基因的电泳检测图；图2为本发明实施例pSCA-VP60重组质粒酶切鉴定的电泳检测图；图3为本发明实施例VP60基因在细胞中表达RT-PCR的电泳检测图；图4为本发明实施例VP60基因在细胞中表达Westernblot图5为本发明实施例VP60基因在细胞中表达后在荧光显微镜下的结构图，其中，a为重组质粒pSCA-VP60转染400 X ；b为阴性对照；图6为构建本发明的“自杀性” DNA疫苗PSCA/VP60的策略示意图；图7为本发明实施例的兔出血症病毒“自杀性"DNA疫苗刺激兔子产生特异性抗体后，实验组与对照组于λ 450nm处测定每孔的OD值的对比图；图8为本发明实施例的兔出血症病毒“自杀性"DNA疫苗刺激白兔T淋巴细胞增殖后，实验组与对照组于λ 570ηπι处测定OD值的对比图；图9为本发明实施例的兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗刺激兔子IFN- Y，实验组与对照组于λ 450ηπι处测定每孔的OD值的对比图；图10为本发明实施例的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗刺激兔子IL_4，实验组 与对照组于λ 450nm处测定每孔的OD值的对比图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明提供一种兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗，该疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒复制子载体PSCA组成，如图6，其中，所述RHDV-VP60基因是RHDV病毒的主要衣壳蛋白，并且去掉了氨基端的31个氨基酸，其序列如SEQ ID NO :I所示。实施例本实施例的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，参见图6，具体包括如下步骤I)设计特异性引物和RHDV病毒总RNA的提取及纯化设计特异性引物根据NCBI核酸数据库中的RHDV JX97株(序列登录号为DQ205345)病毒VP60基因序列，利用Primer5. O软件自行设计，由上海杰李生物技术有限公司合成以下引物PSCA-VP60F 5，ATTGGATCCfe^ I}GCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，， PSCA-VP60R 5，AGACCCGGGm TCAGACATAAGAAAAGCC-3，。RHDV病毒总RNA的提取及纯化将RHDV病毒(国家兽医微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号CVCCAV272)肌肉注射两月龄的新西兰大白兔，待新西兰大白兔死亡后，取其肝脏制备研磨液，按常规方法提取RHDV病毒总RNA，具体为，将死亡后白兔解剖取其肝脏，用剪刀将肝脏剪碎研磨，并加入I %的双抗，将研磨液反复冻融3次后，用Trizol法提取RNA。2)扩增RHDV-VP60基因，去掉RHDV-VP60氨基端31个氨基酸将步骤I)提取的RNA，去掉RHDV-VP60氨基端31个氨基酸，具体步骤为以病毒总RNA为模板，使用PSCA-VP60R为反转录引物合成cDNA第一链，用上述特异性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R进行PCR扩增，即得到缺失氨基端31个氨基酸的VP60基因。所述的RT-PCR扩增，以及克隆得到RHDV-VP60的cDNA基因序列的步骤如下用Takara M-MLV反转录试剂盒进行转录,反转录体系为10XBuffer 2 μ L> RNA/引物变性溶液 6 μ L、dNTP Mixture (2. 5mM) 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L、RTaseM-MLVO.5 μ L，加灭菌蒸馏水9. 25 μ L，使反转录体系体积为20 μ L，其中RNA/引物变性溶液的制备如下将5 μ L提取的RNA和I μ L PSCA-VP60R引物均匀混合，70°C水浴IOmin后，冰上极冷2min，最后离心数秒。反转录过程为将提取的RNA在42°C温浴Ih后，70°C水浴15min，最后在冰上2min，_20°C保存备用；PCR 反应体系为2XPfu PCR MasterMix 12. 5 μ L、PSCA-VP60F O. 5 μ L、PSCA-VP60R0. 5 μ L、模版cDNA 2 μ L，加灭菌蒸馏水9. 5 μ L，使PCR反应体系体积为25 μ L，将反转录得到的样品瞬间离心混合，采用热盖进行PCR扩增反应94°C预变性3min，然后94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，30个循环，72°C延伸IOmin后，10°C终止反应，并用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP60cDNA片段。图I为VP60基因扩增后的电泳检测图，该检测图证明获得RHDV-VP60基因扩增片段大小为1647bp，其序列参见序列表。3)将步骤2)扩增的VP60片段利用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP60cDNA 片段； 4)将步骤3)回收的VP60cDNA片段和pSCA空载体用BamHI和SmaI进行双酶切，并利用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP60cDNA和pSCA空载体片段；5)将回收的VP60cDNA和pSCA空载体片段用Takara公司的T4DNALigase进行连
接，连接体系如下
f T4 DNA Ligase.1 uuL
10 X BufferI .OiiL
IOuL I \rp<50 基H6JiiL
pSCA空载体IOwL
ιI ^uL连接体系为10uL，16°C水浴连接30min，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞JM109，混匀，冰浴放置30min，42°C水浴中热激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨苄抗性平板中，12h后挑取菌落并摇菌；6)将步骤5)得到的菌液利用AxyPrep DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒；7)重组质粒酶切鉴定根据引物中所带酶切位点，将步骤6)中抽提得到的质粒用BamHI.Sma I进行双酶切鉴定。酶切反应体系如下
r 重组,猶粒 5uL
10.TO. M
IOwL JBSAO.—HiL
IBaniHI5 IiL
Silli I0,5 L
、.IdH-. O3i L酶切反应体系为10uL，37°C水浴2h，然后用I %琼脂糖凝胶电泳检测酶切鉴定结果，检测结果如图2，载体条带大小为11489bp，目的基因的条带大小为1647bp，与预期一致，初步判定重组质粒构建成功。8)重组质粒pSCA_VP60经Invitrogen公司测序,显示结果完全正确。至此，成功将VP60基因重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达载体中，构建了一种兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗-抗RHDV的pSCA-VP60RHDV疫苗。对上述制备的pSCA-VP60RHDV疫苗外源VP60基因体外瞬时表达进行鉴定，包括如下几个方面I) VP60基因的体外mRNA表达鉴定RT_PCR法检测将BHK-21细胞在六孔板中生长，当BHK-21细胞在六孔板中长到80%时，进行转染。转染过程如下:⑴将5μ g pSCA-VP60质粒和10 μ g脂质体分别加入到两组250ulOpti-MEM培养液中，轻轻混匀，静置5min ； (2)将含pSCA_VP60质粒的Opti-MEM培养液加 入到含脂质体的Opti-MEM培养液中，轻轻混匀，静置20min ； (3)将六孔板中的培养液吸出并弃掉，用PBS (磷酸盐缓冲液)洗BHK-21细胞3次，然后加入含pSCA_VP60质粒和脂质体的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，轻轻摇匀；(4)放入37°C，5% CO2培养箱中，5h后换含FBS(胎牛血清)的完全培养液继续培养，48h后取出BHK-21细胞，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次后胰酶消化，然后离心弃上清，得到的细胞沉淀用于提取RNA，RNA用特异性引物PSCA-VP60R进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板，用引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R进行PCR扩增。PCR反应程序为94°C预变性3min，94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min,30个循环，72°C延伸lOmin，得到的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，如图3，条带大小为1647bp，与目的基因大小一样，成功检测到mRNA，说明目的基因已经转入到BHK-21细胞内。2)VP60基因体外表达鉴定Western blot法检测将BHK-21细胞在六孔板中生长，当BHK-21细胞在六孔板中长到80%时，进行转染。转染过程如下:⑴将5μ g pSCA-VP60质粒和10 μ g脂质体分别加入到两组250ulOpti-MEM培养液中，轻轻混匀，静置5min ； (2)将含质粒的Opti-MEM培养液加入到含脂质体的Opti-MEM培养液中，轻轻混匀，静置20min ;(3)将六孔板中的培养液吸出并弃掉，用PBS洗BHK-21细胞3次，然后加入含pSCA_VP60质粒和脂质体的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，轻轻摇匀；(4)放入37°C，5% CO2培养箱中，5h后换含FBS (胎牛血清)的完全培养液继续培养，48h后取出BHK-21细胞，反复冻融裂解，跑10%SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳，最后将电泳分离的细胞总蛋白转移至PVDF(聚偏氟乙烯)膜，用封闭液(5%脱脂乳配制)37°C封闭30min。加入I : 200稀释的VP60多抗血清，37°C下孵育lh。用PBST (磷酸盐吐温缓冲液)清洗3次，5min/次。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(购自北京康为世纪生物科技有限公司)作为二抗与之反应，37°C下孵育50min，用PBST清洗3次最后用DAB显色试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)显色，如图4，条带大小与VP60蛋白大小一致，说明VP60蛋白成功获得表达。3) VP60基因体外表达鉴定IFA法检测将BHK-21细胞在六孔板中生长，当BHK-21细胞在六孔板中长到80%时，进行转染。转染过程如下(1)将5μ g PSCA-VP60质粒和IOyg脂质体分别加入到两组250ulOpti-MEM培养液中，轻轻混匀，静置5min ； (2)将含pSCA_VP60质粒的Opti-MEM培养液加入到含脂质体的Opti-MEM培养液中，轻轻混匀，静置20min ； (3)将六孔板中的培养液吸出并弃掉，用PBS洗BHK-21细胞3次，然后加入含pSCA_VP60质粒和脂质体的Opti-MEM混合液500ul，再加500ul Opti-MEM于六孔板中，轻轻摇匀；(4)放入37°C，5% CO2培养箱中，5h后换含FBS (胎牛血清)的完全培养液继续培养，48h后取出BHK-21细胞，用PBS液洗3次，5min/次。将培养的细胞用丙酮甲醇=I I固定液4°C固定15min。用PBST清洗3次，5min/次。用封闭液(5%脱脂乳配制)37°C封闭30min。加入I : 200稀释的VP60多抗血清，37°C下孵育lh。用PBST清洗3次，5min/次。加入I : 1000稀释的FITC标记山羊抗兔IgG 二抗(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，37°C下孵育40min。PBST清洗3次，IOmin/次。最后置于倒置荧光显微镜下观察并记录结果，如图5，pSCA-VP60转染的BHK-21细胞具有很强的特异性荧光，而未转染的BHK-21细胞无特异性荧光，说明VP60蛋白获得表达，且表达产物存在于BHK-21细胞内。对上述得到的pSCA-VP60RHDV疫苗的免疫效果进行检验，包括如下几个方面l)pSCA-VP60RHDV疫苗在兔子内免疫反应的特异性抗体检测将8只两月龄兔子随机分为2组，每组4只，分别免疫pSCA-VP60和PBS，肌肉注射免疫两次，每次间隔两周，在第一次免疫后第2周、第二次免疫后第2周，对免疫组PSCA-VP60和对照组PBS的兔子进行耳静脉采血，血液于37°C静置lh，再于4°C冰箱中静置过夜。最后，用5000转/分钟的转速，离心15分钟，得到血清。用间接ELISA法测定该血清抗体的0D450值，以RHDV-VP60原核表达蛋白为包被抗原(5 μ g/孔)于96孔酶标板上，被检兔子血清为一抗，过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(购自北京康为世纪生物科技有限公司)为二抗，同时设立不加被检血清的空白对照，显色终止后，用酶标仪测定上述各样品在450nm处的吸光值，并用SAS统计软件分析，结果如表I和图7，该结果显示免疫组与对照组比较差异显著，免疫组可以获得好的免疫效果。表I特异性抗体检测结果
IQP450—
I第一·次免g丨+第二 欠兔ISρΒ€ΑΛΨ6(}H34
PBS__CMSOM
I 空白对麗CUij I 046 —2) pSCA-VP60RHDV疫苗在兔子体内T淋巴细胞增殖检测将8只两月龄兔子随机分为2组，每组4只，分别免疫PSCA-VP60和PBS，肌肉注射免疫两次，每次间隔两周，在第一次免疫后第2周、第二次免疫后第2周，对免疫组PSCA-VP60和对照组PBS的兔子进行耳静脉采血分离淋巴细胞，以含10% FBS (胎牛血清)的DMEM(极限必需培养基)稀释成I X 10/mL的细胞悬液。于96孔细胞培养板中培养，每孔加入100 μ L细胞悬液，同时设DMEM(极限必需培养基)自身对照，每个样品设8个重复孔。培养板置37°C、5% CO饱和湿度条件下培养68h后，每孔加10 μ LMTT (4，5-二甲基噻唑-2) (5mg/mL)，孵育4h，加入50ul 二甲基亚砜DMSO溶液终止反应，待蓝色沉淀溶解后于λ 570nm处测定OD值，对测得数值进行统计学分析，结果如表2和图8，该结果显示免疫组与对照组比较差异显著，免疫组可以获得好的免疫效果。表2T淋巴细胞增殖检测结果
权利要求
1.一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗，其特征在于，该疫苗由RHDV-VP60基因和甲病毒复制子载体PSCA组成，其中，所述RHDV-VP60基因去掉了氨基端的31个氨基酸，其序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 1)以发病兔内脏组织为原料进行RHDV病毒总RNA的提取；同时设计如下两个特异性引物PSCA-VP60F :5，ATTGGATCCteanffl DGCCACCATGGGCGTGGTGGCCGC-3，，PSCA-VP60R :5’ AGACCCGGGuTCAGACATAAGAAAAGCC-3，； 2)以病毒总RNA为模板，使用反转录方法，以PSCA-VP60R为反转录引物合成PSCA-VP60的cDNA第一链，之后用特异性引物PSCA-VP60F和PSCA-VP60R进行PCR扩增，得到缺失氨基端31个氨基酸的VP60基因，并用试剂盒纯化回收； 3)将扩增的RHDV-VP60基因片段重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达质粒中，即得到兔出血症病毒“自杀性” DNA疫苗。
3.根据权利要求2所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述步骤I)中，RHDV病毒总RNA的提取方法为将RHDV病毒肌肉注射两月龄的新西兰大白兔，待新西兰大白兔死亡后，取其肝脏制备研磨液，按常规方法提取RHDV病毒总RNA。
4.根据权利要求2所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述的反转录方法为 用反转录试剂盒进行转录，反转录体系为=IOXBuffer 2 μ L、RNA/引物变性溶液6 μ L>2. 5mM dNTP Mixture 2 μ L、RNase Inhibitor 0. 25 μ L> RTaseM-MLV 0·5μ ,加灭菌蒸馏水9. 25 μ L，使反转录体系体积为20 μ L，其中所述的RNA/引物变性溶液制备方法为RNA模版5 μ L和特异性引物PSCA-VP60R I μ L在70°C水浴lOmin，冰上冷却2min ;反转录过程为将提取的RHDV-VP6042°C温浴Ih后，70°C水浴15min，最后置冰上2min，得到的样品_20°C保存备用； PCR扩增方法为 反应体系为2XPfu PCR MasterMix 12. 5 μ L、特异性引物 PSCA-VP60F 0.5yL、特异性引物PSCA-VP60R O. 5 μ L、模版cDNA 2 μ L，加灭菌蒸馏水9. 5 μ L，使反应体系体积为25 μ L ;将上述反转录方法得到的样品瞬间离心混合，采用热盖进行PCR扩增反应，过程为94°C预变性3min，然后94°C变性Imin，56°C退火Imin，72°C延伸2min，30个循环，72°C延伸IOmin后，10°C终止反应，并用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒纯化回收VP60cDNA片段。
5.根据权利要求4所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于，PCR扩增后获得的RHDV-VP60基因片段大小为1647bp。
6.根据权利要求2所述的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗的构建方法，其特征在于， 述的步骤3)中，将扩增的VP60cDNA片段重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达质粒中的过程具体如下 A、将扩增的RHDV-VP60基因片段和pSCA空载体用BamHI和SmaI进行双酶切，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收； B、将纯化回收的RHDV-VP60和pSCA空载体片段用T4DNALigase进行连接，连接体系为10XBuffer I μ L、T4DNALigase I μ L、RHDV-VP606 μ L、pSCA I μ L，加灭菌蒸馏水I μ L，使连接体系总体积为10 μ L，16°C水浴连接4h，之后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，混匀，冰浴放置30min，42°C水浴中热激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于氨苄抗性平板中，12h后挑取菌落并摇菌； C、将得到的菌液利用AxyPrep DNA质粒抽提试剂盒抽提质粒，经酶切鉴定和经invitrogen公司测序显示，结果完全正确，从而成功构建成兔出血症“自杀性” DNA疫苗。
7.一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗用于制备预防兔病毒性出血症的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗及其构建方法。本发明的兔出血症病毒“自杀性”DNA疫苗，由RHDV-VP60基因和甲病毒复制子载体pSCA组成。该DNA疫苗的构建方法包括RHDV病毒总RNA的提取及纯化，设计特异性引物，通过RT-PCR扩增，克隆得到RHDV-VP60的cDNA基因序列，去掉RHDV-VP60氨基端31个氨基酸，最后将纯化后的VP60cDNA片段重组到甲病毒复制子载体pSCA真核表达质粒中。与现有技术相比，本发明的疫苗安全高效，并可随细胞凋亡而被机体清除，从而避免DNA质粒可能整合到宿主细胞染色体或可能造成免疫耐受等隐患，且更长效稳定，操作便捷。
文档编号C12N15/66GK102935240SQ20121048936
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者刘光清, 程英杰, 孟春春, 陈宗艳, 李传峰 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所