专利名称：兔病毒性出血症强毒毒株的选育及疫苗研制方法
技术领域：
本发明涉及兔病毒性出血症强毒毒株的选育及其混合灭活疫苗的研制方法。用该混合灭活苗来预防兔病毒性出血症。
兔病毒性出血症(又名兔瘟)是一种新发现的兔传染病。我国1984年春在江苏省最早发现此病。此病是一种兔的急性传染病，主要特征是传染性强，潜伏期短，发病率和死亡率均高。1984年冬迅速蔓延到了上海、浙江、安徽等省市。1985年以来湖南、贵州、青海、北京、河南、河北等地都相继出现此病。“兔瘟”的出现，给养兔业造成严重的经济损失。1984年6月，南京农业大学兽医微生物教研组对此病进行了病原和病理方面的初步研究，提出了使用组织灭能苗加入氢氧化铝或福氏不完全佐剂紧急预防接种以控制疫情的方法，并且收到了较好效果。同年，江苏农学院牧医系病原微生物研究室对“兔瘟”进行了较有成效的研究，找到了一种可靠的预防途径利用兔瘟华西系强毒HC-84毒株(1984年3月采集病料分离而得)，接种易感兔，取病死兔的肝、脾、肾作为制苗材料，将材料无菌捣碎，用生理盐水1∶10稀释后过滤，加福尔马林溶液充分混匀、灭能，制得“兔瘟”疫苗。该疫苗免疫期为6个月。此后，湖南、青海、北京、河南、河北等地也均采取脏器灭活苗来预防此病。目前最好的预防措施就是采取上述的脏器灭活疫苗进行免疫。但是此方法也存在着不足之处仅取脏器作为制苗材料，产量低，成本高，不能满足预防兔瘟者的需要。
本发明的目的在于分离及培育出一种毒力较为稳定的强毒毒株，并进行脏器及肌肉的混合灭活疫苗的制备，来提高疫苗的产量，降低成本，满足预防兔瘟者的需要。
本发明的技术特征是用病兔肝组织制成乳剂，接种易感兔，分离和筛选出HA价较高的毒株LY，用含毒的肌肉组织悬液通过易感连续传代培育，第13-36代中肌肉的HA价在160-640倍，肝HA价在5120-20480倍，得到强毒毒株MLY，以MLY毒株的F15-35之间作为种毒，接种易感兔，取24-72小时之间发病、具有典型病变死亡的兔，剖检取肝、脾、心、肾、肌肉组织，按常规方法进行制苗。
下面结合实施例进一步说明强毒毒株MLY的选育及其混合灭活苗的制备方法。
(一)病毒的分离和筛选1986年我们采集病死兔分离的8个毒株，经与江苏农学院赠送已知兔病毒性出血症的HC-84-RF18株免疫血清做血清学试验，证明都具有相同的抗原性。对人的“O”型红细胞发生凝集。我们筛选出HA价较高的毒株以蔡氏滤器(EK滤板)抽滤和采用终点稀释方法提纯，通过血凝价和对家兔毒力的测定最后筛选出毒力强的涞源毒(肝的HA价为10240-20480倍，肌肉HA价在8-16倍)，以下简称LY毒株，做为试验毒株。
(二)种毒的培育LY毒在开始的代数，其含毒肝的HA价为10240-20480倍，肌肉组织HA价为8-16倍，1∶4肌肉组织悬液5毫升未能引起家兔死亡。从而表明兔病毒性出血症死亡兔的肌肉含毒量很低，我们通过连续传代增加肌肉的含毒量，以达到提高疫苗产量的目的。
接种传代以含毒的肌肉组织制成乳剂，由肌肉或皮下注射健康家兔，开始大剂量，而后随着代次的增加，递减接种剂量，在传代过程中每隔一定阶段测定HA价，并对家兔的致病性做了测定。结果，在传代过程中不同代数采取病死兔的肌肉或肝来测定HA价，得出病毒对肌肉已从13代以后用10-1，1毫升能有规律地引起易感兔发病和死亡，肌肉的HA价也明显提高，说明随继代的递增而毒力逐渐增强，培育出的强毒毒株简称MLY毒株(详见表1)。
表1肌肉毒不同代数接种兔的反应及含毒组织的HA价
毒种必须符合下列标准1、用作毒种的材料必须经细菌学检验，证明无菌。
2、毒种对易感兔的最小感染量不低于10-3/1毫升。
3、毒种对人的“0”型红细胞凝集价必须达到320倍以上(肝对人“O”型红细胞凝集价不低于10240倍)。
(三)毒种的保存和继代1、毒种的保存毒种保存于-20℃以下的冰箱内，保存期6个月。
2、种毒的继代将种毒用生理盐水1∶9稀释，每毫升加入双抗(青霉素、链霉素)各1000单位，置4℃冰箱作用4小时，以2000-3000转/分离心10-20分钟，取上清液作为接种材料。每隔6个月继代一次，每代接种4只体重在1.5-2.5公斤的易感健康兔，每兔颈部皮下接种1-2毫升，接种的易感兔应于36-72小时发病死亡，取其典型病变并经无菌检验的混合肌肉，置于无菌的容器内闭封保存于-25℃以下冰箱，作为种毒继代用。
(四)接种和采样1、家兔的选择(1)制造疫苗和检验，均需选用自繁自养或定点供应的健康易感兔。
(2)家兔接种前至少观察3天，选择1.5-2.5公斤健壮者使用。
2、接种材料的制备以MLY毒株的F15-35之间做为种毒，将毒种剪碎放入研磨器内研磨，磨细后用生理盐水作10倍稀释，每毫升加双抗各1000单位，置4℃冰箱作用3-4小时，然后以2000-3000转/分离心10-20分钟，取上清液作为接种材料。
3、接种每兔颈部皮下注射上述材料1-1.5毫升，一般于24-72小时死亡。
4、制苗材料的采集以无菌手术取具有典型病变的24-72小时死亡兔的肝、脾、心、肾、肌肉，放置于无菌的容器内，并于结冻的冰箱内保存，作为制苗材料。
(五)疫苗制造1、病料的研磨将病料经无菌捣碎，用无菌PH7.2-7.6的缓冲液作10倍稀释后，加双抗每毫升各1000单位，在室温(20-30℃)作用4小时，经2层纱布加一层60-80目铜纱过滤于无菌容器内。
2、灭能按组织悬浮液量加入0.6%福尔马林溶液(甲醛含量为36%)充分混匀，瓶口用胶布封闭，于37℃灭能48小时，每2小时摇一次，灭活完毕后进行分装。
(六)疫苗检验1、感观检验灭活苗呈土褐色。
2、无菌检验每批疫苗中任选2瓶(分装始及末各取一瓶)作10倍稀释，分别接种于肉汤、厌气肝汤及普通琼脂培养基中，每管0.5毫升，于37℃温箱培养48-96小时，无菌者即为无菌检验合格。
3、安全检验每批疫苗任选2瓶(分装始及末各取一瓶)作为检验样品，用1.5-2.5公斤的健康兔4只，每只颈部皮下注射5毫升，无出现典型临床症状和死亡者认为合格。如有一只死亡或出现典型临床症状即为不合格。
4、免疫力检验每批疫苗任选2瓶作为免疫力检验。选易感兔4只，每只颈部皮下注射1毫升，14-15天用强毒病料0.1克攻击，应全部保护为合格。
(七)疫苗的保存和使用1、有效期疫苗保存于室温(20-30℃)阴暗处有效期为6-8个月。
2、免疫剂量及途径每只颈部皮下注射1毫升，4公斤以上者每只颈部皮下注射2毫升。
3、免疫期为6-9个月。
本发明试制两年来，取得了可喜的成绩。两年来，共试制疫苗16批，35万毫升，通过室内效检205只兔，经攻毒100%保护，达到部颁专业质量标准。在19个县、市对不同品种、年龄及怀孕兔26万只的免疫接种均无不良反应，经走访、检测和抽样攻毒试验，结果平均保护率达到99.1%(疫苗期的试验结果见表2、表3)。本疫苗免疫期达6-9个月，室温(20-30℃)保存6-8个月仍保持良好的免疫原性。而且，用本方法制备的肌肉、脏器混合灭活苗产量高，成本低，10只兔可取肝、脾、肾、心511克，肌肉1859克，可制组织苗21810毫升，每毫升成本费为0.0038元，但制脏器灭活苗仅有4990毫升，每毫升0.015元，组织苗比脏器苗产量提高337%，成本费降低74%，具有明显的积极效果和广阔的推广前景。
表2五批疫苗效检结果
分子存活或死亡数;分母试验兔数表311批苗6次免疫期试验结果
权利要求
1.一种兔病毒性出血症强毒毒株的选育及其疫苗的研制方法，其特征在于用病兔肝组织制成乳剂，接种易感兔，分离和筛选出HA价较高的毒株LY，(1)用含毒的肌肉组织悬液通过易感兔连续传代培育，第13～36代中肌肉的HA价在160～640倍，肝HA价在5120～20480倍，得到强毒毒株MLY，(2)以MLY毒株的F15～35之间作为种毒，接种易感兔，取24～72小时之间发病、具有典型病变死亡的兔，剖检取肝、脾、心、肾、肌肉组织，按常规方法进行制苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于制造疫苗时，将接种易感兔病料经无菌捣碎，用无菌PH7.2～7.6的缓冲液作10倍稀释后，加双抗每毫升各1000单位，在室温下(20～30℃)作用4小时，经2层纱布加一层60～80目铜纱过滤于无菌容器内。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于将过滤组织悬液加入0.6%福尔马林溶液(甲醛含量为36%)充分混匀，闭封，于37℃灭活48小时，每2小时摇一次，灭活后分装。
全文摘要
本发明是一种兔病毒性出血症(兔瘟)的强毒毒株选育及其疫苗的研制方法，用分离和筛选出的毒株通过易感兔连续传代培育出强毒毒株MLY，接种易感兔，剖检取肝、脾、心、肾、肌肉，按常规方法进行混合灭活苗的制备。用本方法制备的肌肉脏器混合苗产量高，成本低，每毫升成本费为0.0038元，组织苗比脏器苗产量提高337％，成本费降低74％。
文档编号C12N7/04GK1043739SQ88108859
公开日1990年7月11日 申请日期1988年12月28日 优先权日1988年12月28日
发明者蔡崇雅, 赵恩保, 杨秀女, 薛宗丽, 邢玉莲, 武秋双 申请人:河北省畜牧兽医研究所