一种鸡脂质代谢合成相关的脂肪酸合成酶基因荧光定量RT-PCR试剂盒的制作方法

本实用新型属于生物技术领域，尤其涉及鸡FASN基因表达荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法，主要用于鸡FASN基因表达调控和脂质代谢相关的功能研究。

背景技术：

脂质代谢基因包括脂肪合成相关的基因，它能够影响脂肪合成速率，进而影响脂肪组织的含量。因为鸡生长速度快，腹部脂肪的大量沉积，所以鸡被作为研究脂质代谢、肥胖和生长机制的模式生物(Stern,2005；Lee et al.,2008)。脂肪生成主要在肝脏(Leveille et al.,1975)，并牵涉到一系列糖酵解、柠檬酸循环、脂肪酸合成。脂肪酸合酶(Fattyacid synthase，FASN)是细胞内脂肪酸从头合成途径中的关键酶，在脂肪酸生物合成过程中将小分子碳单位聚合成长链脂肪酸的关键酶，能够调控内源性脂肪酸的合成，其主要产物是软脂酸，并且以甘油三酯的形式存储能量。因此，研究FASN基因的表达调控对于理解脂质代谢调控机理具有重要意义。

实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)相结合使定量极微量的基因表达成为可能，广泛用于基因表达、基因功能等方面研究。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本实用新型提供一种鸡FASN基因表达荧光定量RT-PCR检测试剂盒，本实用新型试剂盒准确性高、快速、价格低廉，通过建立实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡FASN基因表达的方法，为研究及FASN表达调控以及脂质代谢调控奠定基础，为优质鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值和社会效应。

本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，一种鸡脂质代谢合成相关的脂肪酸合成酶基因荧光定量RT-PCR试剂盒，包括盒体、衬垫、SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物、鸡FASN基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物、dNTP、灭菌DEPC水。

其中，鸡FASN基因正反向引物序列为：

F:5’—CCATTGCACCAGCACTACTCA—3’，

R:5’—ACGAGGCTTAGGGTGTGGAA—3’；

以及鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物序列为

F:5’—GTCCACCGCAAATGCTTCT—3’，

R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’。

上述鸡脂质代谢合成相关的脂肪酸合成酶基因荧光定量RT-PCR试剂盒的使用方法如下：

(1)组织RNA的抽提与纯化：从鸡组织中提取总RNA并纯化；

(2)cDNA第一链的合成：以步骤(1)中所提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；

(3)荧光定量real time PCR扩增反应：采用SYBR Green I燃料法，以上述(1)设计的FASN正反向引物和β-actin基因正反向引物和(2)合成的cDNA第一链为模板，在荧光定量PCR仪上进行；

(4)溶解曲线分析

步骤(4)反应后的溶解曲线分析中，FASN和β-actin基因均只有一个特异性峰，溶解温度分布为90.5℃和91℃，则说明设计的FASN引物具有较好的特异性，可以用来FASN基因定量表达分析。

本实用新型所述步骤(3)和(4)中real time PCR扩增的反应条件设置如下：

FASN：95℃预变性20-30s,然后40个循环的95℃变性20-30s,退火55-60℃20-30s,最后95℃变性10-15s,60℃1min,95℃10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

β-actin：95℃预变性20s,然后40个循环的95℃变性20-30s,退火56-59℃20-30s,最后95℃变性10-15s,60℃1min,95℃10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

鸡各组织样本经反转录成cDNA第一链后，分别利用FASN和β-actin基因基因各自优化好的条件进行real time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β-actin基因为内参照，对FASN基因mRNA表达水平进行校正，并采用2^-ΔΔCt法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)，以一种组织，比如肝脏ΔCt作为其他组织的参照，计算相对表达量ΔΔCt，ΔΔCt＝(ΔCt_Xgroup–ΔCt_参照)，以此来比较FASN基因表达量的倍数变化。

β-actin基因作为看家基因，在所有类型的细胞中都是稳定表达的，其表达只收到启动子序列或启动子序列与RNA聚合酶相互作用影响，而不受其他机制调节。因此，其常被用做测定目标基因表达量时的参照基因。

与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：

第一，FASN荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、自动化程度高，无污染、实时性好等优点。

第二，脂肪酸合酶(Fattyacid synthase，FASN)是细胞内脂肪酸从头合成途径中的关键酶，在脂肪酸生物合成过程中将小分子碳单位聚合成长链脂肪酸的关键酶，能够调控内源性脂肪酸的合成，并且以甘油三酯的形式存储能量。因此，研究FASN基因的表达调控对于理解脂质代谢调控机理具有重要意义。

第三，本研究通过建立实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡FASN基因表达的方法，为研究及FASN表达调控以及脂质代谢调控奠定基础，为优质鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值和社会效应。

附图说明

图1是本实用新型β-actin和FASN基因的溶解曲线图；

图1中：前一个峰图为β-actin基因的溶解曲线，后一个峰图为FASN基因的溶解曲线；

图2是本实用新型FASN基因在狼山鸡公母鸡不同组织中的差异表达量图；(已经修改)

图2中：不同小写字母表示FASN在不同组织中表达差异显著(P＜0.01or P＜0.05)；*表示FASN基因在公母鸡的同一组织中表达量差异显著(P＜0.01or P＜0.05)。

图3是本实用新型鸡脂质代谢合成相关的脂肪酸合成酶基因荧光定量RT-PCR试剂盒的结构示意图；

图3中：1盒体，2衬垫，3SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物，4鸡FASN基因表达的特异性正反向引物，5鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物，6dNTP，7灭菌DEPC水。

具体实施方式

结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。

实施例：FASN基因在狼山鸡公母鸡不同组织中差异表达量分析

狼山鸡是优良的蛋肉兼用型鸡种之一。以产蛋多、蛋体大，体肥健壮、肉质鲜美而著称，年产蛋量为200个左右，蛋重为58g左右，性成熟为180d。具有繁殖力强，适应性广，配套利用优势明显等优点，受到国内外很多养殖户的青睐。

利用常用的Trizol裂解法，从180日龄(产蛋高峰期)的狼山鸡公母鸡的下丘脑、肝脏、心脏、胸肌、腓肠肌、腹脂、锁骨下脂肪、皮下脂肪中提取总RNA，以提取的总RNA为模板，按照RT-PCR试剂盒(Takara,Dalian,China)说明书反转录合成cDNA第一链。

如图3所示，一种鸡FASN基因表达荧光定量试剂盒，包括盒体1、衬垫2、SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物3、鸡FASN基因表达的特异性正反向引物4、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物5、dNTP 6、灭菌DEPC水7。

检测方法中FASN荧光定量RT-PCR条件的优化：

(1)引物设计：根据GenBank上登录的鸡FASN和β-actin基因mRNA序列，利用Primer5.0和oligo6.0设计一种采用荧光定量RT-PCR检测狼山鸡FASN基因表达的特异性引物，经过引物筛选与条件优化，最终选择出符合荧光定量PCR反应特点的FASN基因特异性正反向引物F:5’—CCATTGCACCAGCACTACTCA—3’，

R:5’—ACGAGGCTTAGGGTGTGGAA—3’；以及作为内参基因的鸡β-actin基因特异性正反向引物F:5—GTCCACCGCAAATGCTTCTAA—3’，

R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’。

(2)组织RNA的抽提与纯化：从狼山鸡组织中提取总RNA并纯化；

(3)cDNA第一链的合成：以步骤(2)中所提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；

(4)荧光定量real time PCR扩增反应：采用SYBR Green I燃料法，以上述(1)设计的FASN正反向引物和β-actin基因正反向引物和(3)合成的cDNA第一链为模板，在ABI7500fast荧光定量PCR仪上进行。即狼山鸡各组织样本总RNA反转录成cDNA第一链后，分别利用FASN和β-actin基因各自优化好的条件进行real-time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。

荧光定量PCR扩增体系配制如下

real time PCR扩增的反应条件设置如下：

FASN：95℃预变性20-30s,然后40个循环的95℃变性20-30s,退火55-60℃20-30s,最后95℃变性10-15s,60℃1min,95℃10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

β-actin：95℃预变性20s,然后40个循环的95℃变性20-30s,退火56-59℃20-30s,最后95℃变性10-15s,60℃1min,95℃10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

为检测反应的特异性，在real-time反应后，进行溶解曲线分析，以确定得到的产物为目的产物。扩增温度以0.5℃的增幅从60℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。结果显示如图1，FASN和β-actin基因均只有一个特异性峰，溶解温度分别为86℃和81℃。则设计的FASN引物有很好的特异性，可以进行FASN基因定量分析。

狼山鸡FASN在不同组织中差异表达分析

狼山鸡各组织样本经反转录成cDNA第一链后，分别利用FASN和β-actin基因基因各自优化好的条件进行real time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β-actin基因为内参照，对FASN基因mRNA表达水平进行校正，并采用2^-ΔΔCt法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)，以一种组织，比如肝脏ΔCt作为其他组织的参照，计算相对表达量ΔΔCt，ΔΔCt＝(ΔCt(组织)–ΔCt(肝脏)，以此来比较FASN基因相对表达量。结果见图2。

由图2可以看出，FASN基因表达在公母鸡同一组织表达量有一定的差异。母鸡FASN基因在肝脏、胸肌和下丘脑中表达量显著高于公鸡，在其他组织中公母鸡FASN mRNA表达量无显著差异。同时，FASN基因表达具有一定的组织特异性，公鸡FASN基因在下丘脑中表达量显著高于胸肌和腹部脂肪中表达量，在其他组织中表达量差异不显著。母鸡FASN在肝脏中表达量显著高于下丘脑、胸肌、腓肠肌和三种脂肪组织，FASN基因在胸肌、腓肠肌和三种脂肪组织中表达量差异不显著。说明狼山鸡产蛋高峰期肝脏在脂质代谢的脂肪合成过程中发挥重要作用。

本实用新型从实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡FASN基因表达的方法，为研究鸡FASN表达调控以及脂质代谢调控奠定基础，为优质鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值和社会效应。